Cultuur en de transfectie van zebravis primaire cellen
Summary
Presenteren we een efficiënt en gemakkelijk te gebruiken protocol voor het voorbereiden van primaire celculturen van zebravis embryo’s voor transfectie en levende cel imaging, evenals een protocol bij het bereiden van primaire cellen van volwassen zebrafish hersenen.
Abstract
Zebravis embryo’s transparant zijn en snel te ontwikkelen buiten de moeder, waardoor voor uitstekende in vivo imaging van dynamische biologische processen in een gewerveld dier intact en de ontwikkelingslanden. De gedetailleerde beeldvorming van de morphologies van verschillende celtypes en subcellular structuren wordt echter beperkt in hele mounts. Daarom opgericht wij een efficiënte en easy-to-use protocol om cultuur levende primaire cellen van zebravis embryo’s en volwassen weefsel.
2 dpf zebrafish embryo’s zijn in het kort, dechorionated, deyolked, gesteriliseerd, en losgekoppeld op enkele cellen met collagenase. Na een filtratie stap, zijn primaire cellen vergulde op glazen bodem gerechten en geteeld voor meerdere dagen. Verse culturen, zo veel als lange termijn differenciated ones, kunnen worden gebruikt voor hoge resolutie confocal imaging studies. De cultuur bevat verschillende soorten cellen, met gegroefde myocytes en neuronen worden prominente op poly-L-lysine coating. Wij vastgesteld tot een specifiek label subcellular structuur door fluorescerende marker eiwitten een electroporation protocol waarmee de transfectie van plasmide DNA in verschillende soorten cellen, met inbegrip van neuronen. Dus, in aanwezigheid van de exploitant gedefinieerd prikkels, het gedrag van de complexe cel en intracellulaire dynamiek van primaire zebrafish cellen kan worden beoordeeld met hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Bovendien, met behulp van volwassen zebrafish hersenen, we laten zien dat de techniek beschreven dissociatie, evenals de basisvoorwaarden kweken, ook voor volwassen zebrafish weefsel werken.
Introduction
De zebrafish (Danio rerio, D. rerio) is een populair model gewervelde voor tal van gebieden van fundamenteel en biomedisch onderzoek1. Zebravis embryo’s ontwikkelen snel ex utero, transparant, en fit onder een Microscoop, waardoor uitstekende voorwaarden voor het bestuderen van gewervelde ontwikkeling in een levend organisme. Als gevolg van de genetische werkwillig van zebravis2, zijn veel stabiele transgene verslaggever regels met cell type-specifieke uitdrukking van verschillende fluorescente markeringen vastgesteld rekening houdend met de waarneming van specifieke cel populaties. De zebravis Gemeenschap biedt een breed scala van zogenaamde Gal4-driver regels waaraan een uiting van de synthetische Kal4TA4 (of de GalFF van het KalTA3-equivalent) transgenic gen met het Gal4-DNA-bindende domein van gist gesmolten virale transcriptionele activering domeinen onder de controle van cel type-specifieke versterkers. Deze bestuurder lijnen zijn overgestoken naar effector lijnen waaraan transgenen dat bestaat uit een gedefinieerde upstream activerend reeks (UAS) gesmolten tot een verslaggever-gen. De Kal4TA4 proteïne bindt aan de UAS-element, dus het activeren van de cel type-selectieve uitdrukking van de verslaggever gen3,4. Deze aanpak zorgt voor zeer uiteenlopende combinatorische studies van bijna alle beschikbare enhancer en verslaggever elementen in dubbel-transgene dieren.
Diepgaande live beeldbewerking met focus op afzonderlijke cellen of hun subcellular inhoud wordt echter beperkt in een geheel en voortdurend veranderende embryo. Om aan te pakken bepaalde cel biologische vragen met de hoogste resolutie, is het gebruik van celculturen handiger. Sommige cellijnen van zebravis bestaan, maar ze worden beschouwd als zwaar geselecteerde5,6,7 en hun voortplanting is vaak tijdrovend. Bovendien zijn alle beschikbare cellijnen fibroblast afgeleid, experimenten met behulp van celkweek voor één soort cellen te beperken. Dus vastgesteld we beide een efficiënte en easy-to-use protocol ter voorbereiding van primaire cellen rechtstreeks vanuit de zebravis embryo’s en volwassen zebrafish hersenen, samen met benaderingen te verhogen de levensduur van de cultuur en aan het verbreden van de diversiteit van de gecultiveerde celtypes. Daarnaast presenteren wij een procedure om te transfect van embryonale primaire cellen met expressie constructies voor fluorescerende organel markeringen. Dus, cellulaire morphologies en subcellular structuren kunnen worden geanalyseerd met hoge ruimtelijke en temporele resolutie in verschillende celtypen, die hun belangrijkste functies te behouden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we twee verschillende protocollen cultuur primaire cellen uit 2 dpf zebrafish embryo’s of volwassen zebrafish hersenen.
De bereiding van primaire celculturen van 2 dpf zebrafish is relatief eenvoudig voor iemand met ervaring in fundamentele cel cultuur technieken uit te voeren. Echter, met het oog op een goede en reproduceerbare resultaten, een voldoende aantal embryo’s als grondstof is belangrijk (100 is het minimum). Tijdens het verhogen van de embryo’s, moeten alle mogelijk…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken T. Fritsch, A. Wolf-Asseburgu, I. Linde en S.-M. Tokarski voor de uitstekende verzorging van de dieren en technische ondersteuning. We zijn dankbaar voor alle leden van de Köster lab voor intense en nuttige discussies. Wij erkennen dankbaar steun van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) en de federale staat van Neder-Saksen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Fish lines | ||||||
| AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | |||||
| Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | |||||
| Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | |||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Equipment | ||||||
| centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | ||||
| ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | ||||
| confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63 x objective | ||||
| epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40 x objective | ||||
| Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device | |||
| Horizontal shaker | GFL | model 3011 | ||||
| incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | ||||
| incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | ||||
| light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | ||||
| micro pipettes | Gilson | |||||
| sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | ||||
| tweezers | Dumont | Style 5, Inox | ||||
| vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Software | ||||||
| Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | ||||
| ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | ||||
| LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Plasmids | ||||||
| pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
| pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene | |||
| Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | ||||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Plastic and glass ware | ||||||
| BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium | |||
| 1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | ||||
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | ||||
| 50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | ||||
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | ||||
| EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation | |||
| electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | ||||
| glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | ||||
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | ||||
| Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | ||||
| Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | ||||
| Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos | |||
| pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | ||||
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | ||||
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | ||||
| sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Chemicals and Reagents | ||||||
| sodium chloride | Roth | 0601.1 | ||||
| 4 % paraformaldehyde in 1 x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | ||||
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | ||||
| calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | ||||
| ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | ||||
| goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | ||||
| HEPES | Roth | 9105.4 | ||||
| high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes | |||
| magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | ||||
| methylene blue | Serva | 29198.01 | ||||
| Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | ||||
| Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | ||||
| poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | ||||
| potasssion chloride | Merck | 104938 | ||||
| Skim milk | Roth | 68514-61-4 | ||||
| Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | ||||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | |||
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | ||||
| Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | ||||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Enzymes | ||||||
| collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C | |||
| pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
| Medium and solutions for cell culture | ||||||
| 1 x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | ||||
| glutamine 100 x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
| PenStrep (10,000 units/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
Referências
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends in Cell Biology. 23, 584-586 (2013).
- Sassen, W. A., Köster, R. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. , 151 (2015).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80, 153-158 (1999).
- Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Biologia do Desenvolvimento. 233, 329-346 (2001).
- Driever, W., Rangini, Z. Characterization of a cell line derived from zebrafish (Brachydanio rerio) embryos. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 29A, 749-754 (1993).
- Badakov, R., Jaźwińska, A. Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection. Cytotechnology. 51, 105-110 (2006).
- Senghaas, N., Köster, R. W. Culturing and transfecting zebrafish PAC2 fibroblast cells. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017)
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes & Development. 8, 1311-1323 (1994).
- Piperno, G., Fuller, M. T. Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of alpha-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2085-2094 (1985).
- Barden, J. A., Miki, M., Hambly, B. D., Dos Remedios, C. G. Localization of the phalloidin and nucleotide-binding sites on actin. European Journal of Biochemistry. 162 (3), 583-588 (1987).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, E1717 (2010).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Stornaiuolo, M. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).
- Lithgow, T. Targeting of proteins to mitochondria. FEBS Letters. 476, 22-26 (2000).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).
- Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging. Biologia do Desenvolvimento. 430, 18-31 (2017).
- Horesh, D., et al. Doublecortin, a stabilizer of microtubules. Human Molecular Genetics. 8, 1599-1610 (1999).
- Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22, 1567-1572 (2004).
- Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).
- Matsuda, T., Miyawaki, A., Nagai, T. Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein. Nature Methods. 5, 339-345 (2008).
- Archer, B. T., Ozçelik, T., Jahn, R., Francke, U., Südhof, T. C. Structures and chromosomal localizations of two human genes encoding synaptobrevins 1 and 2. Journal of Biological Chemistry. 265, 17267-17273 (1990).
- Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10, 407-409 (2013).
- Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 7877-7882 (2002).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133, 916-927 (2008).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, 5069-5079 (2005).
- Jusuf, P. R., Harris, W. A. Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina. Neural Development. 4, 34 (2009).
- Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Biologia do Desenvolvimento. 343, 1-17 (2010).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).
- Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors. Zebrafish. 10, 316-332 (2013).
