Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

في الوقت الحقيقي رصد المختبر لتنشيط مستقبلات الرائحة بالرائحة في مرحلة البخار

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59446
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,3,5,6
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences, Duke University

Summary

فسيولوجيا، يتم تنشيط مستقبلات الرائحة من جزيئات الرائحة المستنشقة في مرحلة البخار. ومع ذلك، استخدام معظم النظم في المختبر التحفيز الرائحة الطور السائل. نقدم هنا، أسلوب الذي يسمح للرصد في الوقت الحقيقي في المختبر لتنشيط مستقبلات الرائحة عند التحفيز الرائحة في مرحلة البخار.

Abstract

تصور حاسة الشم تبدأ مع تفاعل أودورانتس مع مستقبلات الرائحة (أو) أعرب عن طريق الخلايا العصبية الحسية حاسة الشم (OSN). ويتبع الاعتراف برائحة مخطط ترميز اندماجي، حيث يمكن تفعيلها أو واحد من مجموعة من أودورانتس والرائحة واحدة يمكن تنشيط مزيج من أملاح الإماهة الفموية. من خلال هذا الترميز اندماجي، يمكن الكشف عن الكائنات الحية وتميز بين عدد وافر جزيئات رائحة متقلبة. وهكذا، يمكن وصف رائحة بتركيز معين عن طريق نمط تنشيط من أملاح الإماهة الفموية، ومحددة لكل رائحة. وبهذا المعني، تكسير الآليات التي يستخدمها الدماغ لإدراك رائحة يتطلب الرائحة فهم-أو التفاعلات. هذا السبب في أن المجتمع أولفاكتيون ملتزمة "دي أورفانيزي" هذه المستقبلات. نظم في المختبر التقليدية المستخدمة لتحديد الرائحة-أو التفاعلات استخدمت تحضين خلية الإعلام مع الرائحة، الذي يختلف عن كشف الروائح عن طريق حل أودورانتس البخار الطبيعي في الغشاء المخاطي للأنف قبل التفاعل مع أملاح الإماهة الفموية. هنا، يمكننا وصف أسلوب جديد يسمح للرصد في الوقت الحقيقي للتنشيط أو عبر مرحلة البخار odorants. لدينا أسلوب يعتمد على قياس الإفراج عن المخيم التﻷلؤ استخدام الإنزيم جلوسينسور. أنه يسد الثغرات الحالية بين النهج المجراة في وفي المختبر، ويوفر أساسا لاستشعار المحاكاة البيولوجية كيميائية المتطايرة.

Introduction

حاسة الشم يسمح الحيوانات البرية للتفاعل مع بيئتها الكيميائية المتطايرة للسلوكيات محرك الأقراص والعواطف. وتبدأ عملية الكشف عن رائحة أساسا، مع تفاعل جزيئات الرائحة الأولى مع نظام حاسة الشم، على مستوى الرائحة مستقبلات (أملاح الإماهة الفموية)1. في الثدييات، وأملاح الإماهة الفموية فردياً يعبر عن حاسة الشم العصبية الحسية (أوسنس) تقع في حاسة الشم ظهارة2. أنها تنتمي لعائلة مستقبلات (GPCR) مقترنة بالبروتين ز وأكثر دقة للأسرة الفرعية مثل رودوبسين (وتسمى أيضا الفئة A). زوجين أملاح الإماهة الفموية وتنشيطية ز البروتين زجبهة تحرير أورومو التنشيط الذي يؤدي إلى إنتاج المخيم متبوعاً بفتح قنوات دوري النوكليوتيدات بوابات وتوليد إمكانات العمل. من المسلم به أن الإدراك رائحة يعتمد على نمط محدد من أملاح الإماهة الفموية المنشط3،4 ويترتب على ذلك الاعتراف برائحة مخطط ترميز اندماجي، حيث يمكن تفعيلها أو واحد من مجموعة من أودورانتس والرائحة واحدة يمكن تنشيط مزيج من أملاح الإماهة الفموية. ومن خلال هذا الترميز اندماجي، افترض أن الكائنات الحية يمكن الكشف عن وأن تميز بين عدد وافر جزيئات رائحة متقلبة. واحد من مفاتيح لفهم كيف تعتبر الروائح أن نفهم كيف والذي يتم تنشيط أملاح الإماهة الفموية من رائحة معينة.

في محاولة لتوضيح الرائحة-أو التفاعلات، في المختبر فحوصات فنية لعبت دوراً أساسيا. تم تحديد مؤثر يغاندس معطر لليتيم أملاح الإماهة الفموية (أو دي أورفانيزيشن) حقل نشط جداً طوال السنوات العشرين الماضية، من خلال استخدام مختلف في المختبر، السابقين فيفو والاختبارات الوظيفية المجراة في5،6،7 ،،من89،10،11،،من1213،14،15،16، 17.

نظم الفحص في المختبر الأنسب لتوصيف وظيفي مفصل من أملاح الإماهة الفموية، بما في ذلك تحديد مجالات وظيفية والبقايا الحرجة من أملاح الإماهة الفموية، فضلا عن التطبيقات الهندسية المحتملة. ومع ذلك، كذلك تطوير نظم القيم في المختبر لأملاح الإماهة الفموية قد تحديا، ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة مع أوسنس تثقيف والتعبير الوظيفي من أملاح الإماهة الفموية في خلايا مغايرة. وكان التحدي الأول وضع البروتوكولات التي تسمح بالتعبير الخلية السطحية من أملاح الإماهة الفموية الفنية في رسم خرائط للرائحة-أو التفاعلات. وقد استخدمت عددا من المجموعات المستقلة مختلف النهج5،6،،من78،9،10،11،12، 14،18،،من1920. أحد إنجازات أقرب كان أدلى بها كروتوورست et al في المعلمة N-المحطة من أملاح الإماهة الفموية مع تسلسل تقصير من رهودوبسن (رو-العلامة) ولاحظ تعبير سطحية محسنة في خلايا الكلي الجنينية البشرية (HEK)13. الاختلافات إلى علامة تعلق على التسلسل أو لا يزال مسار البحث لتحسين أو التعبير ووظائف19،21. سايتو et al. ثم حدد نقل مستقبلات البروتين 1 (RTP1) و RTP2 التي تيسر أو الاتجار. 22 نسخة أقصر من RTP1، يسمى RTP1S، كما تبين أن يكون أكثر فعالية من البروتين الأصلي23. تطوير خط الخلية (Hana3A) الذي يعرب ستابلي زجبهة تحرير أورومو، REEP1، RTP1، و RTP2 24، مقترنة باستخدام الصحفيين دوري الادينوسين الأدينوزين (معسكر) قد مكن تحديد الرائحة-أو التفاعلات. ما زال يتعين تحديد الآلية التي تعزز الأسرة RTP البروتينات التعبير الخلية السطحية من أملاح الإماهة الفموية.

التحذير واحد من هذه الأساليب المتبعة أنها تعتمد على تحفيز الرائحة في الطور السائل، بمعنى أن أودورانتس تذاب مسبقاً إلى وسيلة تحفيز وتنشيط الخلايا بالاستعاضة عن المتوسط. هذا متميز جداً من الظروف الفسيولوجية حيث يصل إلى ظهارة حاسة الشم في مرحلة البخار جزيئات الرائحة وتنشيط أملاح الإماهة الفموية بانحلال في الغشاء المخاطي الأنفي. أكثر شبهاً التعرض الحوافز ذات الصلة الفيزيولوجية، اقترح سانز et al.20 مقايسة استناداً إلى تحفيز البخار بتطبيق قطره حل الرائحة معطلاً تحت الوجه الداخلي للفيلم البلاستيك توضع على رأس الخلية الآبار. أنها سجلت الردود الكالسيوم عن طريق رصد كثافة الأسفار. هذا الأسلوب كان الأول من استخدم الهواء-المرحلة الرائحة التحفيز، ولكن لم تسمح بفرز كبيرة للتنشيط أو.

وهنا، قمنا بتطوير أسلوب جديد يتيح للرصد في الوقت الحقيقي في المختبر أو التنشيط عن طريق حفز الرائحة مرحلة البخار بمقايسة جلوسينسور (الشكل 1). وقد استخدمت هذه المقايسة سابقا في سياق الرائحة السائل التحفيز18،19،25،26،27،،من2829، 30 , 31-قاعة الرصد لومينوميتير هو اكويليبراتيد أولاً مع الرائحة يتبخر قبل لوحة القراءة (الشكل 1أ). جزيئات الرائحة، ثم ومذاوبة إلى المخزن المؤقت، والاستحمام الخلايا Hana3A التعبير عن أو الفائدة، RTP1S والبروتينات جلوسينسور (الشكل 1ب). إذا كانت الرائحة مؤثر أو، أو سوف التبديل إلى تكيف المنشط وربط مجموعةجبهة تحرير أورومو، تفعيل adenylyl cyclase (AC)، وتسبب في نهاية المطاف إلى ارتفاع مستويات المخيم. سيتم ربط هذا المخيم ارتفاع وتنشيط البروتين جلوسينسور لتوليد التﻷلؤ تحفيز لوسيفرين. ثم يتم تسجيلها لومينوميتير هذا التﻷلؤ ويتيح رصد أو التنشيط. هذا الأسلوب لفائدة عالية في سياق ديورفانيزيشن أو أنه يجلب في المختبر أنظمة أقرب إلى تصور الطبيعية من الروائح الكريهة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-Hana3A خلايا الثقافة

  1. إعداد M10 (الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (MEM) زائد 10% v/v مصل الدم البقري الجنين (FBS)) و M10PSF (M10 بالإضافة إلى 100 ميكروغرام/مل البنسلين-ستربتوميسين و 1.25 ميكروغرام/مل الامفوتريسين ب).
  2. ثقافة الخلايا في 10 مل M10PSF في صحن ثقافة خلية 100 ملم في حاضنة في غاز ثاني أكسيد الكربون (CO2) 37 درجة مئوية و 5 في المائة.
  3. تقسيم الخلايا كل يومين بنسبة 20%: عند التقاء 100 ٪ من الخلايا (حوالي 1.1 × 107 خلايا) يلاحظ تحت مجهر مرحلة-على النقيض، تطمح وسائل الإعلام وغسل الخلايا بلطف مع 10 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS).
  4. نضح برنامج تلفزيوني وأضف 3 مل من 0.05% التربسين الإثيلين diamine tetraacetic حمض (يدتا، 0.48 ملم). ترك العمل لمدة 1 دقيقة تقريبا، حتى فصل الخلايا من اللوحة.
  5. إضافة 5 مل M10 إلغاء تنشيط التربسين وفي نهاية المطاف فصل الخلايا لا تزال تعلق على اللوحة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  6. نقل وحدة التخزين (8 مل) إلى أنبوب 15 مل والطرد المركزي في 200 x ز لأدنى 5 Aspirate المادة طافية وريسوسبيند الخلايا إلى 5 مل M10PSF من بيبيتينج صعودا وهبوطاً لكسر أي خلية الشامل. تجنب خلق الفقاعات في الأنبوب.
  7. نقل 1 مل الحل حراكه الخلايا في طبق ثقافة خلية 100 ملم جديدة وإضافة 9 مل M10PSF جديدة. احتضان CO 37 درجة مئوية و 5%2.

2-إعداد الخلايا تعداء

  1. تقييم الالتقاء، أو العدد من الخلايا، بمراقبة لهم تحت مجهر تباين مرحلة. على الأقل التقاء 10% (حوالي 1.1 × 106 خلايا) هناك حاجة للوحة واحدة.
  2. نضح وسائط الإعلام وغسل الخلايا بلطف مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. نضح برنامج تلفزيوني وأضف 3 مل يدتا. ترك العمل لمدة 1 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة، حتى فصل الخلايا من اللوحة.
  3. إضافة 5 مل M10 إلغاء تنشيط التربسين وفي نهاية المطاف فصل الخلايا لا تزال تعلق على اللوحة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. نقل وحدة التخزين (8 مل) إلى الأنبوبة 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق.
  4. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا إلى 5 مل M10PSF من بيبيتينج صعودا وهبوطاً لكسر أي خلية الشامل. تجنب خلق الفقاعات في الأنبوب.
  5. اعتماداً على عدد اللوحات تكون ترانسفيكتيد، نقل مبلغ مناسب للخلايا في خزان مع حجم المقابلة المناسبة M10PSF. وينبغي أن مطلي لوح واحد 96-جيدا مع 1/10 صحن المتلاقية 100 مم 100% (حوالي 1.1 × 106 خلايا) المخفف في M10PSF للوصول إلى إجمالي حجم 6 مل. لوحة 96-بئر واحدة بدءاً بطبق التقاء 100% 100 مم، إضافة 500 ميليلتر من 5 مل خلايا حراكه إلى 5.5 مل M10PSF جديدة. مزيج الخلايا و M10PSF دون توليد فقاعات الهواء.
  6. "الماصة؛" 50 ميليلتر من الخلايا مع وقف التنفيذ في كل بئر من لوحة 96-جيدا ماصة متعددة باستخدام. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO2.

3-بلازميد تعداء

  1. مراقبة لوحة 96-البئر تحت مجهر مرحلة عالي تباين لضمان التقاء خلية بين 30% و 50%.
  2. إعداد مزيج تعداء أول يحتوي على والبلازميدات المشتركة إلى لوحة كاملة (RTP1S، أو والبروتين جلوسينسور، انظر الجدول للمواد) التالية وحدات التخزين في الجدول 1. لاحظ أن الكمية من معلم رو أو ينبغي أن يكون مقسوماً على عدد من أملاح الإماهة الفموية إذا عدة أملاح الإماهة الفموية.
    ملاحظة: ونحن بقوة المشورة لإضافة عنصر سلبي متجه فارغة (هنا رو-pCI) وأي رقابة إيجابية (المعروفة أو الاستجابة للرائحة المجربة) لخطة التجربة.
  3. إعداد مزيج تعداء ثانية التي تحتوي على 500 ميليلتر من MEM و 20 ميليلتر من كاشف ليبوفيكتاميني 2000 (صالحة للوح واحد 96، حسنا، انظر الجدول للمواد). إضافة هذا المزيج الثاني إلى أول واحد، وتخلط بلطف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة 5 مل M10 وتخلط برفق.
  4. استبدال M10PSF في لوحة 96-بئر بلاتيد سابقا من 50 ميليلتر من وسائط الإعلام تعداء النهائية. احتضان مجموعة حاضنة إلى 37 درجة مئوية و 5% CO2 وفراغ الدائرة بالتالي بين عشية وضحاها luminometer الإجراء هو موضح في الخطوة 6.

4-الركيزة الحضانة

  1. مراقبة لوحة 96-البئر تحت مجهر مرحلة عالي تباين لضمان التقاء خلايا بين 60% و 100%. تعد حلاً تحفيز من موازنة الملح الحل (حبس هانك) تحتوي على 10 ملم من حمض بيبيرازينيثانيسولفونيك هيدروكسيثيل (حبيس) و 5 ملم د-الجلوكوز.
  2. تمييع ميليلتر 75 من الكاشف المخيمات (انظر الجدول للمواد) حل لمل 2.75 الحل التحفيز. إزالة المتوسطة تعداء من لوحة 96-جيدا وغسل الخلايا بإضافة 50 ميليلتر من التحفيز الطازجة الحل لكل بئر.
  3. إزالة الحل التحفيز وإضافة 25 ميليلتر من الحل كاشف معسكر إعداده في الخطوة 4، 2 لكل بئر. احتضان لوحة 96-جيدا في درجة حرارة الغرفة في بيئة مظلمة وخالية من رائحة (على سبيل المثال، درج فارغة نظيفة بعيداً عن المواد الكيميائية أو أي مصدر الرائحة) ح 2.

5-الرائحة التحفيز

  1. أولاً، حجته قاعة luminometer مع جزيئات الرائحة متقلبة. تمييع الرائحة إلى التركيز المطلوب في 10 مل من الزيوت المعدنية (الشكل 2أ). قبل نهاية فترة الحضانة كاشف المخيم، إضافة 25 ميليلتر من الحل الرائحة في صفيحة 96-بئر جديدة (لا واحدة تحتوي على الخلايا). احتضان هذه اللوحة الرائحة في درجة حرارة الغرفة في قاعة لومينوميتير لمدة 5 دقائق (الشكل 2ب) (لا تسجيل لومينوميتير مطلوب هنا).
  2. تعيين لومينوميتير لتسجيل التﻷلؤ مع 0 s تأخير خلال دورات 20 لوحة القياس 90 s مع 0.7 s من الفترة الفاصلة بين الدورات.
  3. حق قبل قراءة اللوحة، إزالة لوحة الرائحة من الدائرة. إضافة 25 ميليلتر من الرائحة بين الآبار لصفيحة 96-كذلك تحتوي على الخلايا (لا تقم بإضافة الرائحة في الآبار التي تحتوي على الخلايا) وسرعة بدء القياس التﻷلؤ لجميع الآبار للدورات 20 ضمن 30 دقيقة (الشكل 2-ج).

6-إزالة الرائحة المتبقية داخل لومينوميتير

  1. فتح باب لومينوميتير. إدراج أنبوب متصل بمضخة فراغ.
  2. أودورانتس فراغ في القراءة الدائرة على نطاق واسع (على الأقل 2 حاء، ويفضل أن يكون ذلك بين عشية وضحاها) بين أودورانتس اثنين لتجنب التلوث المتبادل للتطاير رائحة من تجربة واحدة إلى آخر. استبدال بالهواء النقي بإرسال الهواء المضغوط خلال 5 دقائق قبل تفرخ الرائحة القادمة.

7-بيانات التحليل

  1. تصدير البيانات من البرنامج لومينوميتير.
  2. متوسط replicates لنفسه أو لكل وقت التسجيل. حساب متوسط الاستجابة أو طبيعية لأي تحكم في نهاية المطاف (مثلاً، متجه فارغة و الشكل 3ألف وقسم النتائج الممثل) بقسمة قيمة عنصر التحكم في المتوسط إلى أو القيمة في كل مرة تسجيل (الشكل 3ب وقسم النتائج التمثيلية).
  3. تطبيع أو استجابة كل نشاطهم القاعدية بقسمة رد أو متوسط 0 s لكل استجابة وقت التسجيل (انظر الشكل 3ج وقسم النتائج التمثيلية).
  4. حساب المساحة تحت المنحنى لكل أو للحصول على قيمة أو استجابة واحدة. للقيام بذلك، مجموع كافة قيم التﻷلؤ في كل مرة تسجيل لكل أو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نحن فحص الاستجابة لثلاثة من الماوس أملاح الإماهة الفموية و Olfr746 و Olfr124 و Olfr1093 باستخدام سينمالدهيد بخار التحفيز (الشكل 3). في نفس الوقت، كنا ناقلات فارغة (رو-pCI) لضمان أن الأنشطة المستحثة بالرائحة من أملاح الإماهة الفموية اختبارها كانت محددة (الشكل 3أ). وكان التنشيط في الوقت الحقيقي من أملاح الإماهة الفموية إلى التحفيز الرائحة بخار رصد قياس أكثر من 20 دورة. بيانات كل جيدا تم أولاً تطبيع إلى قيمة عنصر التحكم في المتوسط متجه فارغة لكل دورة (الشكل 3ب). من المهم أن نلاحظ أن أملاح الإماهة الفموية يمكن أن تظهر مستويات متغيرة من النشاط القاعدي في هذا التحليل بطريقة تعتمد على أو ويمكن أن يكون هاما لتطبيع أيضا استجابتهم لهذه المعلمة (الشكل 3ج). يمكن تقسيم قيمة متوسط OR ردها عند t = 0 ثانية، مما يسمح بمقارنة بين أملاح الإماهة الفموية. كما تكون قيم التنشيط واحد لكل أو يمكن حسابها عن طريق حساب المنطقة تحت المنحنى (AUC) لكل منهما أو بجمع كافة القيم دورة القياس (الشكل 3د).

بالإضافة إلى ذلك، يمكن قياس الاستجابات تعتمد على الجرعة باستخدام هذا الأسلوب باستخدام جرعات الرائحة المتزايد. نحن نقدم استجابة Olfr1377 لتحفيز acetophenone سجلت اتباع نفس الإجراء (الشكل 4). تقلب أسيتوفينوني يمكن تقييمه بأن ضغط البخار، أي ما يعادل 0.44 مم زئبق عند 25 درجة مئوية. عند درجة حرارة معينة، الرائحة حيازة ضغط بخار أعلى أكثر تقلباً من الرائحة ذات ضغط بخار أقل. أسيتوفينوني، ونتيجة لذلك، الرائحة متقلبة معتدلة ويتعرض للخلية نقية والمخفف في 10-2، 10-4، 10-6 و 10-8. إلا تركيزات أعلى ثلاثة (الصرفة، 10-2 و 10-4) قادرة على تنشيط Olfr1377 (الشكل 4أ). يمكن أن نلاحظ أيضا أن تنشيط مجمع نقية يظهر اتجاها نحو الانخفاض استجابة أو خلال الوقت، يرجح أن سبب سمية الخلية، كما أنه ثبت الاوجينول في منشور مؤخرا32. ومع ذلك، يمكن أن نلاحظ سلوك تبعية جرعة نموذجية من Olfr1377 (الشكل 4ب)، تبين أن هذه الطريقة يمكن استخدامها أيضا لتحديد EC50 من أو إلى مجمع متقلبة.

لاحظ أنه عندما يتم إجراء تجارب تعتمد على الجرعة، نحن لا فراغ نظيفة قاعة luminometer. ومع ذلك، تجري التجارب دائماً من انخفاض لجرعات عالية، وتزايد الرائحة للتقليل من التلوث. علاوة على ذلك، نظراً لتركيز جزيئات الرائحة في وسائط الإعلام خلية الحقيقي غير معروف، EC50s التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة ليست بالضرورة مشابهة لتلك التي حصل عليها تحفيز السائل. القيم EC50 مصممة بالطريقة تأخذ في الاعتبار تقلب الرائحة، حركية انحلال الرائحة إلى المتوسطة، الذوبان الرائحة، والتقارب بين الرائحة وكانت، التي هي أقرب إلى تصور رائحة طبيعية. على سبيل المثال لدينا من التحفيز Olfr1377 أسيتوفينوني، هي القيمة EC50 من ردنا الجرعة بخار ميكرومتر 161 (0.001874%)، وهي حوالي 50 إضعاف أعلى من تحفيز السائل (ميكرومتر 3.28 من سايتو et al.6). كما ذكرت هذا الفرق بين التحفيز سائل وبخار سانز et al.20 في المقايسة التحفيز البخار حيث أعطى التحفيز بخار 100 إلى 1000 إضعاف قيم EC50 أقل مما حفز السائل.

Figure 1
الشكل 1 : مبدأ الرصد في الوقت الحقيقي لتنشيط مستقبلات الرائحة بالرائحة فابوريد. تم وضع (A) لوحة 96-جيدا في الفعل متوازن مع الدائرة luminometer رائحة (سحابة فوق البنفسجية). (ب) ويتبخر الرائحة جزيئات (البنفسجي) على السطح من المخزن المؤقت وسائل الإعلام خلية حله إلى أن تصل إلى تجويف أو، على سطح غشاء الخلية Hana3A. وكان transfected البروتين التبعي RTP1S (رمادي) كذلك، لصالح تعبير أو سطح الخلية. إذا كان جزيء الرائحة مؤثر أو، أو تحولت إلى حالة تنشيط وملزمة زجبهة تحرير أورومو، تسبب في تنشيط adenylyl cyclase (AC) وإنتاج سيكليك أمبير (مخيم؛ الأخضر). بروتين جلوسينسور (لوسيفراس) تمتلك موقع ملزمة لمعسكر المنضم، مرة واحدة، يسمح للبروتين لضم أن يجند، لوسيفرين (أصفر). النهائي المعقدة جلوسينسور البروتين/لوسيفرين/المخيم أنتجت التﻷلؤ التي تم تسجيلها لرصد أو التنشيط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : البروتوكولات التخطيطي للرصد في الوقت الحقيقي لتنشيط مستقبلات الرائحة بالرائحة فابوريد. وكان المخفف الرائحة (البنفسجي) في التركيز المطلوب في الزيوت المعدنية (A). وكان مطلي الحل ثم إلى لوحة 96-البئر جديدة، التي تم وضعها في قاعة لومينوميتير لمدة 5 دقائق حجته وحدة التخزين ذات الرائحة فابوريد قبل رصد لوحة 96-بئر ترانسفيكتيد (ب). كان بيبيتيد الحل الرائحة في كل مساحة بين الآبار لصفيحة 96-بئر transfected (انظر التكبير). وكان اللوحة ثم قراءة لدورات 20 في قاعة luminometer اكويليبراتيد الرائحة بخار (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : مثال للتطبيع التي يمكن أن يؤديها بعد تسجيل البيانات- تم إدراج عنصر التحكم (A) موجه فارغ (السلبية) في خطة تعداء ليتمكن من تحديد أي التنشيط رائحة معينة أو غير المحتملة للخلايا. كما أنها قدمت معلومات عن التﻷلؤ خلفية اللوحة. (ب) كان تطبيع استجابة "كل أو" ثم بقسمة قيمة الانبعاث لكل بئر متوسط القيمة لناقل التحكم في كل لوحة. وبلغ متوسط قيم التﻷلؤ كل أو كانت ثم على طول دورات القياس. (ج) أو يمكن أيضا ثم تطبيع الردود إلى نشاطهم القاعدية بمواصلة تقسيم كل دورة قيمة بقيمة متوسط دورة 1st القياس (t = 0 s). أوك (د) يمكن أن تحسب بجمع قيم الانبعاثات لكل دورة من دورات القياس. باء وجيم ودال، تمثل مجالات الخطأ الخطأ المعياري للوسط (وزارة شؤون المرأة، n = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . مثال لاستجابات تعتمد الجرعة التي تم الحصول عليها باستخدام الأسلوب. تم تسجيل (A) رد Olfr1377 على أسيتوفينوني لتخفيف مختلفة خمسة في الزيوت المعدنية (10 10-6، 10-4، 10-8،0، 10-2)، ودون الرائحة (0)، وتطبيعها بعد بروتوكول التطبيع هو مبين في الشكل 3. (ب) البيانات أثناء أخذ القياس دورات ترجم إلى قيمة أوك لكل تخفيف. وقد تم تعديل هذا الرقم من كيداً et al.32. هذا الرقم مرخص تحت الإبداعي العموم الإسناد 4.0 الدولية (نسخة من 4.0). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط (وزارة شؤون المرأة، n = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

كل لوح 96-جيدا
ذاكرة 500 ميليلتر
بجلوسينسور 10 نانوغرام
RTP1S 5 نانوغرام
أو 75 نانوغرام

الجدول 1: مزيج تعداء. كميات من البلازميدات (البروتين جلوسينسور، RTP1S واو) إضافة إلى MEM ترانسفيكت على لوح واحد 96-جيدا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الإحساس برائحة تعتمد اعتماداً أساسيا على التفعيل لأملاح الإماهة الفموية. ونتيجة لذلك، فهم وظيفة كل منها مطلوب للقضاء الآليات المعقدة التي تستخدم الدماغ لإدراك بيئتها الكيميائية المتطايرة. ومع ذلك، قد أعاق فهم هذه العملية الصعوبات في إنشاء وسيلة قوية الشاشة أو مرجع للحصول على وظائف ضد أودورانتس في المختبر. خلية التعبير السطحي ومغايرة لأملاح الإماهة الفموية وقد تم حل جزئيا بإنشاء كلمات مستقبلات13،19 والاكتشاف والاستغلال الأمثل للبروتينات مستقبلات والنقل (رتبس) أعرب في أوسنس22 , 23-ثم ظهرت دراسات الفحص الأولى، تقديم رؤى جديدة إلى فهمنا للدالة أو مثل هذه الرائحة الاعتراف بنمط6،7،26،33، التنشيط إليه34،35، هيكل تريديمينسيونال النظرية36،37، تطور38،39، رائحة مساحة40،41، 42، وآثار في رائحة الكشف43،44،،من4546. ونحن نعتقد أن تحسين الأساليب في المختبر يمكن أن يعزز فك الترميز رائحة. على هذا النحو، وضعنا هنا مقايسة وظيفية جديدة للسماح برصد جزيئات الرائحة يتبخر أو التنشيط.

أن نجاح هذا الأسلوب يعتمد على عدة خطوات حاسمة. وبالرغم من تحسن في السنوات الأخيرة، يظل تعبير مغايرة لبعض أملاح الإماهة الفموية الصعبة، التي قد تؤثر على الاستجابة أو للرائحة. ويمكن تقييم التعبير عن أملاح الإماهة الفموية في غشاء الخلية في تجربة موازية استخدام التدفق الخلوي19،24. لاحظ أن انخفاض مستويات التعبير السطحي يمكن ردود قوية لا تزال موجودة في الخلية مغايرة النظم35. آخر نقطة حاسمة لتفادي التلوث الرائحة. نظراً لحساسية هذا الفحص، يمكن أن تلوث جزيئات الرائحة من أي عطر أو الغذاء أو المقايسة السابقة التجربة بدون ضوابط أو الردود. هذا السبب في أننا ننصح إلى فراغ في دائرة لومينوميتير على الأقل 2 ح، يفضل أن يكون ذلك بين عشية وضحاها، قبل تنفيذ مقايسة مع الرائحة مختلفة. من المهم أيضا أن تنظر سيتوتوكسيسيتي محتملة من الرائحة استخدمت في التجربة. يمكن أن تظهر انخفاضا محتملة لرد أو أثناء رصد 30 دقيقة أن الرائحة نفسها أثرا سلبيا على صحة الخلية. ويمكن تقييم سيتوتوكسيسيتي الرائحة بالقيام فحص صلاحية خلية بعد تعريض الخلايا للرائحة. للتخفيف من حدة هذه المشكلة، من الممكن أن تنظر فقط في أول 10 دقيقة من وقت التسجيل لتحليل البيانات، وزراعة المحاصيل في النهاية. فقد لاحظنا أن سمية الرائحة أساسا يحدث عندما يتم اختبار الرائحة نقية أو بتركيزات عالية جداً. حساسية لدينا الإنزيم يسمح الكشف عن الرائحة مخففة في الزيوت المعدنية. التركيز الأمثل للحصول على أقصى استجابة تختلف الرائحة واحدة إلى أخرى، ولكن لاحظنا أن إضعاف 1% ما يكفي للحصول على إشباع الاستجابة أو32. بيد أن بعض جزيئات الرائحة يمكن أن تمتلك ضغط بخار منخفض (وتقلب منخفض وبالتالي) وقد تحتاج إلى بعض التعديلات للبروتوكول المقدم. يتم تعيين وقت الحضانة الرائحة في قاعة لومينوميتير هنا لمدة 5 دقائق. افترضنا أن هذا القدر من الوقت كافية لحجته الدائرة مع جزيئات الرائحة متقلبة، ولكن أودورانتس تقلب منخفض قد تتطلب أوقات أطول في الحضانة.

وبصرف النظر عن هذه النقاط الحرجة، يجلب هذا الأسلوب العديد من الاحتمالات الجديدة لاستكشاف علاقات بنية الدالة الرائحة-أو التفاعلات. الجانب المتعلق بالرصد في الوقت الحقيقي لهذا الأسلوب يسمح أيضا لفهم حركية الأحداث التي تحدث أثناء تصور رائحة. على سبيل مثال، استخدمنا البروتوكول لاستكشاف وظائف الإنزيم المستقلب، استراز الكربوكسيل د 1 (Ces1d)، التي وجدت أن يتم التعبير عنها في الغشاء المخاطي حاسة الشم من الثدييات47. ويعرف هذا الإنزيم لتحويل استرات حمض الكربوكسيلية والكحول48. وأظهرت تعداء المشارك من Ces1d تحوير في المختبر أو ردود على مركبات إستر،32 مما يدل على أن هذا البروتوكول الجديد لا تتسم بالكفاءة في استكشاف أهمية الإنزيمات الاستقلابية في الكشف عن الرائحة. وعلاوة على ذلك، سيمكن استخدام هذا المنبر للتحقيق في خلائط الرائحة، وطريقة تقديم الروائح في الإعدادات التي أكثر طبيعية، دراسة المستقبل في فهم التفاعلات الرائحة أكثر تعقيداً. وأخيراً، الكشف عن جزيئات الرائحة من أملاح الإماهة الفموية أيضا أهمية عالية في تطوير جهاز استشعار رائحة. وقد أظهرت أن نظامنا يمكن الكشف عن جزيئات الرائحة التي قدمت في مرحلة بخار، هذا الأسلوب خطوة أولى في عملية التنمية biosensor المنمنمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

المجلس وحاء ك وصاحب الجلالة طلبا البراءات ذات الصلة بهذا العمل في 27 أكتوبر 2016.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (DC014423 و DC016224) والدفاع المتقدم المشروع وكالة ريلنوسي المشروع البحثي. يلافن بقي في جامعة ديوك بدعم مالي من برنامج JSPS "النهوض بالشبكات الدولية الاستراتيجية" للتعجيل "تداول الباحثين الموهوبين" (R2801). ونشكر كليم سهر على تحرير المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum - store at -20 °C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants - store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C
Phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab - 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  2. Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Genetics. 20 (12), 648-653 (2004).
  3. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  4. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  5. Peterlin, Z., Firestein, S., Rogers, M. E. The state of the art of odorant receptor deorphanization: a report from the orphanage. The Journal of General Physiology. 143 (5), 527-542 (2014).
  6. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science Signal. 2 (60), (2009).
  7. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2, 4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chemical Senses. 42 (3), 181-193 (2017).
  8. Nishizumi, H., Sakano, H. Decoding and deorphanizing an olfactory map. Nature Neuroscience. 18 (10), 1432 (2015).
  9. Wetzel, C. H., et al. Functional expression and characterization of a Drosophila odorant receptor in a heterologous cell system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (16), 9377-9380 (2001).
  10. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  11. Levasseur, G., et al. Ligand-specific dose-response of heterologously expressed olfactory receptors. European Journal Of Biochemistry. 270 (13), 2905-2912 (2003).
  12. Zhao, H., et al. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  13. Krautwurst, D., Yau, K. -W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
  14. Wetzel, C. H., et al. Specificity and Sensitivity of a Human Olfactory Receptor Functionally Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells andXenopus Laevis Oocytes. Journal of Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  16. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1446 (2015).
  17. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1455 (2015).
  18. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A butter aroma recombinate activates human class-I odorant receptors. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9410-9420 (2015).
  19. Noe, F., et al. IL-6-HaloTag® enables live-cell plasma membrane staining, flow cytometry, functional expression, and de-orphaning of recombinant odorant receptors. Journal of Biological Methods. 4 (4), 81 (2017).
  20. Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical Senses. 30 (1), 69-80 (2005).
  21. Shepard, B. D., Natarajan, N., Protzko, R. J., Acres, O. W., Pluznick, J. L. A cleavable N-terminal signal peptide promotes widespread olfactory receptor surface expression in HEK293T cells. PLoS One. 8 (7), 68758 (2013).
  22. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  23. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. -Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-Transporting Protein 1 Short (RTP1S) Mediates the Translocation and Activation of Odorant Receptors by Acting through Multiple Steps. Journal of Biological Chemistry. , (2012).
  24. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature Protocols. 3 (9), 1402 (2008).
  25. Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. Journal of Visualized Experiments. (128), e55831 (2017).
  26. Li, S., et al. Smelling sulfur: Copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols. Journal of the American Chemical Society. 138 (40), 13281-13288 (2016).
  27. Ahmed, L., et al. Molecular mechanism of activation of human musk receptors OR5AN1 and OR1A1 by (R)-muscone and diverse other musk-smelling compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (17), 3950-3958 (2018).
  28. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (9), 3492-3497 (2012).
  29. Sekharan, S., et al. QM/MM model of the mouse olfactory receptor MOR244-3 validated by site-directed mutagenesis experiments. Biophysical journal. 107 (5), 5-8 (2014).
  30. Liu, M. T., et al. Carbon chain shape selectivity by the mouse olfactory receptor OR-I7. Organic & Biomolecular Chemistry. 16 (14), 2541-2548 (2018).
  31. Li, Y., et al. Aldehyde Recognition and Discrimination by Mammalian Odorant Receptors via Functional Group-Specific Hydration Chemistry. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2563-2571 (2014).
  32. Kida, H., et al. Vapor detection and discrimination with a panel of odorant receptors. Nature Communications. 9 (1), 4556 (2018).
  33. Yu, Y., et al. Responsiveness of G protein-coupled odorant receptors is partially attributed to the activation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (48), 14966-14971 (2015).
  34. de March, C. A., et al. Conserved residues control Activation of mammalian G protein-coupled odorant receptors. Journal of the American Chemical Society. 137 (26), 8611-8616 (2015).
  35. de March, C. A., et al. Odorant receptor 7D4 activation dynamics. Angewandte Chemie. 130 (17), 4644-4648 (2018).
  36. Kim, S. -K., Goddard, W. A. Predicted 3D structures of olfactory receptors with details of odorant binding to OR1G1. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (12), 1175-1190 (2014).
  37. de March, C. A., Kim, S. K., Antonczak, S., Goddard, W. A., Golebiowski, J. G protein-coupled odorant receptors: From sequence to structure. Protein Science. 24 (9), 1543-1548 (2015).
  38. Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS Genetics. 8 (7), 1002821 (2012).
  39. Mainland, J. D., et al. The missense of smell: functional variability in the human odorant receptor repertoire. Nature Neuroscience. 17 (1), 114 (2014).
  40. Meister, M. On the dimensionality of odor space. Elife. 4, 07865 (2015).
  41. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  42. Gerkin, R. C., Castro, J. B. The number of olfactory stimuli that humans can discriminate is still unknown. Elife. 4, 08127 (2015).
  43. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
  44. Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468 (2007).
  45. McRae, J. F., et al. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical Senses. 37 (7), 585-593 (2012).
  46. de March, C. A., Ryu, S., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J. Structure-odour relationships reviewed in the postgenomic era. Flavour and Fragrance Journal. 30 (5), 342-361 (2015).
  47. Olson, M. J., Martin, J. L., LaRosa, A. C., Brady, A. N., Pohl, L. R. Immunohistochemical localization of carboxylesterase in the nasal mucosa of rats. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (2), 307-311 (1993).
  48. Nagashima, A., Touhara, K. Enzymatic conversion of odorants in nasal mucus affects olfactory glomerular activation patterns and odor perception. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16391-16398 (2010).

Tags

علم الأعصاب، العدد 146، بخار التحفيز، مستقبلات الرائحة، التنشيط في الوقت الحقيقي، وجزيئات الرائحة، رمز اندماجي، والتحليل الوظيفي
في الوقت الحقيقي رصد المختبر لتنشيط مستقبلات الرائحة بالرائحة في مرحلة البخار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de March, C. A., Fukutani, Y.,… More

de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter