Культура и Transfection клетки первичной данио рерио
Summary
Мы представляем эффективной и простой в использовании протокола для подготовки начального клеточных культур данио рерио эмбрионов для transfection и живых клеток, а также протокол для подготовки первичной клетки мозга взрослых рыбок данио.
Abstract
Данио рерио эмбрионов являются прозрачными и быстро развиваются вне матери, что позволяет отлично в vivo визуализации динамических биологических процессов в нетронутыми и развивающихся позвоночных. Однако в целом монтирует ограничено подробных изображений морфологии клеток различных типов и внутриклеточных структур. Таким образом мы создали эффективный и простой в использовании протокола для живых клеток первичной культуре zebrafish эмбриона и взрослых ткани.
Короче говоря 2 dpf zebrafish эмбриона, dechorionated, deyolked, стерилизации и отделить в отдельные ячейки с коллагеназы. После шага фильтрации клетки первичной покрытием на стекла дно блюда и культивировали в течение нескольких дней. Свежих культурах, как долго термин differenciated, может использоваться для высокого разрешения конфокальный изображений исследования. Культура содержит различных типов клеток, с striated миоцитов и нейронов, видные на поли L-лизин покрытие. Чтобы специально внутриклеточных структур label флуоресцентных маркеров белков мы также создали электропорации протокол, который позволяет трансфекции плазмидной ДНК в различных типов клеток, включая нейронов. Таким образом в присутствии оператора определенные стимулы, поведение сложных клеток и внутриклеточных динамики первичных данио рерио клеток может оцениваться с высоким пространственным и временным разрешением. Кроме того с помощью головного мозга взрослых рыбок данио, мы демонстрируем, что описанные диссоциации технику, а также основных условий культивирования, также работать для взрослых рыбок данио ткани.
Introduction
Данио рерио (данио рерио, D. рерио) — популярная модель позвоночных для многочисленных областей фундаментальных и биомедицинских исследований1. Данио рерио эмбрионы быстро развиваться ex внутриутробно, прозрачным, и подходят под микроскопом, таким образом обеспечивая отличные предпосылки для изучения развития позвоночных в живом организме. Из-за генетических уступчивость данио рерио2были созданы многие стабильной репортер трансгенных линий с выражение определенного типа клеток различных флуоресцентных маркеров, что позволяет для наблюдения за конкретными клеточных популяций. Данио рерио сообщество предлагает целый ряд так называемых Gal4-водитель линий, которые несут трансген, выражая синтетических Kal4TA4 (или KalTA3-эквивалент GalFF) гена с доменом Gal4-ДНК связывающих дрожжей сливается с вирусной transcriptional активации домены под контролем усилители определенного типа клеток. Эти линии драйвер пересечены эффекторных линий, которые осуществляют трансгенов, состоящий из определенной последовательности вверх по течению активация (УАС) сливается с Репортер ген. Kal4TA4 протеин связывает к элементу UAS, тем самым активизируя ячейки типа селективный выражение Репортер ген3,4. Этот подход позволяет весьма разнообразных комбинаторной исследований почти всех доступных enhancer и репортер элементов в двойной трансгенных животных.
Однако углубленных живых изображений с упором на отдельные ячейки или их субцеллюлярные содержание ограничено в целом и постоянно меняющейся эмбриона. Для решения биологических вопросов конкретных клеток с высоким разрешением, часто предпочтительнее использование клеточных культур. Существуют некоторые клеточных линий данио рерио, но они считаются сильно выбранных5,6,7 и их распространения часто занимает много времени. Кроме того все доступные клеточных линий являются фибробластов производные, ограничивая эксперименты с использованием культуры клеток к одному типу клеток. Таким образом мы установили эффективный и простой в использовании протокола подготовить Главные ячейки непосредственно из zebrafish эмбриона и взрослых рыбок данио мозга, а также подходы для увеличения продолжительности жизни, культуры и расширения разнообразия культивируемых типы клеток. Кроме того мы представляем процедура transfect эмбриональных клеток первичной с конструкциями выражение для флуоресцентных органеллы маркеров. Таким образом клеточной морфологии и внутриклеточных структур могут быть проанализированы с высоким пространственным и временным разрешением в типах различных клеток, которые сохраняют свои основные характеристики.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем две различные протоколы культуры клетки первичной от 2 dpf zebrafish эмбриона или взрослых рыбок данио мозга.
Подготовка первичного клеточных культур от 2 dpf данио рерио сравнительно легко выполнять для тех, кто с опытом работы в основные клеточные культу?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим т. Фрич, а. волк-Asseburg, I. Linde и с.-М. Токарски отличный уход за животными и технической поддержки. Мы признательны всем членам Köster лаборатории для интенсивной и полезной дискуссии. Мы с благодарностью признаем, финансирование Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) и федеральной земли Нижняя Саксония, Нижнесаксонская Vorab (VWZN2889).
Materials
| Fish lines | ||||||
| AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | |||||
| Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | |||||
| Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | |||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Equipment | ||||||
| centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | ||||
| ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | ||||
| confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63 x objective | ||||
| epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40 x objective | ||||
| Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device | |||
| Horizontal shaker | GFL | model 3011 | ||||
| incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | ||||
| incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | ||||
| light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | ||||
| micro pipettes | Gilson | |||||
| sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | ||||
| tweezers | Dumont | Style 5, Inox | ||||
| vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Software | ||||||
| Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | ||||
| ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | ||||
| LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Plasmids | ||||||
| pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene | |||
| Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | ||||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Plastic and glass ware | ||||||
| BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium | |||
| 1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | ||||
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | ||||
| 50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | ||||
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | ||||
| EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation | |||
| electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | ||||
| glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | ||||
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | ||||
| Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | ||||
| Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | ||||
| Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos | |||
| pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | ||||
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | ||||
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | ||||
| sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Chemicals and Reagents | ||||||
| sodium chloride | Roth | 0601.1 | ||||
| 4 % paraformaldehyde in 1 x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | ||||
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | ||||
| calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | ||||
| ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | ||||
| goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | ||||
| HEPES | Roth | 9105.4 | ||||
| high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes | |||
| magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | ||||
| methylene blue | Serva | 29198.01 | ||||
| Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | ||||
| Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | ||||
| poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | ||||
| potasssion chloride | Merck | 104938 | ||||
| Skim milk | Roth | 68514-61-4 | ||||
| Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | ||||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | |||
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | ||||
| Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Enzymes | ||||||
| collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C | |||
| pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Medium and solutions for cell culture | ||||||
| 1 x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | ||||
| glutamine 100 x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| PenStrep (10,000 units/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
Referências
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends in Cell Biology. 23, 584-586 (2013).
- Sassen, W. A., Köster, R. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. , 151 (2015).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80, 153-158 (1999).
- Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Biologia do Desenvolvimento. 233, 329-346 (2001).
- Driever, W., Rangini, Z. Characterization of a cell line derived from zebrafish (Brachydanio rerio) embryos. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 29A, 749-754 (1993).
- Badakov, R., Jaźwińska, A. Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection. Cytotechnology. 51, 105-110 (2006).
- Senghaas, N., Köster, R. W. Culturing and transfecting zebrafish PAC2 fibroblast cells. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017)
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes & Development. 8, 1311-1323 (1994).
- Piperno, G., Fuller, M. T. Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of alpha-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2085-2094 (1985).
- Barden, J. A., Miki, M., Hambly, B. D., Dos Remedios, C. G. Localization of the phalloidin and nucleotide-binding sites on actin. European Journal of Biochemistry. 162 (3), 583-588 (1987).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, E1717 (2010).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Stornaiuolo, M. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).
- Lithgow, T. Targeting of proteins to mitochondria. FEBS Letters. 476, 22-26 (2000).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).
- Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging. Biologia do Desenvolvimento. 430, 18-31 (2017).
- Horesh, D., et al. Doublecortin, a stabilizer of microtubules. Human Molecular Genetics. 8, 1599-1610 (1999).
- Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22, 1567-1572 (2004).
- Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).
- Matsuda, T., Miyawaki, A., Nagai, T. Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein. Nature Methods. 5, 339-345 (2008).
- Archer, B. T., Ozçelik, T., Jahn, R., Francke, U., Südhof, T. C. Structures and chromosomal localizations of two human genes encoding synaptobrevins 1 and 2. Journal of Biological Chemistry. 265, 17267-17273 (1990).
- Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10, 407-409 (2013).
- Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 7877-7882 (2002).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133, 916-927 (2008).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, 5069-5079 (2005).
- Jusuf, P. R., Harris, W. A. Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina. Neural Development. 4, 34 (2009).
- Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Biologia do Desenvolvimento. 343, 1-17 (2010).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).
- Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors. Zebrafish. 10, 316-332 (2013).
