Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish
Summary
Apresentamos um protocolo eficiente e fácil de usar para a preparação de culturas de células primárias de zebrafish embriões para transfeccao e imagens de células vivas, bem como um protocolo para preparar as células primárias do cérebro adulto zebrafish.
Abstract
Zebrafish embriões são transparentes e desenvolvem rapidamente fora da mãe, permitindo assim excelente na vivo por imagens do processos biológicos dinâmicos em um vertebrado intacto e em desenvolvimento. No entanto, a imagem detalhada das morfologias de tipos distintos de células e estruturas subcelulares é limitada em montagens de toda. Portanto, nós estabelecemos um protocolo eficiente e fácil de usar para as células primárias ao vivo de cultura de embriões de peixe-zebra e tecido adulto.
Em breve, 2 dpf zebrafish embriões são dechorionated, deyolked, esterilizados e dissociado de células únicas com colagenase. Após uma etapa de filtração, as células primárias são banhadas em pratos de vidro inferior e cultivadas por vários dias. Culturas frescas, diferenciada de termo tanto quanto tempo os, podem ser usadas para estudos de imagiologia confocal de alta resolução. A cultura contém diferentes tipos de células, com miócitos estriados e neurônios sendo proeminente no revestimento de poli-L-lisina. Para especificamente rótulo subcellular estruturas por proteínas marcador fluorescente, também estabelecemos um protocolo de eletroporação que permite o transfeccao de Plasmideo DNA em diferentes tipos de células, incluindo neurônios. Assim, na presença do operador definido de estímulos, comportamento complexo celular e dinâmica intracelular de células primárias zebrafish pode ser avaliada com alta resolução espacial e temporal. Além disso, usando o cérebro adulto zebrafish, demonstramos que a técnica de dissociação descrita, bem como as condições básicas de cultivo, também trabalham para tecido adulto zebrafish.
Introduction
O peixe-zebra (Danio rerio, d. rerio) é um modelo popular vertebrado para inúmeros campos de pesquisa básica e biomédico1. Zebrafish embriões se desenvolvem rapidamente ex utero, são transparentes e ajuste sob um microscópio, proporcionando excelentes pré-requisitos para estudar o desenvolvimento de vertebrados em um organismo vivo. Devido a rastreabilidade genética de zebrafish2, foram criadas muitas linhas de repórter transgénicos estável com expressão de tipo específico de célula de vários marcadores fluorescentes permitindo a observação de populações de células específicas. A comunidade de zebrafish oferece uma ampla variedade de chamados linhas Gal4-motorista que carregam um transgene expressando o Kal4TA4 sintético (ou o equivalente de KalTA3-GalFF) gene com o domínio de Gal4-DNA-ligando de levedura fundido a ativação transcricional viral domínios sob o controle dos realçadores de tipo específico de célula. Estas linhas de motorista se cruzam linhas de efetor que carregam transgenes consistindo de uma definido upstream ativando sequência (UAS) fundida a um gene repórter. A proteína Kal4TA4 vincula-se ao elemento UAS, ativando assim a expressão seletiva-tipo de célula do gene repórter3,4. Esta abordagem permite estudos combinatórios altamente diversificados de quase todos os elementos disponíveis enhancer e repórter em animais transgénicos-duplo.
No entanto, imagens ao vivo em profundidade com foco em células individuais ou seus conteúdos subcellular é limitada em um embrião inteiro e constante mudança. Para abordar questões biológicas de célula específica com maior resolução, o uso de culturas de células, muitas vezes é preferível. Existem algumas linhas de célula de zebrafish, mas eles são considerados como altamente selecionado5,6,7 e sua propagação geralmente é demorada. Além disso, todas as linhas de celular disponíveis são fibroblastos derivados, limitando os experimentos utilizando cultura de células de um tipo de células. Portanto, estabelecemos um protocolo eficiente e fácil de usar para preparar as células primárias diretamente do zebrafish embriões e cérebro adulto zebrafish, juntamente com abordagens para aumentar a longevidade da cultura e ampliar a diversidade de cultivo tipos de células. Além disso, apresentamos um procedimento para transfect embrionário as células primárias com construções de expressão para marcadores fluorescentes organela. Assim, estruturas subcelulares e morfologias celulares podem ser analisadas com alta resolução espacial e temporal em tipos de células distintas que retêm suas principais características.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, apresentamos dois protocolos diferentes de cultura primária de células de 2 embriões de zebrafish dpf ou cérebro adulto zebrafish.
A preparação das culturas de célula primária de 2 dpf zebrafish é relativamente fácil de executar para qualquer pessoa com experiência em técnicas de cultura de célula básica. No entanto, para obter resultados reprodutíveis e boas, um número suficiente de embriões como material de partida é crucial (100 é o mínimo). Durante o levantamento …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a T. Fritsch, A. lobo-Asseburg, I. Linde e S.-M. Tokarski para excelentes cuidados com animais e suporte técnico. Agradecemos a todos os membros do laboratório Köster discussões intensas e útil. Reconhecemos com gratidão financiamento pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) e o Estado Federal da Baixa Saxónia, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Fish lines | ||||||
| AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | |||||
| Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | |||||
| Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | |||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Equipment | ||||||
| centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | ||||
| ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | ||||
| confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63 x objective | ||||
| epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40 x objective | ||||
| Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device | |||
| Horizontal shaker | GFL | model 3011 | ||||
| incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | ||||
| incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | ||||
| light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | ||||
| micro pipettes | Gilson | |||||
| sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | ||||
| tweezers | Dumont | Style 5, Inox | ||||
| vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Software | ||||||
| Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | ||||
| ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | ||||
| LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Plasmids | ||||||
| pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene | |||
| Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | ||||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Plastic and glass ware | ||||||
| BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium | |||
| 1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | ||||
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | ||||
| 50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | ||||
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | ||||
| EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation | |||
| electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | ||||
| glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | ||||
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | ||||
| Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | ||||
| Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | ||||
| Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos | |||
| pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | ||||
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | ||||
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | ||||
| sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Chemicals and Reagents | ||||||
| sodium chloride | Roth | 0601.1 | ||||
| 4 % paraformaldehyde in 1 x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | ||||
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | ||||
| calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | ||||
| ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | ||||
| goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | ||||
| HEPES | Roth | 9105.4 | ||||
| high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes | |||
| magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | ||||
| methylene blue | Serva | 29198.01 | ||||
| Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | ||||
| Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | ||||
| poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | ||||
| potasssion chloride | Merck | 104938 | ||||
| Skim milk | Roth | 68514-61-4 | ||||
| Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | ||||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | |||
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | ||||
| Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Enzymes | ||||||
| collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C | |||
| pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Medium and solutions for cell culture | ||||||
| 1 x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | ||||
| glutamine 100 x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| PenStrep (10,000 units/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
Referências
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