문화와 Zebrafish 기본 세포의 Transfection

Summary

선물이 zebrafish 태아 transfection 라이브 셀 이미징 뿐만 아니라 성인 zebrafish 두뇌에서 1 차 셀을 준비 하는 프로토콜의 기본 셀 문화를 준비 하기 위한 효율적이 고 사용 하기 쉬운 프로토콜.

Abstract

Zebrafish 태아 투명 하 고 그대로 고 발전 등뼈 동물에서 동적 생물 학적 과정의 우수한 vivo에서 이미징 되므로 어머니 밖에 서 급속 하 게 개발 합니다. 그러나, 명료한 세포 유형 및 subcellular 구조의 형태학의 상세한 영상 전체 마운트에 제한 됩니다. 따라서, 우리 zebrafish 태아와 성인 조직 문화 라이브 1 차 셀을 효율적이 고 사용 하기 쉬운 프로토콜 설립.

간단 하 게, 2 dpf zebrafish 태아는 dechorionated, deyolked, 살 균, 그리고 콜라와 함께 단일 셀에 해리. 여과 단계 후 1 차 셀 유리 하단 요리에 도금 하 고 몇 일 동안 경작. 신선한 문화로 긴 기간 differenciated, 높은 해상도 confocal 이미징 연구에 사용할 수 있습니다. 문화 전기 myocytes와 폴 리-L-리 신 코팅에 저명한 되 고 신경 다른 셀 형식을 포함 합니다. 특히 라벨 subcellular 구조에 형광 마커 단백질에 의해, 우리는 또한 electroporation 프로토콜 뉴런을 포함 하 여 다른 세포 유형으로 플라스 미드 DNA의 transfection 수 있는 설립. 따라서, 연산자의 정의 된 자극, 복잡 한 셀 동작, 그리고 기본 zebrafish 세포의 세포내 역학 수 부과 높은 공간과 시간 해상도. 또한, 성인 zebrafish 두뇌를 사용 하 여 기본 자란 조건 뿐 아니라 설명된 분리 기술, 또한 성인 zebrafish 조직에 대 한 작업 설명 합니다.

Introduction

제 브라 (Danio rerio, D. rerio) 수많은 분야 기본 및 생물 의학 연구¹의 척 추가 있는 인기 모델 이다. Zebrafish 태아 utero 전빠르게 개발, 투명 한, 그리고 따라서 살아있는 유기 체에서 척추 개발을 공부 하 고 우수한 필수 구성 요소를 제공 하는 현미경 적합. Zebrafish²의 유전자 추적성 인해 많은 안정적인 유전자 변형 기자 라인 셀 형식 관련 표현의 다양 한 형광 마커 특정 세포 인구의 관찰에 대 한 수 있도록 설립 되었습니다. Zebrafish 커뮤니티 제공 합성 Kal4TA4 (또는 KalTA3에 해당 GalFF) 표현 transgene 수행 소위 Gal4 드라이버 라인의 광범위 한 다양 한 바이러스 transcriptional 활성화 융합 유전자 효 Gal4 DNA 바인딩 도메인 셀 형식 관련 증강의 통제 도메인. 이러한 드라이버 라인 수행 transgenes는 정의 된 상류 활성화 순서 (UAS) 리포터 유전자를 융합의 구성 된 이펙터 라인을 넘어 있다. Kal4TA4 단백질에 따라서 기자 유전자^3,4의 셀 형식 선택적 식 활성화 UAS 요소에 바인딩합니다. 이 방법은 거의 모든 사용 가능한 증강 및 기자 요소 이중 유전자 변형 동물의 매우 다양 한 조합 연구에 대 한 수 있습니다.

그러나 개별 셀 또는 그들의 subcellular 내용을 초점 깊이 있는 라이브 영상 전체 하 고 끊임없이 변화 배아에 제한 됩니다. 높은 해상도와 특정 세포 생물학 질문을 해결 하기 위해 세포 배양의 사용은 종종 바람직. Zebrafish의 일부 셀 라인, 하지만 그들은 무 겁 게으로 선택한^5,,67 여겨진다 하 그들의 전파는 종종 시간이 걸리는. 또한, 모든 사용 가능한 셀 라인은 구와 파생, 실험 세포 배양을 사용 하 여 셀의 한 종류에 제한. 따라서 우리 모두는 효율적이 고 사용 하기 쉬운 프로토콜 zebrafish 태아 및 접근 문화의 장 수를 증가 하 고 재배의 다양성을 확대 하기 위해 함께 성인 zebrafish 뇌에서 직접 1 차 셀을 준비 하는 설립 셀 유형입니다. 또한, 선물이 형광 세포 기관이 표식에 대 한 식 구문 가진 배아 1 차 셀 transfect에 절차. 따라서, 세포 형태학 및 subcellular 구조 공간 및 시간에서 고해상도 그들의 주요 기능을 유지 하는 다른 세포 유형으로 분석할 수 있습니다.

Protocol

여기에 설명 된 모든 동물 작업은 법적 규정 (EU-지침 2010/63). 유지 보수 및 물고기의 처리 확정 된 지방 자치 단체 및 동물 복지의 브라운슈바이크 공대와 낮은 색 소니 국가 사무실의 소비자 보호 및 식품 안전 (LAVES, 올덴부르크, 독일; 아리조나 §4 (02.05) TSchB TU 학사). 1. 1 차 셀 Zebrafish 태아에서의 준비 2 일의 준비 게시물 수정 (dpf) zebrafish 태아 주 1: …

Representative Results

그림 1G紋 myocytes 및 신경 같은 입자로 가장 풍부한의 클러스터 야생 타입 배아에서 파생 된 일반적인 문화의 전송된 빛 이미지를 보여줍니다. 더 쉽게 특정 세포 유형 식별, 유전자 변형 라인 형광 단백질의 세포 유형 특정 식이 될 수 있습니다 (그림 1 H)을 사용. PCS2 +의 transfection-플?…

Discussion

여기, 우리의 현재 두 개의 서로 다른 프로토콜 문화 1 차 셀 2 dpf zebrafish 태아 또는 성인 zebrafish 두뇌에서.

1 차 셀 문화 2 dpf zebrafish에서 준비 기본 셀 문화 기술에 경험을 가진 사람에 대 한 수행 상대적으로 쉽습니다. 그러나, 좋은 하 고 재현 가능한 결과 얻으려면 시작 물자로 배아의 충분 한 수는 중요 한 (100은 최소). 배아의 발생 하는 동안 모든 가능한 소스 오염 세균과 기…

Materials

Fish lines
AB (wild-type)			established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC)
Tg(ptf1a:eGFP)jh1			stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007)
Tg(XITubb:DsRed)zf148			stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed  (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
centrifuge	Eppendorf		model 5804 R
ChemiDoc MP imaging system	BioRad		model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos
confocal laser scanning microscope	Leica microsystems		model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63 x objective
epifluorescent microscope	Leica microsystems		model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40 x objective
Gene Pulser Xcell with capacitance extender	BioRad	1652661	electroporation device
Horizontal shaker	GFL		model 3011
incubator for cell culture (28 °C)	Memmert		model incubator I
incubator for embryos (28 °C)	Heraeus		type B6120
light microscope	Zeiss		model TELAVAL 31
micro pipettes	Gilson
sterile work bench	Bio Base		with laminar flow and UV light
tweezers	Dumont		Style 5, Inox
vertical tube rotator	Labinco B.V.		model LD-79
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Image Lab Software	BioRad		for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad
ImageJ	National Institutes of Health		used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016).
LAS X	Leica Microsystems		for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
pCS-DCX-tdTomato	Köster Lab	# 1599	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-eGFP	Köster Lab	# 7	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-H2B-mseCFP	Köster Lab	# 2379	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-mClover	Köster Lab	# 3865	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-MitoTag-YFP	Köster Lab	# 2199	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-ss-RFP-KDEL	Köster Lab	# 4330	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-VAMP1-mCitrine	Köster Lab	# 2291	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pSK-UAS:mCherry	Köster Lab	# 1062	based on the pBluescript-backbone of Stratagene
Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic and glass ware
BD Falcon Cell Strainer (40 µm)	FALCON	REF 352340	distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium
1.5 mL reaction tubes	Sarstedt	72690550
24-well plate	Sarstedt	83.3922
50 mL falconic tube	Sarstedt	62.547.004
96-well plate	Sarstedt	83.3924.005
EasyStrainer (40 µm)	Greiner Bio-One	542 040	with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation
electroporation cuvette (0.4 cm)	Kisker	4905022
glass coverslips	Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH	1051201
Microscope slides	Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser)	631-0845
Neubauer chamber	Henneberg-Sander GmbH	9020-01
Pasteur pipettes (plastic; 3 mL)	A. Hartenstein	PP05
Petri dishes (plastic; diameter 10 cm)	Sarstedt	821473	for zebrafish embryos
pipette tips	Sarstedt	Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm)	TPP Techno Plastic Products AG	93040
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm)	Sarstedt	72690550
sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm)	Sarstedt	83.3902	for brain dissection
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals and Reagents
sodium chloride	Roth	0601.1
4 % paraformaldehyde in 1 x PBS	Sigma-Aldrich	16005
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
calcium nitrate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	C1396
ethanol p.a. 100%	Sigma-Aldrich	46139
goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated	Thermo Fisher Scientific	31547
HEPES	Roth	9105.4
high vacuum grease	DOW CORNING	3826-50	silicon grease used for self-made glass bottom dishes
magnesium sulfate heptahydrate	Merck	105886
methylene blue	Serva	29198.01
Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody	Sigma-Aldrich	T6793
Aqua-Poly/Mount (mounting medium)	Polyscience	18606
poly-L-lysine	Biochrom	L 7240
potasssion chloride	Merck	104938
Skim milk	Roth	68514-61-4
Texas Red-X Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	T7471
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521	Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate
Triton X-100	BioRad	1610407
Trypan Blue	Gibco by Life Technologies	15250061
Name	Company	Catalog Number	Comments
Enzymes
collagenase (Type 2)	Thermo Fisher Scientific	17101015	dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C
pronase (from Streptomyces griseus)	Roche	11459643001	distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium and solutions for cell culture
1 x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)	Gibco by Life Technologies	14190-169	distributed by Thermo Fisher Scientific
CO2-independent medium	Gibco by Life Technologies	18045054	distributed by Thermo Fisher Scientific
filtrated bovine serum (FBS)	PAN-Biotech		individual batch
glutamine 100 x	Gibco by Life Technologies	25030081	distributed by Thermo Fisher Scientific
Leibovitz's L-15 medium	Gibco by Life Technologies	11415049	distributed by Thermo Fisher Scientific
PenStrep (10,000 units/mL)	Gibco by Life Technologies	15140148	distributed by Thermo Fisher Scientific