Summary
在这里, 我们描述了一个方案的阳离子纳米脂质体的生成, 这是基于干膜法, 并可用于安全和有效的传递体外转录信使 rna。
Abstract
由于体外转录 (ivt) mrna 的积极特性, 基于信使 rna (mrna) 的治疗各种疾病的疗法的开发变得越来越重要。在 ivt mrna 的帮助下, 可以在不改变目标细胞生理状态的情况下诱导所需蛋白质的新合成。此外, 由于 ivt mrna 的瞬态效应, 可以精确地控制蛋白质的生物合成。
对于细胞的有效转染, 纳米脂质体 (nlps) 可能是治疗 mrna 的安全有效的载体。本研究描述了一种生成安全高效阳离子 nlps 的协议, 该方案由 dc-胆固醇和 1, 2-二醇-环甘油酯-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------nlps 具有定义的尺寸、均匀分布和较高的复用能力, 可使用干膜法生产。此外, 我们提出了不同的测试系统, 以分析他们的络合和转染效率使用合成增强绿色荧光蛋白 (transfection) mrna, 以及他们对细胞活力的影响。总体而言, 所提出的协议为 mrna 络合提供了一种有效和安全的方法, 可以促进和改进治疗性 mrna 的管理。
Introduction
在过去几年中, 改性 mrna 在治疗应用中的应用显示出巨大的潜力。在心血管、炎症和单基因疾病以及疫苗开发中, mrna 是一种很有前途的治疗药物1。
蛋白质替换疗法与 mrna 提供了几个好处比古典基因疗法, 根据脱氧核糖核酸转染入目标细胞2。mrna 功能直接在细胞溶胶中启动。尽管质粒 dna (pdna) 是一种双链结构, 含有启动子区域的圆形 dna 和编码治疗蛋白3的基因序列, 也在细胞溶胶中发挥作用, 但它只能被纳入正在进行有丝分裂的细胞中在转染的时候。这减少了组织中转染的细胞数量 1,4。具体来说, 有丝分裂活性弱的组织, 如心肌细胞的转染是困难的 5。与 pdna 不同的是, mrna 的转染和转化发生在组织1,6的有丝分裂和非有丝分裂细胞中。dna 与宿主基因组的病毒整合可能伴随着致突变效应或免疫反应7,8, 但在细胞转染后与蛋白质编码 mrna, 去重新合成所需的蛋白质自主开始 9,10。此外, 蛋白质合成可以通过单独剂量精确地调整到患者的需要, 而不会干扰基因组, 并有致突变效应11的危险.用伪尿素和 5 '-甲基胞苷代替尿素和胞苷12可显著降低合成生成的 mrna 的免疫激活潜力.假尿碱修饰的 mrna 也被证明具有更高的生物稳定性和显著提高的翻译能力13。
为了能够从基于 mrna 的治疗在临床应用中的有希望的特性中受益, 必须为 mrna 输送到细胞创造一个合适的工具。该飞行器应在体外和体内具有无毒特性, 保护 mrna 免受核酸酶降解的影响, 并提供足够的细胞吸收, 以便长时间地提供和翻译 mrna14。
在所有可能的体内药物传递载体类型中, 如碳纳米管、量子点和脂质体, 后者的研究最多 15、1 6.脂质体是由脂质双层10组成的囊泡。它们是具有疏水性和亲水性的两亲性, 通过这些分子的自排列, 形成了一个球形的双层。在脂质体内, 治疗药物或药物可以被封装, 从而防止酶降解 18.含有 n-[1, 2, 3-二烯二氧基) 丙基]-n 的脂质体, n、n-三甲基氯化铵 (dadma)19、[1, 2-bis (oley合 y)-3-(三甲基氨)丙烷] (dadap) 20 和二辛烷基氨基氨基氨基氨基氨基氨基胺胺 (dogs)21, 或dc-胆固醇22, 有很好的特征, 经常用于与 dna 或 rna 的细胞转染。
阳离子脂质体包括带正电荷的脂质和未带电的磷脂 23。通过阳离子脂质体转染是将核酸输送到细胞24,25的最常用方法之一。在核酸分子的主干中, 阳离子脂质颗粒与负电荷磷酸盐基团形成复合物26。这些所谓的脂质附着物附着在细胞膜表面, 并通过内吞或内皮样机制进入细胞 27。
1989年, 马龙等人。成功地描述了阳离子脂介导的mrna 转染28。然而, 使用 dotma 和 1, 2-二醇-sn-h神菌-3-磷乙醇胺 (dope) 的混合物, 该组发现 dotma 表现出细胞毒性作用28。此外, zohra等人还表明, dadap (1, 2-二烯二氧基 3-三甲基丙烷氯丙烷) 可用作 mrna 转染试剂29。然而, 为了有效转染细胞, dopap 应与其他试剂结合使用, 如纤维连接蛋白 29或 dope30。到目前为止, d同甲是市场上第一个用于基因传递的阳离子脂质 31.其他脂类被用作治疗载体或正在临床试验的不同阶段进行检测 (例如, 含有 dentap 作为脂质载体的 endatg-i) 目前正在第二阶段临床试验32中进行调查。
这项工作描述了一个协议, 用于生成含有 dc 胆固醇和 dope 的 nlps。此方法易于执行, 并允许生成不同大小的 nlps。使用干膜法生成 nlp 的总体目标是为 mrna 络合创建脂质体, 从而允许在体外高效和生物相容性的细胞转染 14,33。
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Protocol
1. 阳离子纳米脂质体的产生 (图 1)
- 溶解脂质 dc-胆固醇 (3β-[n-(n ', n '-二甲基氨基乙烷)-氨基乙酰] 盐酸胆固醇) 和 dope (二烯醇磷脂酰乙醇胺), 以氯仿的形式提供, 最终浓度为 25 mg/ml。
注: 将溶解的脂质存放在-20°c。 - 使用 25 mgml 两种脂类的库存解决方案。将溶解的 dc 胆固醇的40μl 和溶解的 dope 的80μl 混合在一个玻璃瓶中。
注: 总脂量为3毫克。为避免氯仿快速蒸发, 在移液过程中将脂质放在冰上。 - 在氩气流动下对氯仿进行15分钟的蒸发。随后, 用硅胶填充干燥器, 将打开的玻璃烧瓶放入室内, 并在一夜之间涂抹真空, 以确保剩余的氯仿蒸发, 并在玻璃烧瓶内形成脂质膜。
注意: 工作速度快, 避免不必要的 o2 接触。 - 用1毫升无核酸水补充形成的脂质膜, 并对悬浮液进行15分钟的旋涡 (图 2a)。然后, 将悬浮液放入声纳浴中 1小时 (图 2b)。
注意: 悬架将略显多云。 - 按照制造商的说明组装微型挤出机, 用脂质悬架填充注射器, 并将填充的注射器和空注射器放在挤出机的两侧。按下脂质悬浮液从一个注射器到另一个注射器, 20x–25x, 以挤压悬浮液 (图 2c)。
注: nlps 的大小取决于所使用的膜的孔径。 - 将 nlps 存放在4°c 的玻璃烧瓶中, 直至进一步使用。
注意: 经过长时间的储存时间后, nlps 应再次放置在超声浴中15分钟乘 35 khz, 以规避复杂的形成。
2. 合成 mrna 的体外转录
- 按照前面34发布的协议准备 egfp 编码 mrna。
- 用0.7μm 的前置 (5 '-ttg gac cct cgt cgt act aca gaa gct aat acg-3) 放大质粒中的 egfp 序列 ') 和反向 (5 '-t120 ctt ctt act cng tta ttta gac ca-3 ') 引物和聚合酶试剂盒与 pcr。
- 混合20μl 的商业缓冲液, 改变 dna (材料表) 的熔融行为, 以及20μl 的5倍混合从聚合酶试剂盒。加入每种 (正向和反向) 底漆的7μl。
- 在混合物中加入25纳克的 egfp 质粒和从聚合酶试剂盒中加入2μl 的聚合酶。
注意: 将聚合酶移至溶液后, 请将其保存在冰上。 - 在混合物中加入无核酸酶的 h2o,体积不超过100μl。
- 按照表 1中的协议在热环器中运行 pcr 周期。
- 用 pcr 纯化试剂盒纯化 egfp 编码 dna 序列。
- 因此, 将 pcr 溶液与试剂盒中500μl 的结合缓冲液混合, 并使用它填充纯化柱。
- 以最大速度离心柱 1分钟, 并丢弃滤液。
- 在色谱柱中加入750μl 洗涤缓冲液 i, 以最大速度再离心 1分钟, 并丢弃滤液。
- 重复离心机步骤 1x, 从列筛选器中取出缓冲区。
- 将色谱柱转移到新鲜的 1.5 ml 管中。
- 在柱中加入20μl 的无核酸酶h2o, 孵育 1分钟, 离心机以最大速度孵育1分钟。重复此步骤。
- 用分光光度计测量 dna 的浓度, 并将其存储在-20°c。
- 使用凝胶电泳进行 dna 质量分析。在 rris-borate-edta (tbe) 缓冲液中加入0.5 克琼脂糖, 并在高温下将其加热, 直到琼脂糖完全溶解。
- 在琼脂糖液体中加入5μl 凝胶染色溶液, 将溶液灌入凝胶室, 然后等待凝胶聚合。
- 将200纳克的 dna 与2μl 的6x 负载染料混合, 并将其填充到凝胶井中, 直到端体积为 12μl. 移液器, 然后再放入凝胶井中, 并在 100 v 处运行1小时的电泳。
- 在紫外光下, 用凝胶分析站对凝胶进行分析。
- 运行体外转录, 利用含有 t7-聚合酶的体外转录试剂盒从 dna 序列中生成 mrna, 并用-utp 和甲基-ctp 取代 utp 和 ctp 的修饰核苷酸。
- 对于体外转录, 混合表2后面的成分。
注: 将1.5 μl 的甲基 ctp 改为 1:10 cy3-ctp, 在 egfp mrna的体外转录过程中, 在无核酸酶 h2o 中稀释, 以实现 mrna 的 cy3 标记。 - 在37°c 下培养 ivt 反应混合物4小时。
- 从 t7 聚合酶试剂盒中加入1μl 的 dna i, 然后在37°c 孵育 15分钟, 以消化 dna 模板。
- 对于体外转录, 混合表2后面的成分。
- 要净化 mrna, 请使用 rna 清理试剂盒。
- 用无核酸酶h2o填充 ivt 混合量为100μl。
- 加入350μl 的裂解缓冲液, 通过上下移液混合。
- 加入250μl 的100% 乙醇, 再混合。将混合液移到清理列中。
- 以 8, 000 x克的速度离心 15秒, 并丢弃滤液。
- 将洗涤缓冲液的500μl 加入柱中, 以 8, 000 x克的速度再次离心 15秒, 并取出滤液。
- 用500μl 的洗涤缓冲液和离心机清洗1x 柱 2分钟, 8, 000 x 克。
- 将色谱柱移动到一个新鲜的 1.5 ml 反应管中。通过在柱膜上培养20μl 的无核酸酶h2o, 然后以最大速度进行1分钟离心, 以确保 mrna 的2倍。
- 使用脱磷酸化试剂盒从 mrna 中取出磷酸盐基团。在 mrna 中加入4.5μl 的10倍磷酸酶缓冲液和1μl 磷酸酶, 并在37°c 孵育1小时。
- 再次净化 mrna, 按照步骤 2.5.1-2.5.7。
- 用测光仪测量 mrna 的协调。
- 使用凝胶电泳来分析 mrna 的纯度和大小。因此, 准备一个琼脂糖凝胶, 如步骤 2.3.9-2.3.10 中所述。
- 将喷洒酰胺3.3μl、37% 甲醛1μl、10倍单片染料1μl 和6倍负载染料1.7μl 与 200 ng mrna 混合, 并为每个样品和 rna 标记用无核酸酶2o 填充至多10μl。
- 在65°c 下将混合物培养 10分钟, 以实现 mrna 变性。用 mrna 和 rna 标记加载凝胶的井, 并在 100 v 处运行凝胶1小时。
- 使用具有紫外线的凝胶文档站对凝胶进行分析。
3. 合成 mrna 的复杂性
- 在打开试管前不久, 在冰上解冻合成的 mrna, 使其变热, 然后离心机。
- 将10μl 合成 mrna (mrna 浓度为 100ngμl) 与1μl、2.5μl、5μl、10μl 或20μl 的 nlp 悬浮液 (nlp 浓度为 3mg/ml) 混合。在室温 (rt) 下进行短暂离心和孵育 20分钟, 形成纳米橄榄石。
注意: 不要通过移液混合。这可能会导致体积损失。涡旋很快为彻底混合。 - 在纳米细胞层数中加入1毫升的常规细胞培养基, 并通过上下移液混合。
4. 纳米脂质体的包封效率分析
- 要执行封装实验, 请使用 rna 定量试剂盒。
- 通过稀释荧光染料1:200 进行高范围处理和1:2000 低范围测定, 准备工作溶液。
注意: 在冰上解冻荧光染料。使用前直接准备工作解决方案。 - 使用 egfp mrna 的2μgml 库存溶液在无核酸酶 h2o 中的 1 ml, 制备高范围和低范围的标准曲线。
注意: 对于标准曲线, 请使用将用于封装实验的 mrna。 - 使用表 3制备高范围标准 (20 ng/mL μgml)。
- 对于低范围标准, 稀释 2μgl egfp 库存溶液 1:20, 最终浓度为 100 ngml。如表 4所示, 准备一个低范围标准 (1 ngl-50 ngml)。
- 将1微克的 egfp mrna (10μl) 和7.5 微克的 nlps (2.5μl) 混合在一起, 在 rt 孵育20分钟。
注意: 将 mrna 放在冰上, 以避免降解。 - 加入1毫升无核酸酶的h2o, 形成纳米橄榄树, 上下移液混合。
- 在封装的样品和标准中加入1毫升的1:200 或 1:2000 rna 荧光染料工作溶液, 并在黑暗中在 rt 孵育5分钟。
- 将标准和样品以复制的形式输送到96孔的黑色板, 并在微板读取器上测量 530 nm 处的荧光 (图 3)。
5. 转染细胞的制备
- 转染前 12井板 1 d 的板 1.5 x 10 5 a549 地窖井。
- 在转染前24小时将细胞在37°c 和 5% co2 的常规细胞培养基中 (dmm2 高血糖与10% 的胎牛血清 [fbs]、2 mm l-谷氨酰胺、1% 的 penicilin·链霉素) 中培养 24小时.
6. 细胞的转染
- 用 1 mlwell pbs 清洗准备好的细胞 1x (不含 ca2 +/mg2 +)。
- 将制备的纳米 plex 混合物添加1毫升, 其中含有1μg 的 egfp mrna, 封装成1μl、2.5μl、5μl、10μl 或 20μl nlps, 加入制备的带有 a549 细胞的板材的一个井。
- 将纳米颗粒悬浮液加入细胞, 在常规条件下孵育 24小时, 分析转染效果, 或在24小时和72小时内分析转染后的细胞活力。
注意: 使用 nlps 进行转染不需要进行介质更改。
7. 流式细胞仪和荧光显微镜对细胞转染效果的分析
- 取出上清液, 用 1 mlwell pbs (不含 ca2 +mgg2 +) 清洗细胞, 取出剩余的 nlps。
- 准备流式细胞仪的细胞。
- 在37°c 时, 用 500μl/井胰蛋白酶 edta (0.05%) 对细胞进行胰蛋白酶化 3分钟, 通过添加相同数量 (500μl/well) 的常规 fbs 介质来停止过程并灭活胰蛋白酶。
- 在 400 x g处离心细胞 5分钟, 并在不接触细胞颗粒的情况下小心去除上清液。
- 用1毫升的 pbs 清洗细胞 (不含ca 2 +/mg2 +)。
- 将细胞重新注入30μl 的1x 固定溶液中, 并将细胞转移到流式细胞仪中。
- 在流式细胞仪中分析 488 nm 的细胞 (图 4 a)。
注: 在测量前, 细胞的涡旋为1x。
- 准备用于荧光显微镜的细胞。
- 用 1 mL/well 100% 甲醇固定细胞, 该甲醇以前储存在-20°c。
- 加入溶解在 pbs 中的 500μl/well 300 nm dapi (4 ', 6-二胺-2-苯二酚) (不含 ca2 +/mg2 +), 在黑暗中孵育5分钟。
- 取出 dapi 溶液, 然后在-20°c 下储存100% 甲醇, 再次清洗细胞。
- 使用荧光显微镜分析细胞 (图 4b)。
注: 使用以下发射波长: egfp 488/509 nm、dapi 358/461 nm 和 cy3 550/570 nm。
8. 细胞活力检测
- 在 rpmi (不含苯酚红色) 1 毫升中溶解5毫克的 mtt (3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基)-2, 5-二苯基四唑溴铵)。
注: 溶解的 mtt 在使用前必须在 rpmi 中进一步稀释 1:10 (最终浓度: 0.5 mg/ml)。 - 用 1 mlwell pbs 清洗转染细胞 3x (不含 ca2 +/mg2)。
注意: 应完全取出常规细胞培养基的遗骸。 - 在细胞中加入 500μl/well 1:10 稀释 mtt 溶液, 在37°c 下孵育4小时。
- 孵育后从细胞中取出 mtt 溶液, 加入 500μlwell dmso (二甲基亚硫酸盐)。在37°c 下再次孵化10分钟。
- 将 dmso 溶液移入三胞胎96孔板, 并使用微板读取器测量540纳米的吸附量。
- 将未处理细胞的活力设置为 100%, 并与未处理的控制细胞进行比较, 计算其他组的细胞活力 (图 5)。
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Representative Results
利用该协议, 采用干膜法制备了由脂质 dc-胆固醇和 dope 组成的 nlps (图 1)。在制备过程中, 纳米脂质体溶液显示浊度的不同阶段 (图 2)。
然后, 通过使用 rna 定量试剂盒 (图3) 分析未封装的 mrna 的自由量, 可以分析 nlps 的封装效果。
在不同的 nlps 中包封 egfp mrna 后, 形成的纳米絮凝体可以体外与细胞孵育, egfp 表达细胞的百分比可以用流式细胞仪进行24小时转染后分析 (图 4 a).即使是1μl 的纳米脂质体溶液也足以在体外实现细胞的高转染。当细胞转染含有 cy3 标记 transfected mrna 的 nlps 时, 可以将 transfected mrna 在细胞质 (红色荧光) 中的存在以及已经产生的 transfected 蛋白 (绿色荧光) 可视化 (图 4b)。
由于使用纳米橄榄细胞的细胞转染会对细胞产生不利影响, 因此对细胞的活力进行了 24小时 (图 5a) 和 72小时 (图 5A) 转染后的测试。用2.5 或5μl 的 nlps 或纳米橄榄细胞分别处理细胞时, 对细胞活力没有影响。
图 1: 阳离子纳米脂质体制造工艺示意图概述.首先, 溶解的脂质 dc 胆固醇和 dope 应混合在一起在一个玻璃瓶。其次, 可见氯仿液体应在氩或氮气流动下蒸发, 氯仿残渣应允许在真空中夜间蒸发。第三, 玻璃瓶底部形成的脂膜应与无核酸酶h2o补水, 然后进行涡旋, 形成多状脂质体。通过对脂质体溶液的超声和挤出, 得到了现成的单环素 nlps。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 纳米脂质体溶液在制造过程中处于不同阶段.(a) 此图显示脂质体溶液在脂质膜补液后直接进行15分钟的涡流, 以及 (b) 在超声浴 (c) 1小时后, 然后进行25个挤压周期.请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 纳米脂质体的包封效果.该面板显示了在 nlps 中封装后游离 egfp mrna 的定量。结果以±sem (n = 3) 的形式给出。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 纳米橄榄体的转染效果.(a) 该面板显示了使用不同数量的 nlps 封装1微克 transfection mrna 24小时转染后转染的最佳 mrn·脂质体比的测定。(b) 该面板显示检测到的 cy3 标记的合成 mrna 封装在 2.5μl nlps 中, 以及细胞转染后 24小时 (刻度柱 = 50μm) 中的 egfp 表达。结果以±sem (n = 3) 的形式给出。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 纳米脂质体转染后细胞活力和包封 mrna.该面板显示使用 mtt 检测 (a) 24小时和 (b) 72小时后测量细胞活力。结果以±sem (n = 3) 的形式给出。请点击这里查看此图的较大版本.
| 步 | 温度 (°c) | 时间 |
| 1 | 95 | 5分钟 |
| 2 | 94 | 15秒 |
| 3个 | 55 | 1分钟 |
| 4个 | 72 | 1分钟 |
| 5 | 转到 2 30 x | |
| 6 | 72 | 10分钟 |
| 7。 | 4个 | 按住 |
表 1: dna 扩增的 pcr 循环协议。
| 浓度 | 量 | |
| Atp | 7, 500万 | 4μl |
| gtp | 1, 875 mm | 1μl |
| 5 '-甲基环胺 | 7, 500万 | 3μl |
| 7, 500万 | 3μl | |
| 方舟 | 2, 500万 | 10μl |
| dna 模板 | 1.5 微克 | |
| 缓冲混合 | 1个 | 4μl |
| t7 酶混合物 | 4μl | |
| RNase-Inhibitor | 1μl | |
| 无核酸酶水 | 最多填充40μl | |
表 2:混合的体外培养dna 转录到 mrna.
| 无核酸酶的体积 h2o (μl) | egfp mrna 高范围库存溶液 (μl) 的体积 | 体积1:200 荧光染料 (μl) | 最终浓度 (ngml) |
| 0 | 100元 | 100元 | 1000元 |
| 50 | 50 | 100元 | 500元 |
| 90 | 10 | 100元 | 100元 |
| 98 | 2 | 100元 | 20 |
| 100元 | 0 | 100元 | 空白 |
表 3:高范围标准曲线的协议.
| 无核酸酶的体积 h2o (μl) | egfp mrna 低范围库存溶液 (μl) 的体积 | 体积1:2000 荧光染料 (μl) | 最终浓度 (ngml) |
| 0 | 100元 | 100元 | 50 |
| 50 | 50 | 100元 | 25 |
| 90 | 10 | 100元 | 5 |
| 98 | 2 | 100元 | 1 |
| 100元 | 0 | 100元 | 空白 |
表 4:低范围标准曲线的协议.
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Discussion
该协议描述了具有高封装效果的 nlps 的生成, 以合成改性 mrna, 以及细胞在体外的可靠转染。此外, nlps 保证 mrna 的释放, 而 mrna 又被转化为细胞内的功能蛋白。此外, 使用 nlps 的转染可以在常规细胞培养基中进行, 从而在转染过程中产生较高的细胞振动, 并在转染后最多持续三天。
使用 mrna 作为治疗, 自组装系统为其交付的首选。最常见的转染试剂包括阳离子脂质, 包括脂质体。由于脂质体带正电荷, 带负电荷的核酸可以封装在其中, 从而克服细胞膜的静电排斥 35.阳离子脂质 dc 胆固醇已经被描述为一个稳定和生物相容性的车辆36。加入中性脂质 dope 可提高转染效果37。考虑到上面提到的优点, 选择这些脂类用于制备 nlps。此外, 以前的研究表明, 使用这两个脂类比其他更可取, 因为负电荷核酸38的细胞转染率增加.
对于成功生成 nlps 和纳米橄榄体来说, 对其中的一些步骤给予格外关注至关重要。纳米脂质体的产生过程应在无氧2条件下进行。在 nlp生成过程中存在 o2 会导致磷脂的降解和可重复性降低 39。此外, 尽管进行了修改, mrna 对通过核酸酶降解非常敏感。因此, 对于脂膜的补液, 强烈建议使用无 rnase 的 h2o, 以防止在络合过程中 mrna 降解.此外, 应确保纳米橄榄树的储存条件不含 rnase。
此外, 由于热力学系统的不稳定, nlps 可以随着时间的推移形成聚集体。影响参数包括脂质体40的储存温度和表面电荷。nlp 聚集可能导致脂质体膜的不稳定和不良的 mrna 释放41的风险, 导致转染效果差和 mrna 降解在细胞外空间。然而, 如前所示, 纳米橄榄体可以在4°c 下储存长达 6个月, 而不会聚集或失去转染效果35。
利用脂质体作为药物载体系统, 可以解决药物输送的两个关键问题。脂质体保护包封药物不降解, 并能够被动地靶向内皮不连续的组织, 如肝脏或骨髓16。对于治疗性核酸的传递, 颗粒大小和封装能力等参数对于脂质体载体的评估和细胞吸收至关重要。特别是, 脂质体的大小在纳米尺度允许与细胞膜相互作用42并且, 因此, 重要为在体内使用以后。首先, 脂质体应足够小, 以避免通过肾脏和肝脏系统清除43。其次, 脂质体的大小应有助于克服血管的障碍, 以目标所需的器官的细胞。据报道, 在 100-300 nm 的大小范围内的脂质体能够有效地转染肝细胞44;然而, 大型脂质体 (例如, 400 纳米) 无法克服内皮屏障45。
虽然所述方法已建立用于 mrna 的传递, 但它也可用于其他核酸疗法, 如微 rna。在最近的一项研究中, 我们证明微 rna 126 可以有选择性地靶向, 因此, 腹主动脉瘤的发展可以有效地防止46。由于 dnaa/rna 疗法会引起副作用, 如血小板活化, 当它们与细胞直接接触时, 脂质体内的包装可以避免这种情况, 从而使其进一步有利 47.因此, 这里提出的方法用途广泛, 可用于设计许多疾病的药物输送。所建立的协议不仅允许快速和具有成本效益地生成具有定义大小的高效 mrna 载体, 而且还提供了根据特定应用的需要定制脂质配方的可能性: (1)脂质体可以很容易地通过改变过滤器进行改变;(2) 在体内应用48中, 可以使用聚乙二醇等方法对带正电荷的脂质体表面进行改性, 以提高稳定性, 延缓血液清除.将特定抗体结合到脂质体中, 可以有针对性地传递包封药物49。通过进一步的检查和对物理性质的更详细的洞察, 协议仍可能得到改进。
对于脂质体的产生, 有三种常用的方法: 干膜、乙醇注射和反相蒸发。在杨等人的《研究表明, 这三种制造技术有35种。研究发现, 采用干膜法可以生成具有定义尺寸和溶液中均匀分布的脂质体。此外, 本研究中进行的干膜过程导致了具有规定的200纳米大小、均匀分布和高封装能力的 nlps 的生产。
一方面, 脂质体的正电荷导致封装能力的提高和更好的细胞表面融合50、51、52, 但另一方面, 它可能会破坏细胞膜的稳定并激活不同的免疫激活途径和细胞死亡27,53。然而, 利用辅助脂质 dope 54,55 可以最大限度地减少阳离子脂质的凋亡特性。在张等人的研究中发现, 在脂质体产生过程中, dc 胆固醇和 dope 的1:2 比例导致使用核酸38进行最有效的细胞转染.在本研究中采用的方法中, 在脂膜制备过程中, 将 1:2 dc-胆固醇和 dope 的脂质比应用于混合脂质悬浮液中, 制备的脂质体具有较高的转染效果, 同时具有较高的细胞。可行性。其他研究人员也发现了类似的结果, 如 ciani56 和farhood37。
总体而言, 脂质体已在临床试验中使用多年,在体内显示出很好的生物相容性和低毒性。与 mrna 相结合, nlps 可用于有效地将 mrna 传递给细胞或器官的体外和体内, 从而诱导所需蛋白质的新合成。在治疗应用方面, 纳米橄榄细胞可用于皮肤 mrna 传递57的伤口愈合补丁, 以激活细胞再生, 或作为 mrna58雾化的喷雾剂, 用于治疗肺疾病59,60如囊性纤维化。
所提出的协议保证了一种使用干膜法生成 nlps 的简单易用的方法, 可用于体外转录 mrna 的有效包封和细胞的安全转染。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
没有
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
| (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
| 4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
| BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
| Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
| Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
| Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
| Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
| Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
| RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
| Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
| Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
| GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
| peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
| Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |
References
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