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Cancer Research

Potenziamento dell'efficacia dell'anticorpo antitumorale di farmaci antineoplastici: rilevazione dell'anticorpo-farmaco sinergismo usando l'equazione di indice di combinazione

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58291
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, *1, *1,3, *1,3
1Centre de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes Angers (CRCINA), Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université d'Angers, Université de Nantes, Nantes, France, 2Service de chirurgie pédiatrique, Centre hospitalier universitaire (CHU) de Nantes, Nantes, France, 3Unité de Formation et Recherche (UFR) des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université de Nantes, Nantes, France
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo descrive come valutare il sinergismo fra un anticorpo antitumorale e farmaci antineoplastici in modelli preclinici utilizzando l'equazione di indice di combinazione di Chou e Talalay.

Abstract

Potenziamento di ostili gli anticorpi monoclonali (mAb) dagli agenti chemioterapeutici costituisce una strategia importante per la progettazione di una terapia efficace e più sicura contro il cancro. Qui forniamo un protocollo per identificare una combinazione razionale nella fase preclinica. In primo luogo, descriviamo un test per valutare il sinergismo tra mAb anticancro e farmaci citotossici, che utilizza l'equazione di indice di combinazione di Chou e Talalay1cella. Questo include la misurazione della sensibilità del tumore delle cellule farmaco - e anticorpo-usando un'analisi MTT, seguita da un'analisi di computer automatici per calcolare i valori di indice (CI) di combinazione. CI valori di < 1 indicare sinergismo tra testata mAbs e agenti citotossici1. Per corroborare l'in vitro risultati in vivo, ulteriormente Descriviamo un metodo per valutare l'efficacia del regime di combinazione in un modello di xenotrapianto del tumore. In questo modello, il regime combinato ritarda significativamente la crescita del tumore, che si traduce in un significativo di sopravvivenza esteso rispetto ai comandi del singolo-agente. D'importanza, la sperimentazione in vivo rivela che il regime di combinazione è ben tollerato. Questo protocollo permette la valutazione efficace di combinazioni di farmaci anticancro in modelli preclinici e l'identificazione della combinazione razionale per valutare in studi clinici.

Introduction

L'approccio convenzionale nel trattamento di un gran numero di diversi tipi di cancro si basava sul monotherapy. Anche se è ancora usato in molti casi, questo metodo ha incontrato diversi ostacoli che conduce a optare per terapie combinate2. In particolare, le cellule tumorali sono più suscettibili a sviluppare resistenza quando trattati con un farmaco singolo inducendo sopravvivenza alternativo meccanismi3, con conseguente fallimento terapeutico in pazienti4. Inoltre, in monoterapia, farmaci sono solitamente somministrati a dosi elevate. Questa situazione spesso provoca il verificarsi di forti effetti collaterali dose-dipendente che può essere intollerabile e imporre ai medici di interrompere il trattamento2. Per questi motivi, l'associazione di molecole antitumorali è ora preferito alla monoterapia.

Combinazioni di farmaci ideale sarebbero quelli che agiscono in sinergia contro le cellule del tumore, senza tossicità aumentata contro le cellule normali. Sinergismo si riferisce all'interazione di due o più farmaci che produce un effetto terapeutico maggiore della somma di ogni singola sostanza operano separatamente. Tali interazioni possono provocare una maggiore efficacia terapeutica clinica2. Limita la resistenza al trattamento, aumenta l'efficacia e può anche ridurre la tossicità2. Infatti, il dosaggio di ogni farmaco può essere ridotto per abbassare i loro effetti collaterali mirando alle vie differenti. Inoltre, una delle molecole può anche servire come un agente di sensibilizzazione contro le cellule tumorali. L'effetto del farmaco secondo può essere migliorata sulle cellule sensibilizzate e dosaggi meno possono essere usato5.

Terapia combinata può includere due o più farmaci chemioterapici e/o prodotti biologici, come gli anticorpi monoclonali6. Questi anticorpi monoclonali specificamente le cellule che esprimono un antigene di superficie delle cellule di interesse e sono in grado di uccidere le cellule tumorali attraverso vie immunologiche compreso citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC), con il coinvolgimento di cellule immunitarie effettrici 7e citotossicità complemento-dipendente (CDC)6. Essi possono anche agire tramite un meccanismo non immunologico mediato da apoptosi8,9,10,11. In questo caso, l'induzione del processo di morte programmata delle cellule può sensibilizzare le cellule tumorali, indebolire la loro funzione e rendere più efficace il farmaco chemioterapico associato ad un dosaggio più basso. Come tale, proapoptotic mAb sono buoni candidati per la progettazione di regimi di combinazione con farmaci antineoplastici.

Sono stati descritti diversi modelli matematici per valutare il sinergismo della droga; uno di loro si basa sulla combinazione indice metodo1. Questo metodo si basa sul principio di effetto mediano sviluppato da Chou1. L'effetto mediano equazione correla la dose di farmaco e l'effetto della droga come segue.

Equation 1

Qui, D è la dose di droga; DM è la dose mediana-effetto; Fa è la frazione influenzata dalla dose; m è un esponente che indica la forma della dose-effetto trama1. La dose mediana-effetto viene utilizzata per calcolare la dose Dx di un farmaco che inibisce o uccide "x" per cento delle cellule. Il valore CI viene quindi calcolato per valutare l'effetto additivo della combinazione del farmaco, come segue1.

Equation 2

CI il valore 1 indica un effetto additivo e un valore di CI di < 1 indica un effetto sinergico, mentre un valore di CI di > 1 indica antagonismo1. L'applicazione di questo metodo è ulteriormente facilitato dalla disponibilità di un programma per computer, CompuSyn, che determina sinergismo ed antagonismo a tutte le dosi o livelli di effetto simulato automaticamente12.

Il nostro gruppo ha sviluppato la specifica di 8B6 mAb per O-acetile-GD2 ganglioside (OAcGD2) di neuroblastoma antigene13 e ulteriormente dimostrato che questa mAb è in grado di indurre la morte delle cellule con gli attributi di apoptosi11. Per verificare se mAb 8B6 può sensibilizzare le cellule di neuroblastoma per il topotecan agente antineoplastico, abbiamo adattato il suddetto metodo sviluppato da Chou1. In primo luogo, determiniamo i valori (ED50) 50 di dose efficace di mAb 8B6 e topotecan. Successivamente, le cellule di neuroblastoma con rapporti di uguale potenza dei due composti in base ai valori di50 ED esposte per determinare i valori di CI utilizzando il software di simulazione di cui sopra. Questo metodo permette di dimostrare il sinergismo fra mAb 8B6 e topotecan in vitro. Successivamente, descriviamo un protocollo per valutare ulteriormente la potenza e la sicurezza di questa combinazione regime in vivo. Questo protocollo può essere facilmente applicato per selezionare mAb anticancro potente e sicuro e combinazioni dell'agente chemioterapeutico negli studi preclinici. Una rappresentazione schematica di questo studio è fornita nella Figura 1.

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Protocol

Stabulazione e procedura sperimentale sono stati approvati dal governo francese (accordi #C44-278 e #APAFIS 03479.01). Procedure e cura degli animali sono state condotte sotto la direttiva UE 2010/63/UE e legge francese #2013-118 sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici.

1. valutazione dell'interazione tra il farmaco mAb 8B6 e Topotecan In Vitro

  1. preparazione del campione di 96 pozzetti
    Attenzione: Consultare il Comitato di salute e sicurezza dell'istituzione e seguire le regole di regolazione locale legate alla sicurezza in laboratorio. Rivedere le informazioni materiale e foglio di dati di sicurezza prima di lavorare con qualsiasi media, linee cellulari o reagenti. Usare una tecnica sterile corretta e lavorare in una cappa a flusso laminare. Tutte le soluzioni/apparecchiature che vengono utilizzate per manipolare le cellule devono essere sterili.
    Nota: Il seguente protocollo è stato progettato per l'utilizzo con celle aderenti. Le modifiche sono tenute ad applicare il metodo alle cellule nonadherent crescono in sospensione; Questo protocollo utilizza quattro esemplari per ogni condizione sperimentale.
    1. Crescere le cellule IMR5 in una boccetta di T75.
    2. Il primo giorno (giorno 0), osservare la cultura delle cellule al microscopio per verificare il confluency di cella. Aspirare il medium delle cellule dalla beuta, lavarlo con 5 mL di tampone fosfato salino (PBS) e aggiungere 3 mL di 0.05% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) / soluzione PBS. Restituire il pallone nell'incubatore per 3 min (37 ° C, 5% CO2).
    3. Esaminare la coltura delle cellule al microscopio per distacco cellulare.
      Nota: Se necessario, è possibile restituire il pallone nell'incubatore per altri 3-5 min, a seconda del tipo di cellula del tumore.
    4. Aggiungere 10 mL di medium cellulare completo al pallone e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica sterile 15 mL. Centrifugare le cellule per 5 min a 300 x g. Contare le celle utilizzando un emocitometro.
    5. Rimuovere e scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare nel mezzo di crescita completa. Regolare il volume medio per ottenere una concentrazione finale di 1 x 105 cellule/mL.
    6. Pozzetti di seme 84 di una piastra 96 pozzetti cultura con 10 celle4 ciascuno, che è di 100 µ l di sospensione cellulare. Seguono la disposizione sperimentale illustrata nella Figura 2.
    7. Incubare le cellule per 18 h nell'incubatrice delle cellule (37 ° C, 5% CO2).
  2. Preparazione soluzione della droga
    Nota: Per gli studi di sensibilizzazione droga/mAb, modificare la tempistica, la lunghezza e il trattamento di concentrazione per soddisfare il particolare droga/mAb in questione. Si noti che la concentrazione iniziale è 3 volte la concentrazione finale.
    1. La mattina successiva (giorno 1), preparare le seguenti soluzioni di droga utilizzando il mezzo di sviluppo completo.
      1. preparazione soluzione mAb
        1. Diluire il mAb in 500 µ l di terreno di crescita completa per ottenere una soluzione di anticorpo funzionante con una concentrazione di mAb di 240 µ g/mL.
        2. Eseguire cinque diluizioni seriali come indicato nella Figura 2.
      2. Preparazione soluzione topotecan
        1. Diluito, come sopra, la droga in 500 µ l di terreno di crescita completa per ottenere una soluzione di lavoro di droga con una concentrazione finale di 120 nM.
        2. Eseguire cinque diluizioni seriali come indicato nella Figura 2.
      3. Preparazione di soluzione di anticorpo e droga
        1. Diluire le soluzioni farmacologiche e mAb in 500 µ l di terreno di crescita completa per ottenere una soluzione a 120 nM droga e mAb 240 µ g/mL (soluzione di lavoro).
        2. Eseguire cinque diluizioni seriali come indicato nella Figura 2.
    2. Per raggiungere la concentrazione finale, trasferire 50 µ l di ogni soluzione della droga nei pozzetti corrispondenti, come indicato nel layout sperimentale ( Figura 2).
      Nota: Trasferire 50 µ l di terreno di crescita completa nei pozzetti delle cellule non trattate, come indicato nella Figura 2.
    3. Incubare le cellule per 72 h in incubatrice (37 ° C, 5% CO2).
  3. Analisi di MTT
    1. Aggiungere 10 µ l di soluzione di reagente MTT in ciascun pozzetto.
    2. Incubare a 37 ° C per 4 ore.
    3. Aggiungere 100 µ l di soluzione di lisi (10% SDS in 0,01 M HCl) in ciascun pozzetto, usando una pipetta multicanale e mescolare accuratamente pipettando.
    4. Incubare a 37 ° C per 4 ore in una camera umidificata (95% di umidità).
    5. Leggere l'assorbanza a 570 nm (un570) e 620 nm (A620) utilizzando uno spettrofotometro.
      Nota: Mescolare ogni campione ancora pipettando prima di leggere l'assorbanza; assorbanza a 620 nm permette la correzione dei valori di fondo non specifici.
    6. Calcolare l'assorbanza corretta: rettificato assorbanza = un570- A620.
    7. Calcolare l'attuabilità delle cellule come segue: vitalità cellulare = 100 x (campione assorbanza media corretta / controllo assorbanza media corretta).
    8. Calcolare i valori di frazione-commovente (Fa) utilizzando la seguente equazione: 1 - (campione assorbanza media corretta / controllo assorbanza media corretta).
  4. Software di simulazione analitica di interazione di droga per il singolo e gli studi di combinazione di droga
    1. Eseguire il software di simulazione per aprire la finestra di avvio.
    2. Fare clic sul pulsante Nuovo esperimento per aprire la finestra principale .
    3. Digitare il nome dell'esperimento nella finestra nome .
      Nota: Può essere aggiunta una data nella finestra della Data .
    4. Fare clic sul pulsante Nuovo farmaco singolo .
    5. Digitare il nome nella finestra del Nome completo .
    6. Digitare l'abbreviazione nella finestra Abbrev .
    7. Digitare l'unità di concentrazione del farmaco nella finestra unità .
    8. Immettere i dati punto 1 Dose e valore Fa, premere invio.
    9. Ripetere questo passaggio finché tutti i punti dati vengono immessi.
    10. Fare clic sul pulsante finito .
    11. Seguire la stessa procedura per inserire punti dati mAb.
      Nota: Utilizzare la stessa unità di concentrazione come viene utilizzato da droga.
    12. Fare clic sul pulsante Nuova droga Combo .
    13. Selezionare il farmaco e mAb.
    14. Selezionare Rapporto costante e fare clic su OK.
    15. Digitare il nome nella finestra del Nome completo .
    16. Digitare l'abbreviazione nella finestra Abbrev .
    17. Digitare il rapporto droga/mAb nella finestra del rapporto .
    18. Immettere i dati punto 1 Dose e premere invio.
      Nota: È possibile che il programma calcolerà automaticamente le dosi di mAb e Combo.
    19. Immettere il valore di Dati punto 1 Fa e premere invio.
    20. Ripetere questo passaggio finché tutti i punti dati vengono immessi.
    21. Fare clic sul pulsante finito e, quindi, fare clic sul pulsante Genera Report .
    22. Selezionare il farmaco e mAb e, quindi, fare clic su OK.
    23. Selezionare Combo e, quindi, fare clic su OK.
    24. Selezionare intestazione, CI tabellae tabella riassuntiva. Quindi, fare clic su OK.
    25. Digitare il nome file del file di analisi e fare clic su Salva per generare il report.
      Nota: Dopo aver cliccato OK, la relazione aprirà automaticamente nel web browser predefinito del computer.
    26. Per stampare il report, scegliere stampa dal menu file del browser web. Il report contiene una sezione di tabella di riepilogo che include titolo, data, nome file, descrizione nota, parametri (m, Dm e r), ED50 per qualsiasi agente usato in monoterapia o in combinazione e la tabella di CI per ogni combinazione a ED50, ED 75, ED90e95di ED.
      Nota: Un valore di CI di < 1 indica sinergismo, CI valore = 1 indica additività e un valore di CI di > 1 indica antagonismo.

2. generazione di xenotrapianti di Neuroblastoma umano nei topi di Scid Gamma NOD diabetici Nonobese (topi NSG)

Nota: Escludere qualsiasi contaminazione della coltura delle cellule. Poiché la matrice della membrana basale forma un gel sopra i 5 ° C, tutti i cultureware o media entrano in contatto con il reagente di matrice della membrana basale dovrebbe essere prechilled e ghiaccio-freddo. Tenere la matrice della membrana basale sul ghiaccio durante l'intero processo.

  1. Preparazione della sospensione delle cellule IMR5
    1. Scongelare il reagente di matrice della membrana dello scantinato durante la notte immergendo il flaconcino nel ghiaccio in un frigorifero a 4 ° C prima dell'uso.
    2. Il giorno 0, vendemmia IMR5 cellule coltivate come dettagliato sopra.
    3. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min.
    4. Scartare il surnatante. Lavare le cellule 2 x con 15 mL di PBS ghiacciata e preparare una sospensione di cellule di 5 x 107 cellule/mL in PBS ghiacciata.
      Nota: Se necessario, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
    5. Agitare il flaconcino di matrice della membrana dello scantinato.
      Nota: Il reagente di matrice della membrana basale dovrebbe essere scongelato e dispersi.
    6. Aggiungere un volume di reagente di matrice della membrana dello scantinato e mescolare pipettando per ottenere una sospensione di cellule di 2,5 x 107 cellule/ml.
    7. Mantenere la sospensione cellulare su ghiaccio.
  2. Preparazione dei topi
    Nota: I topi dovrebbero essere sei o sette settimane.
    1. Mantenere i topi in una condizione da organismi patogeni specifico.
    2. Consentire un periodo di acclimatazione di tre - cinque giorni dopo sono arrivati i topi.
    3. Il giorno dell'inoculazione, radere il fianco dove sarà l'iniezione (vedere il punto 2.3.6).
  3. Preparazione dell'iniezione delle cellule del tumore
    Nota: Tenere la sospensione di cellule di matrice ghiacciata della membrana dello scantinato asettica durante tutta la procedura.
    1. Mescolare le cellule e disegnare accuratamente la sospensione cellulare in una siringa da 1 mL montata con un ago 21G.
    2. Controllare per essere sicuri che non ci sono bolle d'aria nella siringa.
    3. Disinfettare la zona di inoculazione del mouse con una soluzione antisettica.
    4. Premere delicatamente la pelle del mouse sul fianco tra le dita, al sito di iniezione.
    5. Inserire l'ago esattamente la piega di pelle. Non posizionare l'ago profondità nel tessuto per garantire un'iniezione sottocutanea.
    6. Iniettare per via sottocutanea 100 µ l di sospensione cellulare IMR5 (cioè, 2.5 x 106 cellule) nel fianco destro inferiore dei topi.
    7. Ruotare la siringa per evitare perdite e ritirare l'ago.
  4. Monitoraggio delle variazioni di peso corporeo e la crescita del tumore
    1. Misurare la lunghezza (A) e la larghezza (B) del tumore con una pinza.
    2. Calcolare il volume del tumore usando la formula (A x B2) x 0,5.
    3. Iniziare la terapia quando i tumori hanno raggiunto un volume medio di ~ 50-60 mm3.

3. droga e amministrazione dell'anticorpo in topi

  1. Somministrazione endovenosa di mAb 8B6
    1. Attentamente e riempire una siringa da 1 mL, montata con un ago da 25 G con soluzione di mAb.
    2. Posizionare il mouse sotto una lampada di calore per 10 min a dilatare la vena della coda.
    3. Trattenere il mouse in un dispositivo di ritenuta del roditore.
    4. Disinfettare la zona di inoculazione del mouse con una soluzione antisettica.
    5. Inserire l'ago parallelo alla vena della coda, penetrante 2-4 mm nel lumen, mantenendo la smussatura del viso dell'ago verso l'alto (Figura 3A).
    6. Iniettare 100 µ l di soluzione di anticorpo per via endovenosa (i.v.).
    7. Quando è terminata l'iniezione, pressione delicatamente il sito di iniezione per prevenire il sanguinamento.
  2. Somministrazione intraperitoneale di topotecan
    1. Aspirare la soluzione di droga in una siringa da 1 mL, montata con un ago da 25 G.
    2. Tenere premuto il mouse in posizione supina, con la sua estremità posteriore leggermente rialzata.
    3. Disinfettare la zona di inoculazione del mouse con una soluzione antisettica.
    4. Individuare la linea mediana del mouse addome e mentalmente divide l'addome in quadranti. Individuare il sito di iniezione nel quadrante inferiore destro o sinistro (Figura 3B).
    5. Inserire l'ago nell'addome (5 mm di profondità) ad angolo di ~ 10°, nel quadrante inferiore destro o sinistro.
    6. Iniettare 100 µ l di soluzione di droga per via intraperitoneale (i.p.).
    7. Disinfettare il sito di inoculazione.

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Representative Results

I risultati rappresentativi e le figure sono adattati con il permesso dal precedente lavoro pubblicato14.

Anti-OAcGD2 mAb 8B6 migliora sinergico effetti inibitori di Topotecan, sulla crescita linea cellulare di Neuroblastoma:

Per stabilire la droga e le concentrazioni di anticorpi da utilizzare per la valutazione del sinergismo tra topotecan e mAb 8B6, la droga e le sensibilità di anticorpo di umana IMR5 cellule di neuroblastoma sono state misurate in primo luogo, usando un'analisi MTT. L'esposizione a mAb 8B6 o topotecan da solo per 72 h ha provocato un'inibizione dipendente dalla concentrazione di attuabilità delle cellule IMR5 (Figura 4A). Curve dose-risposta il calcolo del de50 valori consentiti per ciascun composto. A tal fine, Fa valori sono stati calcolati utilizzando il software di simulazione di analisi. I valori calcolati di50 ED sono stati trovati per essere di 10 nM ± 1 per topotecan (Figura 4B) e 18 µ g/mL ± 3 per mAb 8B6 (dati non mostrati).

Basato su questi valori di50 ED, successivamente, la potenza di uguale potenza combinatoria sei rapporti di mAb 8B6 e topotecan sono stati testati (Figura 2). Lo spostamento della curva dose-risposta combinazione verso il lato sensibile del grafico indica che il regime di combinazione è più potente di ogni in monoterapia (Figura 4A). Per ottenere il corrispondente ED50 e CI valori, Fa i valori sono stati calcolati. I valori di50 ED di topotecan erano significativamente più bassi in presenza di mAb 8B6 (p < 0,05, Figura 4B), che indica che mAb 8B6 sensibilizza la cellula del tumore a topotecan. D'importanza, i valori CI erano significativamente meno di 1.0 (p < 0,05), dimostrando un'interazione sinergica (Figura 5). Quindi, mAb 8B6 ha il potenziale come agente terapeutico ausiliario per la chemioterapia topotecan.

Anti-OAcGD2 mAb 8B6 migliora antitumorale attività di Topotecan In Vivo

Poiché in vitro modelli né prendono in considerazione l'emivita di droga né il metabolismo dei farmaci, è necessario confermare in vitro risultati in vivo. Inoltre, in vivo modelli sono molto utili per valutare la sicurezza del regime di combinazione. Per confermare che il sinergismo tra topotecan e mAb 8B6 era specifico per le cellule tumorali, sono stati valutati gli effetti antineuroblastoma della terapia di combinazione in un modello di xenotrapianto di tumore. Per questo, il severa immunodeficienti NSG mouse ceppo selezionato. Questi topi mancano di un innato e un sistema immunitario adattativo15e di conseguenza, rendono possibile per i ricercatori escludere eventuali effetti immunomodulatori indotti tramite la terapia di topotecan che possa influenzare la potenza di mAb. Trattamento è stato iniziato una volta che i tumori hanno visualizzato un volume medio di 50 ± 2,5 mm3 (Figura 6A). I trattamenti ha consistito di entrambi 8B6 mAb (150 µ g i.v., giorno 7 e 11 ° giorno), topotecan (0,36 mg/kg i.p., giorni 7-11), o una combinazione di mAb 8B6 e topotecan. I volumi del tumore sono stati controllati nel corso della sperimentazione. Tutte le terapie hanno portato a ritardo di crescita del tumore rispetto ai gruppi di controllo (Figura 6A). Il regime di combinazione, tuttavia, ha indotto il più forte effetto (Figura 6A).

Crescita del tumore può essere ulteriormente analizzata per studiare il tasso di sopravvivenza dopo trattamento. A tal fine, l'evento conseguente eutanasia del mouse è stato definito come tumore volume ≥ 1 cm3 per motivi etici. Questo ci ha permesso di effettuare un'analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meyer e per calcolare il tempo mediano di sopravvivenza libera da eventi per ogni gruppo sperimentale. Come mostrato in Figura 6B, entrambi monoterapie migliorato la sopravvivenza libera da eventi (EFS) sostanzialmente rispetto ai gruppi di controllo (mediana EFS del gruppo veicolo-trattato è stato 21 giorni; l'anticorpo gruppo di controllo, 22 giorni; del gruppo topotecan, 26 giorni ; del mAb 8B6 gruppo, 29 giorni [Figura 6B]). Ancora, la terapia combinata ha avuto il più forte effetto sulla sopravvivenza di topi, con una mediana di EFS estesa a giorni 39,5 (p < 0,05, mAb 8B6 vs combinazione; p < 0.01, topotecan vs combinazione [Figura 6B]).

Perché interazioni sinergiche possono risultare in un aumento della tossicità, la sicurezza del regime di combinazione deve essere valutata. Come tale, la perdita di peso è comunemente usato come un indicatore sensibile per il monitoraggio sanitario in roditori16. Quindi, peso perdita-misurato come un declino in percentuale rispetto al peso iniziale-è stato mantenuto come un indicatore della tollerabilità sistemica di ogni regime di testata. Nessuna perdita di peso corporeo è stato osservato, suggerente che il trattamento è stato ben tollerato (Figura 7). Questi dati suggeriscono che la combinazione di topotecan più mAb 8B6 rappresenta un più potente efficacia antitumorale in vivo di qualsiasi agente da solo, senza tossicità rilevabile.

Figure 1
Figura 1 : Rappresentazione schematica dello studio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Layout dell'esperimento combinazione su una piastra a 96 pozzetti con rapporti di topotecan per mAb 8B6, preparato come sei soluzioni. Le soluzioni sono state preparate come descritto nel protocollo. Pozzi etichettati da 1 a 4 servono come mAb 8B6 soluzioni, etichettati da 5 a 8 pozzetti servono come soluzioni di topotecan e pozzi etichettati da 9 a 12 fungono da mAb 8B6 e topotecan (combinazione) soluzioni. Pozzetti con etichettata A e H servire come controlli; pozzetti con l'etichetta B fungono da 0.125 x soluzioni a concentrazione di ED50 droga; pozzetti con etichettate C fungono da 0,25 x soluzioni a concentrazione di ED50 droga; pozzetti con etichettate D servono come 0,5 x soluzioni a concentrazione di ED50 droga; pozzi etichettati servire E come soluzioni di droga di ED50 concentrazione; pozzetti con etichettate F servono come 2X soluzioni di droga di ED50 concentrazione; pozzi etichettate G servono come 4 x soluzioni a concentrazione di ED50 farmaco, come indicato. Agenti terapeutici con due differenti unità (cioè, µ g/mL per mAb 8B6 e nM per topotecan) sono analizzati in una combinazione di rapporto fisso (0.075, topotecan/8B6). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Iniezioni. Iniezione endovenosa (A) nella vena della coda di un topo sobrio, utilizzando una siringa da insulina di 27 x 1/2 pollici, 1 mL. (B) l'iniezione intraperitoneale per il quadrante inferiore destro dell'addome del mouse, utilizzando una siringa da 1 mL, montata con un ago da 25 G. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Relazione dose-effetto di topotecan, mAb 8B6 e loro combinazione su inibizione di attuabilità della crescita delle cellule di neuroblastoma IMR5 dopo 72 h di esposizione. Un'analisi di MTT è stata eseguita come descritto nel protocollo. (A) della dose-risposta curve mostrate sono rappresentativi di tre repliche indipendenti, ognuno eseguito in quadruplicato. I dati sono presentati come media ± DS; p < 0,001. (B) ED50 di topotecan utilizzato in monoterapia o in combinazione con mAb 8B6. I dati sono presentati come la media ± SEM Questa figura è stata modificata da Faraj et al. 14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 5
Figura 5 : i valori di indice di combinazione. Percentuali di sopravvivenza sono stati trasformati in valori di frazione-commovente (Fa) e utilizzati per calcolare l'indice di combinazione (misura di sinergia, additività e antagonismo) utilizzando il software per computer, come indicato nel testo. Nelle trame di indice di combinazione, i dati sono presentati come media ± DS per tre repliche indipendenti. Risultati mostrano che 8B6 mAb ha avuto un effetto sinergico con topotecan (CI < 1). Questa figura è stata modificata da Faraj et al. 14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : Trattamento di combinazione di IMR5 xenotrapianti in topi NSG con mAb 8B6 plus topotecan. (A) topi cuscinetto umane di neuroblastoma IMR5 xenotrapianti sono stati trattati con il veicolo (PBS, i.p.), topotecan da solo (0,36 mg/kg, i.p.), controllo IgG da solo (150 µ g, i.v.), mAb 8B6 da solo (i.v.) o topotecan e mAb 8B6 combinata, come indicato. La somministrazione di mAb 8B6 o controllo trattamento dell'anticorpo ha iniziato il giorno 7 dopo l'inoculazione delle cellule IMR5 ed è stata ripetuta una volta il giorno 11. Il trattamento di PBS o topotecan è stato iniziato il giorno 7 e dato per cinque giorni consecutivi. La crescita del tumore è stata monitorata, e volumi del tumore sono stati calcolati. Il ± di volume medio del tumore SEM di ciascun gruppo di trattamento (gruppo di PBS, 9 topi; tutti gli altri gruppi, 10 topi) sono raffigurati (* p < 0,05 per mAb 8B6 contro 8B6 mAb e topotecan insieme, * * p < 0.01 per topotecan contro mAb 8B6 e topotecan insieme), come indicato. Per il mAb 8B6/topotecan combinazione, rispetto ai controlli droga da solo, come indicato (p < 0,05) è stata osservata una significativa riduzione del volume dello xenotrapianto. Libera da eventi (B) le curve di sopravvivenza Kaplan-Meyer di diversi gruppi trattati sono mostrate. Questa figura è stata modificata da Faraj et al. 14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 : Peso medio per ogni gruppo di trattamento, come indicato. Il peso medio dei topi il giorno 0 è stato definito come peso di 100%. Il peso in ogni gruppo è rimasto stabile per il periodo di trattamento. I dati sono presentati come la media ± SEM Questa figura è stata modificata da Faraj et al. 14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Per prevedere l'effetto di interazione farmacologica, tre metodi possono essere utilizzati: la metodologia di isobologram17, la miscela non lineare modello18e la combinazione di indice1. Analisi dell'indice di combinazione sono il più comunemente usato perché la sua applicazione è semplificata dalla disponibilità di un programma per computer facile da usare. Per questo scopo, abbiamo caratterizzato in primo luogo la risposta dose-effetto di ogni agente usato da solo o in combinazione, eseguendo un' analisi MTT19. Questa metodologia si basa sulla capacità delle cellule vitali per ridurre il sale di tetrazolio in un prodotto di formazan color porpora con un massimo di assorbanza di 570 nm19. Alla morte, le cellule perdono la capacità di convertire MTT in formazan. Così, la quantità del prodotto colorato formazan è proporzionale al numero di cellule vitali in cultura19. Infatti, abbiamo scelto questa metodologia come alternativa non radioattivi per l'incorporazione di timidina contenente tritio in DNA per la misurazione di proliferazione cellulare19. Come tale, analisi di MTT sono state ampiamente adottate e rimangono popolari in laboratori accademici, come testimoniano migliaia di articoli pubblicati. Mentre la quantità di formazano è misurata registrando l'assorbanza a 570 nm utilizzando uno spettrofotometro di lettura targhe, una lunghezza d'onda di riferimento di 620 nm a volte è usato ma non necessaria per la maggior parte delle condizioni di analisi. In considerazione il passo critico descritto qui, abbiamo trovato che le condizioni di coltura usate per coltivare le cellule possono influenzare i risultati delle analisi di MTT. Abbiamo trovato che il numero di cellule vitali, l'attività metabolica delle cellule, l'età delle culture e il numero di passaggi e dettagli del mezzo di crescita possono essere fattori importanti. Pertanto, devono essere presi in considerazione quando si ripete il test e analisi dei dati. Inoltre, le condizioni di coltura delle cellule differiscono per ogni varietà di cellula. È, quindi, complicato per fornire che qualsiasi chiare indicazioni circa la cella densità di semina. Come regola generale, un numero medio di cellule tra 2.000-10.000 cellule per pozzetto è consigliato per ottenere una densità di cella ottimale entro 72 h. soprattutto, riduzione di MTT riflette il metabolismo delle cellule vitali e non, in particolare, proliferazione delle cellule o morte cellulare. Di conseguenza, analisi di MTT né dovrebbero essere descritto come misura proliferazione delle cellule né cellulare citotossicità20,11. La rilevazione della morte delle cellule si basa su specifiche analisi cell-based. Ad esempio, negli studi precedenti, abbiamo usato l'analisi western blot per rilevare l'attivazione delle caspasi 3 e/o flusso cytometry analisi per rilevare la fosfatidilserina l'opuscolo esterno della membrana plasmatica, di evidenziare l'attività proapoptotica di mAb 8B613.

Quando combinazione test droga, possono essere forniti insieme o successivamente nel tempo. Data la varietà del meccanismo di azione, è difficile fornire indicazioni precise per la relativa impostazione sperimentale. Ancora, la maggior parte dei ricercatori utilizzano test diretto di combinazioni di farmaci. Inoltre, le concentrazioni che producono un effetto definito del singolo-agente di inibizione di crescita di 50% delle cellule sono comunemente usate. Le concentrazioni di farmaco che riflette le concentrazioni plasmatiche sono realizzabili in pazienti sono comunemente considerate come rilevanti clinicamente. Come tale, viene eseguita l'analisi di dose-effetto di combinazione per dosi diverse, mantenendo il rapporto di combinazione costante con una diluizione seriale delmAb(ED50) / (ED50) rapporto didroga , anche se non è un requisito assoluto 1. della nota, i valori CI devono essere anche calcolati in vari ED testato (ad es., ED50, ED75ed ED90) perché possono cambiare con la Fa in un modo non lineare1. Dopo aver eseguito l'analisi automatizzata dei valori di CI, il coefficiente di correlazione lineare r-valore stimato dagli algoritmi dovrebbe essere > 0.9, in modo da riflettere la bontà dell'adattamento dei dati sperimentali. CI valori di < 1 indicare sinergia, CI valori di = 1 indicare additività e CI valori di > 1 denotano antagonismo1. A causa della variabilità in entrambi i metodi sperimentali e il sistema biologico, calcolato CI dovrebbe essere più ancora sottoposto a considerazioni statistiche. Come tale, un metodo semplice è quello di ripetere l'esperimento di combinazione di droga più volte seguita dal calcolo dei valori CI risultanti prima di determinare le statistiche del media ± SD1. Si consiglia inoltre di verificare la combinazione nel pannello più grande possibile di linee cellulari, a prendere in considerazione la variabilità che esiste tra di loro.

D'importanza, diversi parametri nello Studio in vitro non sono prese in considerazione per l'estrapolazione in vivo . Per esempio, l'in vitro saggi di vitalità che né prendere in considerazione l'emivita in vivo della droga, né metabolismo in vivo droga che può provocare la inattivazione del farmaco. Così, l'estrapolazione da in vitro in vivo rimane una domanda separata, e la droga benefica interazione evidenziato in vitro deve essere ulteriormente confermato in vivo. Come tale, una chiara dimostrazione di sinergia in topi che sopportano gli xenotrapianti del tumore, utilizzando il metodo di indice di combinazione, è stato pubblicato21. Ancora, gli studi in vivo richiedono un gran numero di animali per definire con precisione la sinergia e sono più costosi e richiede più tempo. Il modello alternativo efficace F-test ancora richiede notevoli risorse22. Come un approccio diverso per limitare l'uso di un gran numero di animali consiste nel dimostrare la sinergia di droga in modelli di coltura cellulare seguita dall'evidenza di un'aumentata risposta antitumorale della combinazione in un limitato dello xenotrapianto Studio14, abbiamo usato le cellule umane di neuroblastoma IMR5 come destinazione per lo Studio in vivo del tumore. Abbiamo mantenuto le cellule IMR5 perché sono cancerogeni in topi immunocompromessi23. Mentre modelli di xenotrapianto di tumore umano forniscono preziosi modelli per test droga combinazioni in vivo24, può essere difficile stabilire tali modelli da una varietà di cellula linee25. Per aumentare l'incidenza di formazione del tumore in topi, le cellule possono essere iniettate nei topi con una matrice di seminterrato della membrana come un veicolo25. D'importanza, poiché la matrice della membrana dello scantinato si polimerizza e si solidifica a temperature superiori a 5 ° C, tutti i cultureware o supporti venendo a contatto con la matrice del seminterrato della membrana dovrebbero essere prechilled e ghiaccio-freddo, e le soluzioni di membrana dello scantinato dovrebbero essere tenute su ghiaccio durante l' intero processo25. Con l'uso della matrice della membrana dello scantinato, abbiamo osservato un tasso di prendere 100% con le cellule di IMR5, mentre, in assenza di matrice della membrana dello scantinato, questa linea cellulare ha dimostrato un < prendere 80% tasso (dati non mostrati). Inoltre, per aumentare l'incidenza dell'innesto del tumore, la matrice della membrana dello scantinato può anche aumentare il tasso di crescita del tumore25. Abbiamo osservato che tutti gli xenotrapianti erano apparso di giorno 11. Tuttavia, durante i primi sette giorni dopo la sfida delle cellule del tumore, la presenza di grumi potrebbe essere osservata, che può essere causato dalla presenza dell'inoculo iniziale (dati non mostrati). Così, non abbiamo considerare misure del formato di tumore significativo prima di questo tempo. Utilizzando la matrice di membrana dello scantinato ha permesso di ridurre il numero di topi in ambito sperimentale ed effettuare l'esperimento in vivo entro tre mesi.

I dosaggi del farmaco/anticorpo possono variare a seconda del ceppo di linea e mouse di cella. A causa della limitazione l'analisi di attuabilità in vitro per estrapolare il dosaggio in vivo droga/anticorpo sopra descritto, dosaggi clinicamente rilevanti sono stati conservati per topotecan sia mAb 8B6 in ambito sperimentale in vivo , basato sui dati pubblicati da altri26,27. Per estrapolare l'impostazione di dosaggio umano ai topi, sono state seguite linee guida precedentemente pubblicati28 . Per sé, abbiamo iniettato 150 µ g di anticorpo 8B6 i.v. al giorno 7, seguita da una seconda iniezione cinque giorni più tardi (Totale dose/mouse = 300 µ g). Topotecan trattamento iniziato lo stesso giorno come la prima iniezione di mAb 8B6 iniettando topotecan 0,36 mg/kg o PBS controllo i.p. per cinque giorni consecutivi. In considerazione il passo critico descritto qui, si consiglia di iniziare le infusioni dell'anticorpo quando i xenotrapianti del tumore raggiungono ~ 50 mm3. Maggiori volumi di xenotrapianto di tumore si tradurrà in un minor tasso di risposta perché gli oneri del tumore chiaramente correlano inversamente con la concentrazione di anticorpi, l'esposizione dell'anticorpo e l'anticorpo efficacia29. Abbiamo mantenuto anche perdita di peso come un indicatore di tollerabilità sistemica di ogni regime testata16. Tuttavia, l'interpretazione dei pesi raccolti potrebbe non essere disponibile con un grande tumore massa. In questo caso, corpo condizione segnando, come descritto altrove16, è consigliato.

I tumori possono essere raccolti in diversi momenti per analisi immunochimica, per fornire ulteriori informazioni sul meccanismo d'azione innescata in vivo. In un lavoro precedente, l'indice apoptotico del tumore è stata valutata dopo mAb 8B6 infusione13. A tal fine, le cellule tumorali apoptotiche sono state rilevate usando un TUNEL assay13. Inoltre, la percentuale dei nuclei delle cellule del tumore è stata segnata con Ki67 antigene-positivo che macchia per analizzare l' indice di proliferazione del tumore13.

Topi immunodeficienti gravi mancano sia innata e immunità con la perdita di cellule T, cellule B e cellule natural killer (NK) con ridotta del macrofago e funzioni delle cellule presentanti l'antigene e l'assenza di circolazione complemento30. Così, questo protocollo non permettono ai ricercatori di trarre conclusioni per quanto riguarda presunti effetti della chemioterapia in potenzianti terapia mAb alterando il microambiente del tumore in vivo31. Tuttavia, sia gli effetti immunomodulatori putativo dell'agente chemioterapico e il ruolo della regione (Fc) frammento cristallizzabile del mAb nel migliorare la potenza di farmaco antitumorale validamente prese in considerazione, ma queste domande richiedono la disponibilità di un modello syngeneic con un sistema immunitario intatto e un microambiente tumorale fisiologico.

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Disclosures

S.Fa., J.F. e S.B. sono indicati come inventori di in attesa di brevetti che coprono l'applicazione clinica degli anticorpi terapeutici anti-O-acetil-GD2.

Acknowledgments

Concedere il sostegno: Fondation de Projet de L 'Université de Nantes, les Bagouz' à Manon, La Ligue contre le Cancer comité de Loire-Atlantique, comité du Morbihan e comité de Vendée, une rosa versare S.A.R.A.H, L'Etoile de Martin e la Société Française de Lutte contre les I cancri et les leucémies de l'enfant et de L'adolescent (SFCE). M.B. e J.F. sono supportati da La Ligue Contre Le Cancer. Gli autori ringraziano l'UTE-impianto della struttura Fédérative de Recherche François Bonamy. Gli autori ringraziano anche Dr. S. Suzin (Inserm, Parigi) per fornire le cellule IMR5 e Sig. ra H. Estéphan per la sua assistenza tecnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Proliferation kit (MTT) Roche 11-465-007-001
CompuSyn software ComboSyn Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com
Electric shaver Bioseb BIO-1556
Fetal calf serum Eurobio CVFSVFF00-01 10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640
Firefox  Mozilla Corporation Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lamp Verre&Quartz 4003/1R
Human neuroblastoma IMR-5 cell line Accegen Biotechnology ABC-TC0450 IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)
L-glutamine Gibco 25030-024 2 mM in RPMI 1640
Lysis solution  Roche  11-465-007-001
mAb 8B6 University of Nantes N/A
Matrigel Corning 354248
Multiskan FC Thermofischer Scientific  N08625
Needle 21G 1 ½  BD Microlance 304432
Needle 25G 1 Terumo NN-2525R
NSG mice Charles River Laboratories 5557
Nunc MicroWell 96-well microplates Thermofisher 167008
PBS VWR L182-10
PBS, 0,05% EDTA Sigma-Aldrich E9884
PC that runs windows 7 Microsoft Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640
Reagent reservoir Thermofischer Scientific 8094
Rodent restrainer Bioseb TV-150-SM
RPMI 1640 Gibco 31870-025
Syringe 1 mL Henke Sass Wolf 5010.200V0
Topotecan Sigma-Aldrich T2705

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