Summary
Un protocole est décrit pour la perfusion in situ du bas du corps de la souris, y compris la vessie, la prostate, les organes sexuels, les os, les muscles et la peau du pied.
Abstract
La perfusion ex vivo est un outil physiologique important pour étudier la fonction des organes isolés (p. ex. foie, reins). Dans le même temps, en raison de la petite taille des organes de souris, la perfusion ex vivo des organes d’os, de vessie, de peau, de prostate, et de reproduction est difficile ou non faisable. Ici, nous rapportons pour la première fois un circuit in situ de perfusion inférieure du corps chez les souris qui inclut les tissus ci-dessus, mais contourne les organes principaux de dégagement (rein, foie, et rate). Le circuit est établi en canniler l’aorte abdominale et le vena cava inférieur au-dessus de l’artère et de la veine iliaques et en cautérisant les vaisseaux sanguins périphériques. La perfusion est effectuée par l’intermédiaire d’une pompe péristaltique avec débit perfusate maintenu jusqu’à 2 h. La coloration in situ avec la lectine fluorescente et la solution de Hoechst a confirmé que la microvasculature a été perfusée avec succès. Ce modèle de souris peut être un outil très utile pour étudier les processus pathologiques ainsi que les mécanismes de l’administration de médicaments, la migration / métastases des cellules tumorales circulantes dans / de la tumeur, et les interactions du système immunitaire avec des organes et des tissus perfusés.
Introduction
La perfusion d’organe isolé a été développée à l’origine pour étudier la physiologie d’organe pour la transplantation1,2,3, et a permis la compréhension des fonctions des organes sans interférence d’autres systèmes de corps. Par exemple, la perfusion rénale et cardiaque isolée était extrêmement utile pour comprendre les principes de base de l’hémodynamique et les effets des agents vasoactifs, tandis que la perfusion hépatique était importante pour comprendre la fonction métabolique, y compris le métabolisme des médicaments dans les tissus sains et malades4,5,6,7. En outre, les études de perfusion étaient critiques dans la compréhension de la viabilité et de la fonction des organes destinés à la transplantation. Dans cancer Researchearch, perfusion tumorale isolée a été décrite par plusieurs groupes utilisant la souris, le rat, et les tissus humains fraîchement réséqués8,9. Dans une perfusion de tumeur isolée, la tumeur a été implantée dans le tampon de graisse d’ovaire pour forcer la croissance de la tumeur fournissant des vaisseaux sanguins de l’artère mésentery10. Le groupe Jain a effectué des études pionnières utilisant la perfusion isolée des adénocarcinomes du côlon pour comprendre l’hémodynamique tumorale et la métastase8,11,12,13. D’autres configurations ex vivo innovantes comprennent un dispositif de perfusion à base de plaques de 96 puits pour la culture des cellules primaires du myélome multiple humain14 et une chambre modulaire de flux pour l’architecture de la moelle osseuse d’ingénierie et la recherche de fonction15.
En plus des études de physiologie et de pathologie, la perfusion d’organes a été utilisée pour étudier les principes de base de l’administration de médicaments. Ainsi, un groupe a décrit la perfusion isolée de membre de rat et a étudié l’accumulation des liposomes dans les sarcomes implantés16, tandis qu’un autre groupe a exécuté la perfusion de rein humain disséquée pour étudier le ciblage endothélial des nanoparticules17. Ternello et coll. ont utilisé un rabat de peau humain perfusé isolé comme modèle de pénétration de drogue de peau proche-à-in vivo18.
Malgré ces progrès dans la perfusion de grands organes et tissus, il n’y a eu aucun rapport sur les modèles in situ de perfusion chez les souris qui : a) contournent les organes de dégagement tels que le foie, la rate et les reins ; b) comprennent les organes pelviens, la peau, les muscles, les organes reproducteurs (chez les hommes), la vessie, la prostate et la moelle osseuse. En raison de la petite taille de ces organes et de la vascularisation de fourniture, la cannulation ex vivo et l’établissement d’un circuit de perfusion n’a pas été possible. La souris est le modèle animal le plus important dans la recherche sur le cancer et l’immunologie, et la livraison de médicaments. La capacité de perfuse de petits organes de souris permettrait de répondre à des questions intéressantes concernant l’administration de médicaments à ces organes, y compris aux tumeurs implantées dans le bassin (vessie, prostate, ovaire, moelle osseuse), ainsi qu’à des études de physiologie et d’immunologie de base des maladies de ces organes. Pour remédier à cette carence, nous avons développé un circuit de perfusion in situ chez les souris qui peuvent potentiellement éviter les lésions tissulaires et qui est beaucoup mieux adapté à la recherche fonctionnelle que la perfusion d’organes isolé.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Colorado.
1. Préchauffer le système de perfusion
- Préparer le système de perfusion avant la chirurgie en commençant un bain d’eau circulant à 37 °C pour tous les composants à veste d’eau (réservoir perfusé, chambre humide et couvercle) comme le montre une configuration personnalisée de la figure 1A. Assurez-vous que le tube est propre et remplacez-le si nécessaire. Pour limiter le volume perfusé, utilisez un piège à bulles dans une chambre humide comme réservoir perfusé (figure 1B-6).
2. Cathétérisme vasculaire
- Induire l’anesthésie dans une souris BALB/c de 8-10 semaines utilisant une machine d’anesthésie vétérinaire isoflurane avec 3-5% d’isoflurane et de débit d’oxygène à 0.3 L/min. Comme alternative, utilisez la kétamine/xylazine ou tout autre type d’anesthésie intrapéritonéale. Évaluer la profondeur de l’anesthésie par 2 méthodes : pincement d’orteil et réflexe cornéen.
- Préwet une suture de soie 4-0 avec aiguille dans de l’eau distillée double.
- Placez la souris anesthésiée en position supinée sur une planche en polystyrène avec la tête face au chirurgien et immobilisez les membres antérieurs et les membres postérieurs avec du ruban adhésif. Essuyez l’abdomen avec de l’alcool isopropyle et coupez l’abdomen le long de la ligne médiane en forme de « T » avec des ciseaux. Arrêter de saigner autour du bord de l’incision par électrocoagulation (cautérisation).
- Poussez l’estomac, le jejunum et le côlon sur le côté droit de l’abdomen pour révéler l’aorte abdominale, le vena cava, et les artères et veines iliaques et ilioumbar communes.
- Sous un microscope de dissection, trouver et lier l’artère/veine ilioumbar dans le mâle, et l’artère/veine ovarienne et l’artère/veine ilioumbar dans la femelle utilisant des sutures de soie 4-0(figure 2 lignes jaunes).
- Sous un microscope à dissection, bouclez deux sutures de soie 4-0 sous l’aorte abdominale et vena cava inférieure (environ 1 cm au-dessus de l’artère et de la veine iliaques, 1 mm de distance, figure 2),et faites un nœud lâche dans la suture la plus proche des vaisseaux iliaques(figure 2, ligne pointillée blanche). Alternativement, une suture de soie 6-0 peut être utilisée pour ce noeud.
- Sous un microscope de dissection, aligner horizontalement et étirer à la fois la vena cava inférieure et l’aorte abdominale avec porte-aiguille. Utilisez un cathéter I.V. ailé ailé de 24 G pour perforer l’aorte abdominale, appuyez sur le bouton pour rétracter le noyau de l’aiguille et insérez le cathéter d’environ 5 mm dans le vaisseau.
- Répétez la même procédure avec la vena cava inférieure et attachez des noeuds des deux sutures autour des vaisseaux cathétérisés.
REMARQUE : L’aiguille peut facilement percer le vaisseau sanguin; par conséquent, garder les navires tendus et l’aiguille parallèle avec le navire. Rétractez le noyau de l’aiguille dès que l’aiguille pénètre environ 1 mm dans le navire. L’aorte abdominale est sous le vena cava inférieur et beaucoup plus mince et plus élastique en raison d’être enfermé dans le tissu conjonctif. Par conséquent, l’aorte peut « tenez » au cathéter, et devraient donc être cathéterisés avant le cava vena pour réduire la probabilité que le cathéter glisse.
- Répétez la même procédure avec la vena cava inférieure et attachez des noeuds des deux sutures autour des vaisseaux cathétérisés.
- Appliquer de la colle instantanée pour immobiliser les cathéters sur les spinaes de l’érecteur, remplacer les organes abdominaux et mettre fin à la chirurgie tout en maintenant l’anesthésie.
REMARQUE : Les organes qui ne peuvent pas être complètement remplacés dans la cavité abdominale devront être périodiquement humidifiés avec le milieu de perfusion pendant le processus de perfusion.
3. Mettre en place le système de perfusion
- Transférer la souris dans la chambre humide à veste d’eau préassée à 37 °C sur un tampon de silicium et immobiliser les ailes du cathéter sur le tampon avec des aiguilles de 19 G.
- Remplissez l’extrémité du cathéter artériel (entrée) d’un tampon de perfusion préaurée (solution de lactate de Ringer complétée à 5 % de BSA), puis connectez l’extrémité du cathéter avec le tube de perfusion d’entrée à l’aide d’un connecteur à vis(figure 1B, flèche rouge).
REMARQUE : Maintenez le connecteur avec des forceps hémostatiques et immobilisez le tube avec du ruban adhésif pour éviter de déplacer les cathéters. - Ajuster le débit péristaltique à 0,6 mL/min et maintenir la sortie de perfusion(figure 1B, flèche bleue) ouverte pendant 5 à 10 min pour laver le sang par le cathéter veineux. Il y aura quelques caillots dans le cathéter de sortie; éliminer les caillots à l’une de la mémoire tampon avant de fermer le circuit de perfusion.
- Connectez l’extrémité du cathéter veineux avec le tube de sortie à l’aide d’un connecteur à vis pour fermer le circuit (figure 1B). À ce stade, effectuer l’euthanasie au gaz CO2 et vérifier par perforation thoracique ou toute autre méthode.
- Couvrir la chambre humide avec le couvercle réchauffé. Vérifiez le niveau de perfusate périodiquement et ajoutez-en davantage si nécessaire. La perfusion peut être effectuée jusqu’à 2 heures.
REMARQUE : 5 mL de perfusate seront nécessaires pour mettre en place le système de perfusion fermée. S’il n’y a pas de fuite ou d’œdème, le volume de perfusate diminuera de moins de 1 mL et une mémoire tampon supplémentaire ne sera pas nécessaire. Pour éviter l’œdème induit par le thrombus circulant périphérique, le tampon de perfusion contenant 0,002% d’héparine peut être utilisé dans les 10 premières minutes de perfusion, mais doit être changé en tampon sans héparine pour éviter la fuite au bord des incisions. - Si nécessaire, ajoutez un réactif de choix dans le réservoir de perfusion ou au port d’injection à tout moment (figure 1B-5). Par exemple, 10 μL de 10 mg/mL Hoechst33342 peuvent être ajoutés dans le perfusate pour tacher les noyaux cellulaires 2 h avant la fin de la perfusion, ou 50 μL de 1 mg/mL DyLight 649-lectine pour tacher les cellules endothéliales vasculaires 30 min avant la fin de la perfusion.
REMARQUE : Si vous essayez de tacher la moelle osseuse avec la solution Hoechst, les souris devront être pré-injectées 30 minutes avant la chirurgie. - Après perfusion avec des réactifs fluorescents, laver avec tampon de perfusion pendant encore 10 minutes pour minimiser la fluorescence de fond.
4. Analyse des organes perfusés
- Prélever des organes, y compris les testicules, la prostate, la vessie, le fémur, les muscles et la peau (p. ex., les pieds). Exciser un morceau d’organe d’environ 1 mm3 et aplatir entre deux lames de verre.
- Étude réalisée au microscope confocal fluorescent inversé à l’aide de filtres d’excitation et d’émission DAPI/Cy5 (lasers d’excitation : DAPI, 405 nm; Cy5,640 nm). Utilisez au moins 200x objectif de grossissement avec une ouverture numérique de 0,45.
- Alternativement, fixer les organes avec 4% solution de formaldéhyde pour 24 h et effectuer l’hématoxyline-éosine coloration19.
- Pour créer une fenêtre osseuse pour l’observation intacte de la moelle osseuse, immobiliser les deux extrémités du fémur ou du tibia et gratter l’os cortical avec le bord latéral d’une aiguille de 19 G pour exposer le périoste; prendre soin de garder une fine couche d’os résiduel. Placez l’os sur un glissement de couverture avec la fenêtre faisant face au verre et à l’image avec le microscope confocal fluorescent inversé utilisant les canaux DAPI et Cy5 comme décrit ci-dessus. Les cellules et le réseau vasculaire dans la cavité de moelle osseuse peuvent être facilement observés.
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Representative Results
Nous avons mis en place un système de perfusion en circuit fermé par cannulation de l’aorte abdominale et le vena cava inférieur de 8-10 semaines souris tout en gardant le volume de tampon de perfusion inférieure à 10 mL. La figure 3A montre des images confocales après avoir perfusé les tissus avec la solution de Ringer contenant Hoechst 33342 et DyLight 649-lectine. Les muscles, la moelle osseuse, les testicules, la vessie, la prostate et la peau du pied montrent une coloration nucléaire et vasculaire efficace. La figure 3B montre la coloration de l’hématoxyline-éosine des organes après 3 heures de perfusion normothermique.
Figure 1. Configuration simplifiée de la perfusion. (A) Le système comprend (1) un contrôleur de débit/pression, (2) un bain d’eau chauffé circulant, (3) une chambre humide chauffée avec couvercle chauffé et espaceur en polystyrène personnalisé, et (4) une pompe péristaltique. (B) Le circuit de perfusion montre l’entrée (lignes rouges) et la sortie (lignes bleues), (5) le port d’injection et (6) le réservoir de perfusion personnalisé. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Emplacement des vaisseaux sanguins ligatés et cannulés chez les souris mâles et femelles. Afin de décrire les vaisseaux sanguins, 5 μL/kg de colorant Evans Blue à 1% a été ajouté au milieu de perfusion 30 min avant la fin de la perfusion. Chez les souris femelles, les artères et les veines ilio lombaires et ovariennes sont ligatées. Chez les souris mâles, l’artère iliolumbale et la veine sont ligatées. Les lignes jaune et blanche montrent la position approximative des nœuds de ligature; flèches jaunes montrent des sutures réelles et des noeuds. Les cathéters veineux et artériels sont insérés. Les intestins ont été enlevés à des fins de démonstration. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Les images confocales et H&E montrent la perfusion réussie d’organes pendant 3 h sans lésion tissulaire apparente. Barre d’échelle confocale : 20 μm pour la moelle osseuse et 100 μm pour d’autres organes. Barre d’échelle H&E : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le circuit décrit peut être utilisé pour sonder diverses questions de recherche, par exemple le rôle de différents composants sériques et barrières tissulaires dans l’administration de médicaments, ou le trafic de cellules immunitaires et souches. Différents systèmes d’administration de médicaments (p. ex., liposomes et nanoparticules) peuvent être ajoutés au perfusate afin de comprendre le rôle des facteurs physiologiques et biochimiques dans l’administration. La durée de la perfusion peut varier, selon les tissus étudiés, les objectifs scientifiques, et la composition du perfusate. Nous présentons ici les résultats de la perfusion jusqu’à 2 h à l’aide d’un support de perfusion de base composé de la solution de Ringer avec lactate et albumine. Il convient de noter que l’objectif du présent travail était d’établir le circuit de perfusion plutôt que de développer et d’optimiser le milieu de perfusion et les conditions pour soutenir la fonction optimale d’organe/tissu et l’oxygénation. L’ajout de nutriments, vitamines, hormones et cellules sanguines ont été largement étudiés dans la littérature précédente, et de nombreux médias de perfusion et les protocoles d’oxygénation ont été décrits dans des dizaines de publications de recherche dans les tissus humains et animaux7,9,10,11,12,13,16,17,20,21. Les raffinements de la composition perfusate ainsi que l’oxygénation peuvent permettre le maintien à long terme du métabolisme des tissus à la température du corps. Ainsi, certains groupes ont utilisé des globules rouges et l’oxygénation du sang, ce qui améliore grandement la viabilité des tissus sensibles17. Les contrôles de perfusion sont également hautement personnalisables; si nécessaire, un collecteur de gaz pour contrôler l’oxygénation et le manomètre de pression peut être ajouté. En outre, une plus grande chambre perfusate peut être utilisée, et les paramètres physiologiques tels que la pression, la température et le débit peuvent être contrôlés par un ordinateur.
Il y a plusieurs limitations dans le circuit de perfusion. L’utérus et les ovaires chez les souris femelles ne pouvaient pas être perfusés en raison de la ligature de l’artère ovarienne et de la veine. En outre, nous avons observé que la perfusion de testicules était incomplète, probablement due à l’approvisionnement en sang alternatif non inclus dans le circuit de perfusion.
Avec une pratique suffisante, la procédure de cannulation peut être effectuée dans les 20-30 min avec un taux de réussite de plus de 80%. Le taux de réussite dépend fortement de la capacité de canuler l’aorte et le vena cava sans perforer le navire comme nous l’avons vu à l’étape 2.7. Il est important à l’étape 2 de minimiser les blessures aux tissus et aux petits vaisseaux sanguins dans la zone chirurgicale en raison de fuites potentielles et la perte de perfusate. À l’étape 2.5, il faut toujours perforer l’artère en premier, et prendre des précautions pour que le cathéter ne soit pas sorti. À l’étape 3, lorsque vous reliez l’extrémité des cathéters au tube, assurez-vous de tenir le cathéter fermement en utilisant porte-aiguille pour éviter de déplacer l’aiguille. La pression artérielle est directement proportionnelle au débit; par conséquent, le débit de perfusate doit être inférieur à 0,6 mL/min pour maintenir la pression physiologique. Enfin, il est préférable de maintenir le rythme cardiaque jusqu’à ce que le circuit de perfusion soit fermé, car cela permettra d’améliorer la perfusion de la microvasculature.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
L’étude a été appuyée par la subvention ca194058 des NIH à DS, Skaggs School of Pharmacy ADR ased grant program (DS); National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31771093), le Project of International Collaboration of Jilin Province (No.201180414085GH), the Funds Funds for the Central Universities, the Program for JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
References
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