Summary
描述小鼠下半身的原位灌注，包括膀胱、前列腺、性器官、骨骼、肌肉和足部皮肤的原位灌注。
Abstract
前活体灌注是研究分离器官（如肝脏、肾脏）功能的重要生理工具。同时，由于小鼠器官体积小，骨、膀胱、皮肤、前列腺和生殖器官的外体灌注具有挑战性或不可行。在这里，我们首次报告小鼠的原位下半身灌注回路，包括上述组织，但绕过主要清除器官（肾脏、肝脏和脾脏）。该回路通过将腹主动脉和劣质静脉冠状动脉和静脉上方以及烧灼外周血管进行开气和建立。灌注通过一个内皮泵进行，其灌注流量保持长达2小时。原位染色与荧光叶管和霍赫斯特溶液证实，微血管已成功覆盖。此小鼠模型是研究病理过程以及药物传递机制、循环肿瘤细胞进入/从肿瘤的迁移/转移以及免疫系统与扩散器官和组织相互作用的非常有用的工具。
Introduction
分离器官灌注最初是为了研究器官生理学移植1,1，2，3，,3并使人们了解器官的功能，不受其他身体系统的干扰。例如，孤立的肾脏和心脏灌注在理解血液动力学的原理和血管活性剂的作用方面非常有用，而肝脏灌注对于理解代谢功能，包括健康和患病组织,4、5、6、75中的药物46,代谢非常重要。此外，灌注研究对于了解用于移植的器官的生存能力和功能至关重要。在癌症研究中，由几组使用小鼠、大鼠和新鲜切除的人体组织8，9描述分离的肿瘤灌注9。在一些孤立的肿瘤灌注中，肿瘤被植入卵巢脂肪垫，以迫使从肠动脉10供应血管的肿瘤生长。Jain小组利用结肠腺癌的分离灌注进行开拓性研究，以了解肿瘤血流动力学和转移8,8，11，12，13。11,12,13其他创新工程外体设置包括一个96孔板为基础的灌注装置，培养初级人类多发性骨髓瘤细胞14和模块化流室工程骨髓架构和功能研究15。
除了生理学和病理学研究，器官灌注还被用来研究药物输送的原理。因此，一组人描述了孤立的大鼠肢体灌注，并研究了植入肉瘤16中脂质体积累的，而另一组则进行了解剖人体肾脏灌注，以研究纳米粒子17的内皮靶向。Ternullo等人使用一种孤立的渗透人体皮肤皮瓣作为接近体内皮肤药物渗透模型18。
尽管在大型器官和组织灌注方面取得了这些进展，但还没有关于小鼠原位灌注模型的报告：（a） 绕过肝脏、脾脏和肾脏等清除器官;（a） 旁路清除器官，如肝脏、脾脏和肾脏;（a） 旁路清除器官，如肝脏、脾脏和肾脏;（a） 旁路清除器官，如肝脏、脾脏和肾脏;（a） 旁白器官;（a） 血液移植器官;（a） 血液灌注模型。（（b） 包括骨盆器官、皮肤、肌肉、生殖器官（男性）、膀胱、前列腺和骨髓。由于这些器官体积小，供应血管，外体可灌注和建立灌注电路不可行。小鼠是癌症和免疫学研究以及药物输送中最重要的动物模型。对小小鼠器官进行功能移植的能力将允许有关药物交付给这些器官的有趣问题，包括植入骨盆的肿瘤（膀胱、前列腺、卵巢、骨髓），以及这些器官疾病的基本生理学和免疫学研究。为了解决这个缺陷，我们在小鼠身上开发了一种原位灌注回路，可以避免组织损伤，比孤立的器官灌注更适合功能研究。
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Protocol
此处描述的所有方法都已获得科罗拉多大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。
1. 预热灌注系统
- 手术前准备灌注系统，为所有水套组件（香水储液罐、湿室和盖子）启动一个 37°C 循环水浴，如图 1A中的定制配置所示。确保油管清洁，必要时更换。要限制润混量，请使用湿润室内的气泡陷阱作为润酸盐储液罐（图1B-6）。
2. 血管导管
- 使用同氟体兽麻醉机在 8-10 周大的 BALB/c 小鼠中诱导麻醉，异氟兰和氧气流速为 0.3 L/min。作为替代物，使用氯胺酮/锡拉辛或任何其他类型的内丙酮麻醉。用两种方法评估麻醉深度：手趾捏和角膜反射。
- 用双蒸馏水用针织出 4 - 0 的丝绸缝合线。
- 将麻醉小鼠放在发泡胶板上的上角位置，头部朝向外科医生，用胶带固定前肢和后肢。用异丙醇擦拭腹部，用剪刀将腹部切入中线，以"T"形切割腹部。通过电凝（烧灼）停止切口边缘周围的出血。
- 将胃、杰朱努姆和结肠推到腹部右侧，露出腹部主动脉、静脉卡瓦，以及常见的腹腔和腹腔动脉和静脉。
- 在解剖显微镜下，使用 4-0 丝线（图2 黄线）在男性的卵巢动脉/静脉中查找和缝合男性的卵巢动脉/静脉和女性的牙周动脉/静脉。
- 在解剖显微镜下，在腹部主动脉和劣质静脉下循环两个4-0丝状缝合线（约1厘米以上，比伊利亚克动脉和静脉，1毫米分开， 图2），并在最接近伊利亚克血管的缝合线中打一个松散的结（图2，白色虚线）。或者，6-0丝线可用于这个结。
- 在解剖显微镜下，水平对齐和拉伸低劣的维纳卡瓦和腹部主动脉与波特-艾吉耶。使用 24 G 翼屏蔽 I.V. 导管刺穿腹部主动脉，按下按钮以收回针芯，并将导管插入约 5 mm 到容器中。
- 重复相同的程序与劣质的维纳卡瓦，并绑结的两个缝合围绕导管血管。
注：针头很容易刺穿血管;因此，保持容器拉伸和针平行与容器。一旦针头穿透约 1 mm 到容器中，立即收回针芯。腹部主动脉在低劣的维纳卡瓦下，由于被包裹在结缔组织中，更薄、更有弹性。因此，大母可以"坚持"导管，因此应在道卡之前导管，以减少导管滑出的可能性。
- 重复相同的程序与劣质的维纳卡瓦，并绑结的两个缝合围绕导管血管。
- 使用即时胶水固定导管直立人脊柱，更换腹部器官，并在保持麻醉的同时结束手术。
注：在灌注过程中，不能完全更换到腹腔的器官需要定期用灌注介质进行润湿。
3. 设置灌注系统
- 将鼠标转移到水套湿润室中，在硅垫上预热至 37 °C，用 19 G 针将导管翅膀固定到垫上。
- 用预预热灌注缓冲液（Ringer 的乳酸溶液辅以 5% BSA）填充动脉导管的端（入口），然后使用螺丝上的连接器将导管端与入口灌注管连接（图1B，红色箭头）。
注：用止血钳握住接头，用胶带固定管子，以避免移动导管。 - 将近源流速调整至0.6 mL/min，并保持灌注流出（图1B，蓝色箭头）开限5-10分钟，通过静脉导管洗出血液。出口导管中会有一些血块;在关闭灌注回路之前，用灌注缓冲液冲洗出血块。
- 使用螺钉上的连接器将静脉导管的端与出口管连接以关闭电路（图1B）。此时，执行CO2气体安乐死，并验证胸部穿刺或任何其他方法。
- 用加热盖盖住湿润的腔室。定期检查香水的级别，如果需要，请添加更多。灌注可进行长达2小时。
注：设置封闭式灌注系统需要5 mL的灌注。如果没有泄漏或水肿，香水的体积将减少小于 1 mL，并且不需要额外的缓冲液。为避免周围循环血栓引起的水肿，在灌注前10分钟可使用含有0.002%肝素的灌注缓冲液，但应改为不含肝素的缓冲液，以避免切口边缘的泄漏。 - 如果需要，可随时在灌注储液罐或注射口中加入选择试剂（图1B-5）。例如，10 μL的10mg/mL Hoechst33342可加入香水，在灌注结束前2小时染色细胞核，或50μL的1mg/mL DyLight 649-49-letin在灌注结束前30分钟染色血管内皮细胞。
注：如果试图用 Hoechst 溶液染色骨髓，小鼠需要在手术前 30 分钟预注射。 - 用荧光试剂灌注后，用灌注缓冲液再洗10分钟，以尽量减少背景荧光。
4. 对移植器官的分析
- 收集器官，包括睾丸、前列腺、膀胱、股骨、肌肉和皮肤（如脚）。切除一块约1毫米3的器官，在两 个玻璃滑梯之间平展。
- 使用DAPI/Cy5激发和发射滤波器（激发激光器：DAPI，405nm）在倒置荧光共物显微镜下研究;Cy5，640 nm）。使用至少 200 倍放大镜，具有 0.45 的数值孔径。
- 或者，用4%甲醛溶液固定器官24小时，并进行赤氧林-eosin染色19。
- 要创建一个骨窗，以进行完整的骨髓观察，固定股骨或头骨的两端，用19G针头的横向边缘刮去皮质骨，以暴露胸膜;注意保持一层薄薄的残骨。将骨骼放在盖滑上，窗户朝向玻璃，并使用倒置荧光共体显微镜使用倒置荧光共体显微镜，如上所述。骨髓腔中的细胞和血管网络很容易观察到。
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Representative Results
我们建立了闭路灌注系统，通过腹主动脉和8-10周大小鼠的劣质静脉灌注系统，同时保持灌注缓冲液的体积小于10 mL。 图 3A 显示了使用包含 Hoechst 33342 和 DyLight 649-lectin 的 Ringer 溶液对组织进行吸收后共和图像。肌肉，骨髓，睾丸，膀胱，前列腺和脚部皮肤显示有效的核和血管染色。 图3B 显示3小时正常热灌注后器官的血氧素-eosin染色。
图1。简化的灌注设置。 （A） 系统包括 （1） 压力/流速控制器、（2） 循环热水浴池、（3） 带加热盖和定制发泡胶空间的加热湿室和 （4） 近源泵。（B） 灌注电路显示入口（红线）和出口（蓝线）、（5）喷射口和（6）定制灌注储液罐。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2.雄性小鼠和雌性小鼠的结扎和结状血管的位置。 为了勾勒出血管，在灌注结束前30分钟，将5μL/kg的1%埃文斯蓝染料加入灌注介质。在雌性小鼠中，卵巢和卵巢动脉和静脉均被连结。在雄性小鼠中，心肌动脉和静脉被连结。黄色和白色线条显示结结的近似位置;黄色箭头显示实际的缝合线和结。插入静脉导管和动脉导管。为了演示目的，切除了肠子。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3.共和体和H&E图像显示器官成功灌注3小时，无明显组织损伤。 共体比例杆：20 μm用于骨髓，100 μm用于其他器官。H&E 比例杆： 100 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
所述电路可用于探究各种研究问题，例如不同血清成分和组织屏障在药物输送或免疫和干细胞贩运中的作用。不同的药物输送系统（如脂质体和纳米粒子）可以添加到香水中，以了解生理和生化因素在输送中的作用。灌注的持续时间可能会有所不同，具体取决于所研究的组织、科学目标和灌注的组成。我们在这里介绍灌注的结果长达2小时使用的基本灌注介质，包括林格的溶液与乳酸和白素。必须指出，目前工作的目标是建立灌注电路，而不是开发和优化灌注介质和条件，以支持最佳的器官/组织功能和氧合。营养物质、维生素、激素和血细胞的添加在以前的文献中被广泛研究，在人类和动物组织,,,,,,7、9、10、11、12、13、16、17、20、21等数,9十份研究16出版物中12,13，对营养物质、维生素、激素和血细胞的添加进行了17大量描述。20对香水成分的精炼以及氧合可以长期维持组织在体温下代谢。因此，一些组使用红血球和血液氧合，这大大提高了敏感组织的生存能力17。灌注控制也是高度可定制的;如有必要，可添加用于控制氧合和压力计的气体歧管。此外，还可以使用较大的香水室，并且可以通过计算机控制压力、温度和流速等生理参数。
灌注电路存在若干限制。由于卵巢动脉和静脉的结扎，雌性小鼠的子宫和卵巢无法吸附。此外，我们观察到，睾丸灌注是不完整的，可能是因为替代血液供应不包括在灌注电路。
通过充分的实践，可以在20-30分钟内完成，成功率超过80%。成功率高度取决于在不刺穿容器的情况下对大血管和维纳卡瓦进行调节的能力，如步骤2.7中所讨论。在步骤 2 中，由于潜在的泄漏和香水损失，将手术区域中的组织和小血管的伤害降至最低非常重要。在步骤2.5中，必须始终先刺穿动脉，并采取预防措施，使导管不会被拔出。在步骤 3 中，当将导管的端连接到导管时，请确保使用端口-aiguille 紧紧地握住导管，以避免移动针头。血压与流速成正比;因此，香水的流量必须低于0.6 mL/min才能保持生理压力。最后，在灌注回路闭合之前，首选保持心跳，因为这将改善微血管的灌注。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了国家卫生和植物医院CA194058补助金对DS、斯卡格斯药学院ADR种子资助计划（DS）的支持;中国国家自然科学基金（第31771093号），吉林省国际合作项目（第2011180414085GH号），中央高校基础研究基金，JLU科技创新研究团队项目（2017-27，2019TD-36）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
References
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