선물이 zebrafish 태아 transfection 라이브 셀 이미징 뿐만 아니라 성인 zebrafish 두뇌에서 1 차 셀을 준비 하는 프로토콜의 기본 셀 문화를 준비 하기 위한 효율적이 고 사용 하기 쉬운 프로토콜.
Zebrafish 태아 투명 하 고 그대로 고 발전 등뼈 동물에서 동적 생물 학적 과정의 우수한 vivo에서 이미징 되므로 어머니 밖에 서 급속 하 게 개발 합니다. 그러나, 명료한 세포 유형 및 subcellular 구조의 형태학의 상세한 영상 전체 마운트에 제한 됩니다. 따라서, 우리 zebrafish 태아와 성인 조직 문화 라이브 1 차 셀을 효율적이 고 사용 하기 쉬운 프로토콜 설립.
간단 하 게, 2 dpf zebrafish 태아는 dechorionated, deyolked, 살 균, 그리고 콜라와 함께 단일 셀에 해리. 여과 단계 후 1 차 셀 유리 하단 요리에 도금 하 고 몇 일 동안 경작. 신선한 문화로 긴 기간 differenciated, 높은 해상도 confocal 이미징 연구에 사용할 수 있습니다. 문화 전기 myocytes와 폴 리-L-리 신 코팅에 저명한 되 고 신경 다른 셀 형식을 포함 합니다. 특히 라벨 subcellular 구조에 형광 마커 단백질에 의해, 우리는 또한 electroporation 프로토콜 뉴런을 포함 하 여 다른 세포 유형으로 플라스 미드 DNA의 transfection 수 있는 설립. 따라서, 연산자의 정의 된 자극, 복잡 한 셀 동작, 그리고 기본 zebrafish 세포의 세포내 역학 수 부과 높은 공간과 시간 해상도. 또한, 성인 zebrafish 두뇌를 사용 하 여 기본 자란 조건 뿐 아니라 설명된 분리 기술, 또한 성인 zebrafish 조직에 대 한 작업 설명 합니다.
제 브라 (Danio rerio, D. rerio) 수많은 분야 기본 및 생물 의학 연구1의 척 추가 있는 인기 모델 이다. Zebrafish 태아 utero 전빠르게 개발, 투명 한, 그리고 따라서 살아있는 유기 체에서 척추 개발을 공부 하 고 우수한 필수 구성 요소를 제공 하는 현미경 적합. Zebrafish2의 유전자 추적성 인해 많은 안정적인 유전자 변형 기자 라인 셀 형식 관련 표현의 다양 한 형광 마커 특정 세포 인구의 관찰에 대 한 수 있도록 설립 되었습니다. Zebrafish 커뮤니티 제공 합성 Kal4TA4 (또는 KalTA3에 해당 GalFF) 표현 transgene 수행 소위 Gal4 드라이버 라인의 광범위 한 다양 한 바이러스 transcriptional 활성화 융합 유전자 효 Gal4 DNA 바인딩 도메인 셀 형식 관련 증강의 통제 도메인. 이러한 드라이버 라인 수행 transgenes는 정의 된 상류 활성화 순서 (UAS) 리포터 유전자를 융합의 구성 된 이펙터 라인을 넘어 있다. Kal4TA4 단백질에 따라서 기자 유전자3,4의 셀 형식 선택적 식 활성화 UAS 요소에 바인딩합니다. 이 방법은 거의 모든 사용 가능한 증강 및 기자 요소 이중 유전자 변형 동물의 매우 다양 한 조합 연구에 대 한 수 있습니다.
그러나 개별 셀 또는 그들의 subcellular 내용을 초점 깊이 있는 라이브 영상 전체 하 고 끊임없이 변화 배아에 제한 됩니다. 높은 해상도와 특정 세포 생물학 질문을 해결 하기 위해 세포 배양의 사용은 종종 바람직. Zebrafish의 일부 셀 라인, 하지만 그들은 무 겁 게으로 선택한5,,67 여겨진다 하 그들의 전파는 종종 시간이 걸리는. 또한, 모든 사용 가능한 셀 라인은 구와 파생, 실험 세포 배양을 사용 하 여 셀의 한 종류에 제한. 따라서 우리 모두는 효율적이 고 사용 하기 쉬운 프로토콜 zebrafish 태아 및 접근 문화의 장 수를 증가 하 고 재배의 다양성을 확대 하기 위해 함께 성인 zebrafish 뇌에서 직접 1 차 셀을 준비 하는 설립 셀 유형입니다. 또한, 선물이 형광 세포 기관이 표식에 대 한 식 구문 가진 배아 1 차 셀 transfect에 절차. 따라서, 세포 형태학 및 subcellular 구조 공간 및 시간에서 고해상도 그들의 주요 기능을 유지 하는 다른 세포 유형으로 분석할 수 있습니다.
여기, 우리의 현재 두 개의 서로 다른 프로토콜 문화 1 차 셀 2 dpf zebrafish 태아 또는 성인 zebrafish 두뇌에서.
1 차 셀 문화 2 dpf zebrafish에서 준비 기본 셀 문화 기술에 경험을 가진 사람에 대 한 수행 상대적으로 쉽습니다. 그러나, 좋은 하 고 재현 가능한 결과 얻으려면 시작 물자로 배아의 충분 한 수는 중요 한 (100은 최소). 배아의 발생 하는 동안 모든 가능한 소스 오염 세균과 기…
The authors have nothing to disclose.
우리 감사 합니다 T. Fritsch, A. 늑대-Asseburg, I. Linde와 미-M. 우수 동물 관리 및 기술 지원에 대 한 Tokarski입니다. 우리는 강렬 하 고 유용한 토론에 대 한 Köster 연구소의 모든 구성원에 게 감사입니다. 우리는 기꺼이 도이치 가운데 (코 1949/5-1)와 Niedersächsisches Vorab (VWZN2889) 저 색 소니의 연방 정부에 의해 자금을 인정 합니다.
Fish lines | ||||||
AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | |||||
Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | |||||
Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | |||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Equipment | ||||||
centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | ||||
ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | ||||
confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63 x objective | ||||
epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40 x objective | ||||
Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device | |||
Horizontal shaker | GFL | model 3011 | ||||
incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | ||||
incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | ||||
light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | ||||
micro pipettes | Gilson | |||||
sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | ||||
tweezers | Dumont | Style 5, Inox | ||||
vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | ||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Software | ||||||
Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | ||||
ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | ||||
LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | ||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Plasmids | ||||||
pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene | |||
Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | ||||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Plastic and glass ware | ||||||
BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium | |||
1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | ||||
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | ||||
50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | ||||
96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | ||||
EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation | |||
electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | ||||
glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | ||||
Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | ||||
Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | ||||
Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | ||||
Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos | |||
pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | ||||
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | ||||
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | ||||
sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Chemicals and Reagents | ||||||
sodium chloride | Roth | 0601.1 | ||||
4 % paraformaldehyde in 1 x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | ||||
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | ||||
calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | ||||
ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | ||||
goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | ||||
HEPES | Roth | 9105.4 | ||||
high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes | |||
magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | ||||
methylene blue | Serva | 29198.01 | ||||
Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | ||||
Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | ||||
poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | ||||
potasssion chloride | Merck | 104938 | ||||
Skim milk | Roth | 68514-61-4 | ||||
Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | ||||
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | |||
Triton X-100 | BioRad | 1610407 | ||||
Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | ||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Enzymes | ||||||
collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C | |||
pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Medium and solutions for cell culture | ||||||
1 x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | ||||
glutamine 100 x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
PenStrep (10,000 units/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |