Summary
Nous présentons ici un protocole d’un modèle d’ondes blastiques pour les rongeurs afin d’étudier les effets neurobiologiques et physiopathologiques des lésions cérébrales traumatiques légères à modérées. Nous avons mis en place une configuration de paillasse à gaz équipée de capteurs de pression permettant une génération fiable et reproductible de lésions cérébrales traumatiques légères à modérées induites par les explosions.
Abstract
Les lésions cérébrales traumatiques (TCC) sont un problème de santé publique à grande échelle. Le TCC léger est la forme la plus répandue de neurotraumatisme et représente un grand nombre de visites médicales aux États-Unis. Il n’existe actuellement aucun traitement approuvé par la FDA pour le TCC. L’incidence accrue de TCC liés à l’armée et induits par les explosions accentue encore le besoin urgent de traitements efficaces du TCC. Par conséquent, de nouveaux modèles animaux précliniques de TCC qui récapitulent les aspects du TCC humain lié à l’explosion feront grandement progresser les efforts de recherche sur les processus neurobiologiques et physiopathologiques sous-jacents au TCC léger à modéré ainsi que le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le TCC.
Nous présentons ici un modèle fiable et reproductible pour l’étude des effets moléculaires, cellulaires et comportementaux du TCC induit par les explosions légères à modérées. Nous décrivons un protocole étape par étape pour les traumatismes crâniens légers induits par les explosions chez les rongeurs à l’aide d’une configuration de paillasse composée d’un tube de choc à gaz équipé de capteurs de pression piézoélectriques pour assurer des conditions de test cohérentes. Les avantages de la configuration que nous avons établie sont son coût relativement faible, sa facilité d’installation, sa facilité d’utilisation et sa capacité à haut débit. Parmi les autres avantages de ce modèle de TCC non invasif, citons l’évolutivité de la surpression de pic de souffle et la génération de résultats reproductibles contrôlés. La reproductibilité et la pertinence de ce modèle de TCC ont été évaluées dans un certain nombre d’applications en aval, y compris les analyses neurobiologiques, neuropathologiques, neurophysiologiques et comportementales, soutenant l’utilisation de ce modèle pour la caractérisation des processus sous-jacents à l’étiologie du TCC léger à modéré.
Introduction
Les lésions cérébrales traumatiques (TCC) représentent plus de deux millions de visites à l’hôpital chaque année aux États-Unis seulement. Les traumatismes crâniens légers résultant généralement d’accidents de voiture, d’événements sportifs ou de chutes représentent environ 80 % de tous les cas de TCC1. Le TCC léger est considéré comme la « maladie silencieuse », car les patients ne présentent souvent aucun symptôme manifeste dans les jours et les mois qui suivent l’insulte initiale, mais peuvent développer de graves complications liées au TCC plus tard dans la vie2. De plus, le TCC léger induit par l’explosion est répandu parmi les membres du service militaire et a été associé à un dysfonctionnement chronique du SNC3,4,5,6. En raison de l’incidence croissante du TCC léger lié aux blastes7,8, la modélisation préclinique des processus neurobiologiques et physiopathologiques associés au TCC léger est ainsi devenue un centre d’intérêt dans le développement de nouvelles interventions thérapeutiques pour le TCC.
Historiquement, la recherche sur les TCC s’est principalement concentrée sur les formes graves de neurotraumatisme, malgré le nombre relativement plus faible de cas graves de TCC chez l’homme. Des modèles précliniques de rongeurs pour les traumatismes crâniens humains graves ont été mis au point, y compris les modèles à impact cortical contrôlé (ICC)9,10 et à lésion par percussion fluide (FPI)11, qui sont tous deux bien établis pour produire des effets physiopathologiques fiables12,13. Ces modèles ont jeté les bases de ce que l’on sait aujourd’hui sur la neuroinflammation, la neurodégénérescence et la réparation neuronale dans le TCC. Bien que des connaissances considérables sur la physiopathologie du TCC aient été développées, il n’existe actuellement aucun traitement efficace approuvé par la FDA pour le TCC.
Plus récemment, l’objectif de la recherche sur le TCC a été élargi pour inclure un plus large éventail de pathologies liées au TCC dans le but ultime de développer des interventions thérapeutiques efficaces. Néanmoins, peu de modèles précliniques pour le TCC léger ont été établis qui ont montré des effets mesurables, et seul un petit nombre d’études ont étudié le spectre du TCC léger2,14,15. Comme le TCC léger représente la grande majorité de tous les cas de TCC, des modèles fiables de TCC léger sont nécessaires de toute urgence pour faciliter la recherche sur l’étiologie et la neuropathophysiologie de la condition humaine, afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
En collaboration avec des ingénieurs biomédicaux et des physiciens de l’aérospatiale, nous avons établi un modèle évolutif d’ondes de souffle à tête fermée pour les traumatismes crâniens légers à modérés. Ce modèle préclinique de rongeurs a été spécifiquement développé pour étudier les effets de la dynamique de la force, y compris les ondes de souffle et les mouvements d’accélération / décélération, qui sont associés à un TCC humain léger obtenu lors de combats militaires, d’événements sportifs, d’accidents de voiture et de chutes. Comme les ondes de souffle sont en corrélation avec la dynamique de force qui cause un TCC léger chez l’homme, ce modèle a été conçu pour produire une forme d’onde de Friedlander cohérente avec une impulsion, qui est mesurée en livres par pouce carré (psi) * milliseconde (ms). Le niveau d’impulsion est mis à l’échelle pour tomber en dessous des courbes de létalité pulmonaire définies pour les souris et les rats afin de mener des investigations précliniques16,17,18. De plus, ce modèle permet d’enquêter sur les blessures causées par les coups d’État et les contrecoups dues aux forces de rotation rapides de la tête de l’animal. Ce type de blessure est inhérent à plusieurs types de présentations cliniques de TCC, y compris celles observées dans les populations militaires et civiles. Par conséquent, ce modèle polyvalent répond à un besoin qui englobe de multiples présentations cliniques du TCC.
Le modèle préclinique présenté ici produit des changements physiopathologiques fiables et reproductibles associés à un TCC clinique léger, comme le démontrent un certain nombre d’études antérieures17,19,20,21,22,23. Des études avec ce modèle ont montré que les rats soumis à une onde de souffle de faible intensité présentaient une neuroinflammation, une lésion axonale, des lésions microvasculaires, des changements biochimiques liés à une lésion neuronale et des déficits de plasticité et d’excitabilité synaptique à court terme19. Cependant, ce modèle de TCC léger n’a induit aucun changement neuropathologique macroscopique, y compris des lésions tissulaires, des hémorragies, des hématomes et des contusions19 qui ont été couramment observés dans les études utilisant des modèles de TCC invasifs modérés à sévères10,24. Des recherches antérieures19,21,22,23 ont montré que ce modèle préclinique peut être utilisé pour caractériser les processus neurobiologiques et physiopathologiques sous-jacents à l’étiologie du TCC léger et modéré17,19,20,21,22,23. Ce modèle permet également de tester de nouveaux composés et stratégies thérapeutiques, ainsi que d’identifier de nouvelles cibles appropriées pour le développement d’interventions efficaces contre le TCC19,21,22,23.
Ce modèle a été développé pour étudier les effets induits par les ondes de souffle ainsi que les forces de rotation rapides sur les résultats moléculaires, cellulaires et comportementaux chez les rongeurs. Analogue au modèle d’ondes de souffle présenté ici, un certain nombre de modèles précliniques ont été développés qui tentent de récapituler un TCC léger à modéré en utilisant des ondes de surpression entraînées par des gaz2,14,17,25,26,27,28. Certaines des limites des autres modèles comprennent: l’animal est fixé à une civière en treillis métallique et la tête est immobilisée lors de l’impact; les organes périphériques sont exposés à l’onde en plus du cerveau, ce qui crée les variables confondantes du polytraumatisme; et les modèles sont grands et stationnaires, ce qui limite la modification et l’adaptation de paramètres critiques pour mieux modéliser des conditions qui rappellent le TCC humain.
Les avantages de cette configuration de tube d’amortisseur à gaz de paillasse sont son coût relativement faible pour les dépenses d’acquisition et d’exploitation, ainsi que la facilité d’installation et d’utilisation. En outre, la configuration permet un fonctionnement à haut débit et la génération d’ondes de souffle reproductibles contrôlées et de résultats in vivo chez la souris et le rat. Afin de contrôler des conditions d’essai constantes (c.-à-d. ondes de souffle constantes et surpression), l’installation est équipée de capteurs de pression. Les avantages de ce modèle pour le TCC comprennent l’évolutivité de la gravité de la blessure et le fait que le TCC léger est induit à l’aide d’une procédure non invasive à tête fermée. La surpression maximale et les lésions cérébrales subséquentes augmentent avec des membranes de polyester plus épaisses de manière évolutive et cohérente17. La capacité d’évaluer la gravité du TCC en fonction de l’épaisseur de la membrane est un outil utile pour déterminer le niveau auquel des mesures de résultats spécifiques (p. ex., neuroinflammation) deviennent évidentes. La fourniture d’un blindage protecteur pour les organes périphériques permet également une enquête ciblée sur les mécanismes légers du TCC en évitant ou en réduisant les variables confondantes des lésions systémiques, telles que les lésions pulmonaires ou thoraciques. De plus, cette configuration permet de sélectionner la direction par laquelle l’onde de souffle frappe / pénètre la tête (c’est-à-dire de face, de côté, de haut ou de dessous) et, par conséquent, différents types d’insultes induisant un TCC peuvent être étudiés. La procédure standard pour induire un TCC léger à modéré décrit ici utilise une exposition latérale pour évaluer les effets des lésions dues aux ondes de souffle en combinaison avec des blessures par coup d’État et contrecoup dues à des forces de rotation rapides. De plus, afin d’étudier exclusivement les blessures causées par le souffle, l’exposition aux ondes de souffle descendantes peut être utilisée dans ce modèle.
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Protocol
Le protocole suit les directives de soins aux animaux de l’Université de Cincinnati et de l’Université de Virginie-Occidentale. Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) et ont été effectuées conformément aux principes du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.
1. Installation de la configuration blast TBI
- Acquérir toutes les pièces de travail nécessaires à l’installation, y compris: tube de choc composé d’une section d’entraînement et de conducteur en acier, d’une membrane en polyester, de boulons de fixation, de capteurs de pression, d’un bouclier de tuyau en polychlorure de vinyle (PVC) pour protéger les organes périphériques, d’une conduite hydraulique haute pression de 9,53 mm et d’accessoires mâles et femelles à connexion rapide, d’un régulateur de gaz à haut débit et d’une bouteille de gaz avec support mural (voir Figure 1A, B et Table des matières).
REMARQUE: Les spécifications de la section entraînée et pilote utilisée ici (voir la figure 2 et la table des matériaux) ont été établies pour produire une onde de souffle à l’échelle cohérente de courte durée (voir la figure 3C, D) pour induire un TCC léger à modéré chez la souris. À cette fin, une section de pilote courte conçue de manière conique (6° conique) a été sélectionnée. La longueur et le diamètre des sections entraînées et pilotes peuvent être modifiés pour rechercher spécifiquement les ondes de souffle29,30,31,32, les ondes de compression18 ou la dynamique des ondes de choc33. Pour les expériences sur des rats, les dimensions du tube de choc doivent être adaptées pour produire des forces comparables en fonction des paramètres d’échelle du corps pertinents17 (voir tableau des matériaux). - Installez les différentes parties de travail de l’installation sur des tables coulissantes de machine qui sont fixées sur une surface stable et facile à nettoyer (de préférence en acier inoxydable pour une utilisation chez les rongeurs) dans un espace de laboratoire approuvé pour les expériences sur les animaux.
REMARQUE: Les expériences d’ondes de souffle produisent un niveau de bruit considérable; choisissez donc un emplacement dans un espace de laboratoire insonorisant, où le bruit n’interférera pas avec d’autres expériences / groupes de laboratoire.- Fixez le bouclier de tuyau en PVC perpendiculairement à la configuration du tube de choc afin que le corps du rongeur soit entièrement recouvert et que seule la tête dépasse.
REMARQUE: Pour la procédure standard visant à induire un TCC léger à modéré décrite ici, le centre de la tête est situé à 5 cm de l’extrémité de la section entraînée pour les souris. - Bouteille de gaz murale à proximité de l’installation conformément à l’OSHA et à toutes les autres réglementations de sécurité pertinentes.
REMARQUE: L’air comprimé, l’hélium ou l’azote gazeux sont couramment utilisés pour générer les ondes de souffle dans les modèles de tubes de choc de rongeurs. Toutes les données présentées ici ont été générées à l’aide d’hélium, car ce gaz produit une surpression plus élevée sur une durée plus courte34, ce qui permet une mise à l’échelle appropriée pour les sujets murins.
- Fixez le bouclier de tuyau en PVC perpendiculairement à la configuration du tube de choc afin que le corps du rongeur soit entièrement recouvert et que seule la tête dépasse.
2. Évaluation de la configuration et des propriétés des ondes de souffle à l’aide d’enregistrements de capteurs de pression.
- Préparez le tube de choc.
- Coupez soigneusement la membrane de polyester sans se plier et sans produire de fissures, afin d’assurer une rupture constante.
- Insérez la membrane entre les sections entraînées et pilotes. Fixez les sections en serrant les boulons de connexion.
- Vérifiez que le système est étanche à l’air et que la membrane est bien fixée entre les sections du conducteur et celles entraînées.
- Connectez le réservoir de gaz via un tuyau hydraulique haute pression de 9,53 mm et connectez rapidement les attaches au tube de choc
REMARQUE: Les sections de commande et entraînées sont usinées selon des tolérances précises afin de permettre une étanchéité complète de la membrane entre les sections. Cela ne permet aucune fuite de gaz et empêche l’utilisation de toute forme de matériau de joint / joint torique et permet une plus grande cohérence dans la forme d’onde générée.
- Installez les capteurs de pression pour surveiller les ondes de souffle (voir Figure 1C).
- Placez un capteur de pression dans la zone de placement de la tête et trois capteurs à la sortie du tube d’amortisseur (voir les figures 1C et 2).
- Lancez l’enregistrement à partir de capteurs de pression, juste avant l’exécution des ondes de souffle. Enregistrez les données des ondes de pression à 500 000 images par seconde à l’aide d’un conditionneur de signaux de capteur et d’une carte d’acquisition de données (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE: Portez des cache-oreilles approuvés par la OHSA pour assurer une protection auditive adéquate. - Ouvrez complètement la vanne principale du réservoir de gaz comprimé pour permettre au flux de gaz de produire un pic de pression soudain et rapide.
REMARQUE: La surpression de gaz rompt la membrane de polyester pour libérer une onde de choc qui se transforme en onde de compression dans la section entraînée et sort du tube dans la direction de la zone de placement de la tête. - Coupez le débit de gaz immédiatement après la procédure.
REMARQUE: La configuration peut être équipée d’un clapet de retour à ressort pour arrêter automatiquement et rapidement le flux de gaz. - Analysez les enregistrements d’ondes de pression à l’aide d’un programme informatique écrit personnalisé pour déterminer la surpression de crête et les données graphiques. Les données peuvent être représentées graphiquement avec chaque capteur individuellement ou superposées les unes aux autres pour démontrer la planarité de l’onde générée (voir Figure 3C,D).
REMARQUE: L’analyse peut techniquement être effectuée à l’aide d’un logiciel plus facilement disponible, mais en raison des grands ensembles de données, ces programmes ont de longs retards dans la génération de graphiques.
- Établir des conditions expérimentales adéquates à l’objectif de l’étude de TCC désignée et confirmer que le modèle produit une onde de souffle cohérente avec une surpression, une durée et une mesure d’impulsion de pointe comparables à une onde de Friedlander (voir la figure 3). Vérifiez ces paramètres à l’aide du logiciel susmentionné.
- Calibrez la configuration en répétant les étapes 2.1.1. au 2.2.5. et utilisez les enregistrements d’ondes de pression pour déterminer si la configuration doit être ajustée (pour des données représentatives, voir la figure 3).
- Modifiez la configuration (si nécessaire).
REMARQUE: Les propriétés des ondes de souffle peuvent être ajustées par des modifications mineures de la configuration. Par exemple, la distance entre la tête et l’extrémité de la section entraînée influe sur la force des ondes de souffle au niveau de la tête. L’épaisseur de la membrane de polyester détermine le niveau de surpression de crête, les membranes plus épaisses augmentant les niveaux de crête (voir Figure 3A, B). De plus, la configuration permet de sélectionner la direction par laquelle l’onde de souffle frappe / pénètre dans la tête (c’est-à-dire la tête, sur le côté, en haut ou en dessous) et donc différents aspects peuvent être étudiés, tels que la blessure par ondes de souffle seule ou en combinaison avec une blessure de coup et de contrecoup due à des forces de rotation rapides. - Répétez les étapes 2.1.1 à 2.2.4 pour établir les propriétés souhaitées des ondes de souffle (si nécessaire) et contrôler la reproductibilité.
- Répétez les étapes 2.1.1 à 2.2.4 avec des membranes en polyester de différentes épaisseurs pour évaluer l’évolutivité de la configuration (pour des données représentatives, voir figure 3A,B).
3. Préparation de la configuration expérimentale et induction d’un TCC léger chez les rongeurs
REMARQUE: Transférer les rongeurs dans la zone d’attente 30 min à 1 h avant le début des expériences de TCC pour s’acclimater. Sélectionnez la zone d’attente qui est le moins affectée par le bruit de la procédure.
- Préparez tout le matériel nécessaire à l’expérience et vérifiez la configuration pour une installation correcte (par exemple, ajustez les paramètres en fonction de l’objectif de l’étude) (~ 5 à 10 minutes).
REMARQUE: La gravité de la blessure peut être ajustée en sélectionnant l’épaisseur de la membrane en polyester. Sur la base de nos études, une épaisseur de membrane de 25,4 à 102 μm est utilisée pour les traumatismes crâniens légers à modérés chez la souris35. Nous avons déjà utilisé des membranes d’une épaisseur de 76,2 à 127 μm pour produire un TCC léger à modéré chez le rat19.- Coupez soigneusement la membrane en polyester, insérez-la entre les sections entraînée et pilote et fixez-la en serrant les boulons de connexion.
- Connectez le réservoir de gaz au tube d’amortisseur à l’aide de raccords à dégagement rapide. Assurez-vous que la membrane est bien fixée entre les sections du conducteur et celles entraînées.
- Placez trois capteurs de pression à la sortie du tube de choc, espacés de 120°, pour surveiller les propriétés des ondes de souffle pendant l’induction du TCC comme décrit aux étapes 2.2.2 et 2.2.5.
- Assurez-vous que la distance par rapport à l’extrémité de l’appareil à tube de choc est correcte pour chaque sujet respectif à l’aide du micromètre installé. Gardez le positionnement de la tête du rongeur (c.-à-d. position, distance) constant dans les études pour permettre une évaluation cohérente des blessures.
NOTE: Comme indiqué au point 1.2.1., différents types de blessures peuvent être induits en sélectionnant la direction dans laquelle l’onde de choc frappe la tête. Pour que la procédure induise un TCC léger à modéré décrit ici, le corps est placé perpendiculairement au tube de choc que l’onde de choc frappe le côté de la tête. Dans ce cadre, la tête est autorisée à se déplacer librement et est donc exposée à l’onde de souffle et aux forces de rotation rapides permettant la génération d’effets de coup et de contrecoup. - Lancez l’enregistrement à partir des capteurs de pression à l’aide de l’interface utilisateur graphique (GUI) du logiciel.
- Anesthésie et positionnement des rongeurs en configuration
- Transférer les rongeurs de la salle d’attente et induire une anesthésie avec 4% d’isoflurane dans l’oxygène et maintenir avec 2% d’isoflurane dans l’oxygène pour réduire la détresse et la douleur.
REMARQUE: Assurez-vous que l’animal ne réagit pas au pincement des orteils ou de la queue avant de continuer. Assurez-vous que l’induction de l’anesthésie est cohérente pour tous les animaux de laboratoire, y compris les témoins simulés. Cette procédure nécessite une anesthésie de faible niveau et de courte durée. - Placez le rongeur entièrement anesthésié dans le bouclier de tuyau en PVC avec amortissement pour protéger les organes périphériques de l’onde de souffle.
REMARQUE: Les sujets témoins sont anesthésiés et placés à proximité de la configuration, mais ne sont pas directement soumis à l’onde de choc. Assurez-vous que les commandes sont soumises au bruit généré par le tube de choc. - Placez la tête du rongeur dans la zone de placement de la tête et soutenez-la par le bas, soit par un support intégré directement dans l’appareil de blindage, soit par un tampon de gaze. Déterminez l’alignement de la tête en fonction de l’anatomie de chaque rongeur, avec le condyle occipital aligné avec le bord du blindage protecteur.
REMARQUE: Évitez de diriger l’onde de pression directement vers le tronc cérébral pour réduire la mortalité. Les lésions du centre respiratoire du tronc cérébral et de la moelle épinière cervicale sont connues pour contribuer à des anomalies respiratoires et même à la mort chez les rongeurs de TCC36,37,38.
- Transférer les rongeurs de la salle d’attente et induire une anesthésie avec 4% d’isoflurane dans l’oxygène et maintenir avec 2% d’isoflurane dans l’oxygène pour réduire la détresse et la douleur.
- Exposition des rongeurs aux ondes de souffle.
- Ouvrez rapidement la vanne principale du réservoir de gaz comprimé pour produire un pic de pression qui rompt la membrane et produire une forte explosion qui confirme la génération d’une onde de pression. La membrane sera visuellement rompue lorsqu’elle sera retirée après l’expérience.
REMARQUE: Une caméra à grande vitesse peut être utilisée pour capturer les effets de coup et de contrecoup de l’accélération de rotation subie par le rongeur pour une analyse plus approfondie. - Coupez le flux de gaz immédiatement après avoir entendu l’explosion.
- Ouvrez rapidement la vanne principale du réservoir de gaz comprimé pour produire un pic de pression qui rompt la membrane et produire une forte explosion qui confirme la génération d’une onde de pression. La membrane sera visuellement rompue lorsqu’elle sera retirée après l’expérience.
- Récupération de l’exposition aux ondes de souffle
- Après l’exposition aux ondes de souffle, retirez le rongeur de l’appareil et placez-le sur une surface plane directement adjacente au tube de choc sur le côté.
- Surveillez les sujets pour déterminer le temps de réflexe de redressement (RRT). Utilisez un chronomètre pour enregistrer le temps écoulé entre l’exposition aux ondes de souffle et le fait qu’ils retrouvent leur réflexe de redressement inhérent. (voir la figure 4A).
- Dès que les sujets retrouvent leur réflexe de redressement, placez-les dans leur cage d’origine respective où ils sont surveillés pour détecter les effets indésirables (c.-à-d. convulsions, difficulté à respirer, saignements d’un orifice corporel) pendant les 24 heures suivantes.
- Après la période de surveillance initiale, les sujets peuvent être analysés à l’aide de divers tests biochimiques, neuropathologiques, neurophysiologiques et comportementaux choisis par le chercheur (voir ci-dessous).
- Préparez la configuration et l’espace pour la prochaine expérience.
- Nettoyez l’installation avec du détergent pour éliminer les odeurs.
4. Applications en aval pour les rongeurs exposés aux ondes de souffle/forces de rotation et contrôles
REMARQUE: Dans des études antérieures, les effets d’un TCC léger à modéré à divers moments après l’exposition à une onde de souffle et à des forces de rotation ont été évalués chez les rongeurs à l’aide d’applications en aval, y compris des analyses biochimiques, neuropathologiques, neurophysiologiques et comportementales19.
- Analyse biochimique
- À des moments expérimentaux définis (heures à quelques jours après un TCC léger), prélèvent des tissus (p. ex. cerveau, sang) pour analyse biochimique à l’aide de protocoles standard décrits19.
- Utiliser les tissus pour l’analyse biochimique (c.-à-d. immunobuvardage, ELISA, etc.) afin d’évaluer l’effet d’un TCC léger sur les processus neurobiologiques et physiopathologiques.
- Analyse neuropathologique
- À des moments expérimentaux définis (heures à quelques jours après un TCC léger), perfuser les rongeurs de manière transcardique avec une solution saline suivie d’une solution de paraformaldéhyde à 4 % pour fixer les tissus comme décrit19.
REMARQUE: Certaines applications ne sont pas compatibles avec la fixation du paraformaldéhyde (par exemple, coloration à l’argent, certains anticorps pour l’immunohistochimie). - Utiliser du tissu perfusé et fixe pour des analyses anatomiques, histologiques et moléculaires afin d’évaluer les changements neuropathologiques associés à un TCC léger, y compris la neuroinflammation, la neurodégénérescence et les changements neurochimiques décrits19.
- À des moments expérimentaux définis (heures à quelques jours après un TCC léger), perfuser les rongeurs de manière transcardique avec une solution saline suivie d’une solution de paraformaldéhyde à 4 % pour fixer les tissus comme décrit19.
- Analyse neurophysiologique dans les tranches de cerveau
- À des moments expérimentaux définis (des heures à des jours après un TCC léger), sacrifiez les rongeurs par décapitation, retirez le cerveau et préparez des tranches de cerveau comme décrit19.
- Effectuer des enregistrements électrophysiologiques comme décrit19 pour évaluer l’effet d’un TCC léger sur les propriétés synaptiques basales et la plasticité synaptique.
- Analyse comportementale
- À des moments expérimentaux définis (heures à jours après un TCC léger), évaluer la performance comportementale, y compris la fonction motrice (par exemple, champ ouvert, rotarod, activité locomotrice; voir la figure 4D) et l’apprentissage et la mémoire (par exemple, conditionnement de la peur, labyrinthe de Barnes, labyrinthe d’eau de Morris).
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Representative Results
L’évolutivité de la configuration des ondes de souffle a été testée en utilisant trois épaisseurs de membrane différentes, 25,4, 50,8 et 76,2 μm. Les niveaux de pression de crête ont été évalués à la zone de placement de la tête et à la sortie de l’appareil à tube de choc à l’aide de capteurs de pression piézoélectriques (voir Figure 1 et Figure 2). Les pressions de crête augmentent en concordance avec l’épaisseur de la membrane aux deux emplacements du capteur (Figure 3A, B), démontrant que la pression de crête est de nature évolutive. Cette propriété de la configuration peut être exploitée pour calibrer le système et évaluer son évolutivité comme décrit à l’étape 2.3.
Afin d’évaluer les effets du TCC induit par les explosions in vivo, des souris adultes, âgées de 3 mois, mâles de type sauvage C57Bl/6J ont été exposées à des ondes de souffle produites par cette configuration (Figure 1 et Figure 2) en utilisant le protocole décrit ici. Tout d’abord, les effets des ondes de souffle produites avec deux épaisseurs de membrane différentes (50,8 et 76,2 μm) ou du traitement simulé sur le temps réflexe de redressement (RRT) ont été évalués (Figure 4A). La latence des souris pour se redresser complètement (4 pattes au sol) après anesthésie est déterminée ici comme RRT. Les souris ont été anesthésiées à l’aide d’isoflurane (anesthésie uniforme, courte et légère), puis ont subi une induction du TCC ou un traitement fictif. Immédiatement après la blessure, les souris ont été autorisées à récupérer et le temps de retrouver le réflexe de redressement a été enregistré. Les souris qui ont été exposées à une onde de choc produite avec la membrane de 76,2 μm ont présenté une augmentation significative de la RRT par rapport aux témoins simulés qui ont subi la même procédure d’anesthésie (Figure 4A), ce qui suggère que cette onde de souffle induit une perte de conscience. En revanche, les souris exposées à une onde de souffle de la membrane de 50,8 μm ne présentent aucune augmentation significative de la TRR (figure 4A), ce qui indique une forme bénigne de TCC. La rupture d’une membrane de polyester standard de 76,2 μm entraîne la génération rapide d’une onde de souffle de courte durée d’environ 160 psi de surpression (figure 3C), à laquelle le côté gauche du crâne du sujet est exposé au cours de la procédure expérimentale.
Les effets physiologiques à court terme survenant après l’exposition aux ondes de souffle et aux forces de rotation chez les rongeurs ne sont actuellement pas bien caractérisés. Pour délimiter les effets aigus de l’exposition aux ondes de souffle et des forces de rotation de ce modèle, nous avons évalué la régulation de la température corporelle centrale et le poids corporel. La température et le poids corporel des souris adultes, âgées de 3 mois, mâles de type sauvage C57Bl/6J ont été enregistrés après l’induction d’un TCC. La température corporelle centrale de base et le poids corporel de base ont été enregistrés chez les souris avant la procédure de TCC ou le traitement simulé. L’exposition à une onde de souffle produite avec la membrane de 76,2 μm a considérablement diminué la température corporelle au cours de la première heure chez les souris induites par le TCC par rapport à leurs témoins simulés (Figure 4B), ce qui indique un effet physiologique significatif produit par l’induction du TCC. De façon constante, les souris soumises à un TCC à l’aide de membranes de 76,2 μm ont présenté une réduction aiguë, dépendante du temps mais significative du poids corporel total un jour après le TCC par rapport à l’imposture (Figure 4C).
Afin d’examiner l’impact du TCC sur les résultats comportementaux, l’effet du TCC induit par les explosions sur l’activité locomotrice aiguë a été analysé (Figure 4D). Des souris C57Bl/6J mâles adultes, âgées de 3 mois, ont subi une induction de TCC à l’aide d’un traitement membranaire ou simulé de 76,2 μm et l’activité locomotrice a été surveillée pendant 30 minutes trois heures après le TCC. L’exposition à une onde de choc produite avec la membrane de 76,2 μm a entraîné une diminution aiguë et significative de l’activité locomotrice (figure 4D).
Figure 1 : Configuration du modèle murin d’ondes de souffle. (A-C) Images représentatives de la configuration du modèle d’ondes de souffle pour les souris. Vue latérale de la configuration (A). Vue de dessus de la configuration (B). 1, bouteille de gaz avec un régulateur de gaz à haut débit; 2, ligne hydraulique haute pression de 9,53 mm et attaches mâles et femelles à connexion rapide; 3, section du conducteur du tube d’amortisseur; 4, section entraînée du tube de choc; 5, bouclier de tuyau en PVC; 6, zone de placement de la tête; 7, membrane en polyester. Les différentes parties de la configuration sont installées sur des tables coulissantes de la machine permettant un positionnement précis du conducteur (3) et des sections entraînées (4) par rapport au sujet subissant une induction de blessure. (C) Vue de dessus de la configuration avec placement des capteurs de pression. Trois capteurs sont situés dans un plan à la sortie du tube de choc, à 120 degrés l’un de l’autre (S1 - S3), pour surveiller les propriétés des ondes de souffle pendant l’induction du TCC. Un capteur est installé dans la zone de placement de la tête (S4). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Schéma du tube de choc de surpression murin. Le tube de choc usiné avec précision est fabriqué à partir d’acier à haute résistance. L’espace interne de la section du conducteur est incliné à 6 degrés. Le diamètre intérieur du conducteur et de la section entraînée est de 37 mm. Les surfaces d’accouplement des sections entraînées par le conducteur sont usinées avec précision pour assurer une étanchéité complète. L’ensemble du tube de choc est fixé industriellement à une table coulissante de machine pour assurer un montage solide et la cohérence de la génération d’ondes de souffle. À la sortie de la section entraînée, des trous sont percés (dans un plan, espacés de 120°) pour installer les trois capteurs de pression (indiqués par *). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Enregistrements de pression provenant de la configuration des ondes de souffle murines. (A,B) La pression de crête est évolutive et dépend de l’épaisseur de la membrane de polyester. Des capteurs de pression ont été utilisés pour enregistrer les pressions de crête produites par le tube de choc avec des membranes d’hélium gazeux et de polyester de 25,4, 50,8 ou 76,2 μm d’épaisseur. (A) À la zone de placement de la tête, la pression de crête moyenne produite avec des membranes de 25,4 μm était de 428 ± 15,9 kPa, avec des membranes de 50,8 μm de 637 ± 21,4 kPa et avec des membranes de 76,2 μm 1257 ± 40,7 kPa (SEM, n = 7-12, ANOVA unidirectionnelle suivie de l’essai de comparaison post-hoc de Dunnett, *** P ≤ 0,001). (B) À la sortie du tube de choc, la pression de crête moyenne enregistrée avec des membranes de 25,4 μm était de 164 ± 11,7 kPa, avec des membranes de 50,8 μm 232 ± 11,7 kPa et avec des membranes de 76,2 μm 412 ± 11,0 kPa (SEM, n = 7-12, ANOVA unidirectionnelle suivie de l’essai comparatif post-hoc de Dunnett, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001). (C) Graphique représentatif de l’enregistrement de la pression du capteur à la zone de placement de la tête (capteur incident) à l’aide d’une membrane de 76,2 μm. La forme d’onde est similaire à celle d’une onde de Friedlander, mise à l’échelle en temps/durée pour les sujets murins. (D) Graphique représentatif de l’enregistrement de pression à partir de 3 capteurs distincts situés à l’extrémité de la section entraînée pour déterminer la linéarité/phase de la forme d’onde dans la section entraînée. Les trois capteurs (situés à 120 degrés l’un de l’autre) montrent une durée de montée / descente similaire, ce qui indique que la forme d’onde quittant la section entraînée est similaire en section transversale dans la section entraînée. L’onde de choc a été générée à l’aide d’une membrane de 76,2 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Effets in vivo aigus du TCC induit par les explosions. (A) Un TCC modéré, mais pas léger, augmente le temps de réflexe de redressement (RRT). Des souris C57Bl/6J mâles adultes, âgées de 3 mois, de type sauvage, ont été soumises à des procédures de TCC à l’aide du tube de choc avec des membranes d’hélium gazeux et de polyester de 50,8 ou 76,2 μm d’épaisseur ou un traitement simulé. Immédiatement après une blessure ou un traitement fictif, les souris ont été autorisées à se rétablir et une TRR a été enregistrée. L’induction du TCC avec une membrane de 50,8 μm ou un traitement simulé a présenté des niveaux comparables de RRT. En revanche, l’induction du TCC à l’aide d’une membrane de 76,2 μm augmente la RRT, ce qui indique une perte de conscience induite par l’onde de souffle avec la membrane de 76,2 μm (SEM, n = 4-10, Sham RRT = 35,6 ± 2,0 s, 50,8 μm membrane RRT = 43,0 ± 4,3 s et 76,2 μm membrane RRT = 254,0 ± 40,2 s, ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison post-hoc de Dunnett, P ≤ 0,001). (B) Un TCC modéré réduit de manière significative et transitoire la température corporelle centrale. Des souris C57Bl/6J mâles adultes, âgées de 3 mois, de type sauvage, ont été soumises à l’induction d’un TCC avec des membranes de 76,2 μm ou à un traitement fictif. Leur température corporelle centrale a été enregistrée pendant deux heures. La température corporelle centrale de base a été enregistrée avant l’induction du TCC. Le TCC induit par les explosions avec des membranes de 76,2 μm est associé à une baisse significative de la température corporelle centrale dans la première heure suivant le TCC. (SEM, n = 10, ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles, suivies des tests de comparaison multiples post-hoc de Bonferroni, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001). (C) Un TCC modéré entraîne une réduction transitoire du poids corporel. Des souris C57Bl/6J mâles adultes, âgées de 3 mois, ont été soumises à des procédures de TCC à l’aide de membranes de 76,2 μm ou d’un traitement fictif. Par la suite, les poids corporels ont été enregistrés pendant 5 jours. Le poids corporel total a été significativement réduit un jour après le TCC (SEM, n = 7, mesures répétées bidirectionnelles ANOVA suivies des tests de comparaison multiples de Bonferroni post-hoc, * P ≤ 0,05). (D) Un TCC modéré entraîne une réduction aiguë de l’activité locomotrice. Des souris C57Bl/6J mâles adultes, âgées de 3 mois, ont été soumises à des procédures de TCC à l’aide de membranes de 76,2 μm ou d’un traitement fictif. Trois heures après le TCC, l’activité locomotrice a été suivie pendant 30 minutes et quantifiée à l’aide d’un logiciel de suivi vidéo (SEM, n = 9-11, test t à deux queues non apparié, ** P = 0,01). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous présentons ici un modèle préclinique de TCC léger qui est rentable, facile à mettre en place et à exécuter, et qui permet des résultats expérimentaux à haut débit, fiables et reproductibles. Ce modèle fournit un blindage protecteur aux organes périphériques pour permettre une enquête ciblée sur les mécanismes légers du TCC tout en limitant les variables confondantes des lésions systémiques. En revanche, d’autres modèles de blast sont connus pour infliger des dommages aux organes périphériques2,39,40. Un autre avantage de ce modèle est sa capacité à délivrer l’onde de choc sous n’importe quel angle souhaité par rapport à la position fixe dans d’autres modèles de souffle40. Cela permet des études anatomiques ciblées pour mieux comprendre la vulnérabilité du cerveau.
Afin d’étudier le TCC humain lié au souffle, un modèle pertinent pour le TCC devrait produire des forces biomécaniques comparables à celles vécues par les sujets lors de l’induction du TCC. Un modèle cliniquement pertinent devrait également induire des résultats neurobiologiques, physiopathologiques et comportementaux observés chez les sujets souffrant d’un TCC léger. Dans des études antérieures, le modèle d’ondes de choc présenté ici a été examiné en profondeur17,19,21, et de nombreux aspects biophysiques et neurobiologiques rappelant le TCC humain, y compris la dynamique et les forces des ondes de souffle, la neuroinflammation, les lésions axonales et les lésions microvasculaires ont été évalués. Ces études ont fourni des preuves que ce modèle préclinique d’ondes blastiques pour le TCC produit des changements neurobiologiques et physiopathologiques fiables et reproductibles associés au TCC clinique.
De plus, avec l’incidence accrue de TCC légers au sein de la population militaire7,8, ce modèle polyvalent de rongeurs pour le TCC humain léger fournit aux chercheurs un outil précieux pour étudier les processus sous-jacents au TCC liés aux explosions et explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par exemple, notre modèle démontre des complications neurovasculaires et souligne l’importance de l’intervention vasculaire en tant qu’approche thérapeutique prometteuse22,23,35. De manière constante, d’autres modèles précliniques de TCC blastique ont également produit des effets neurovasculaires associés à la neurodégénérescence et aux déficits comportementaux2,25,40,41,42,43.
Sur la base de recherches antérieures19,21,22,23, nous avons établi que le modèle d’ondes de souffle présenté ici pourrait être bien adapté à l’étude de la physiopathologie et de l’étiologie des commotions cérébrales humaines. La plupart des modèles précliniques de TCC ne permettent pas le mouvement de la tête44, même si les propriétés biomécaniques associées à l’accélération/décélération rapide de la tête sont un facteur prédictif du développement d’une commotion cérébrale chez l’homme45,46. Conformément au modèle décrit ici, Goldstein et ses collègues14 ont montré que le mouvement rapide de la tête induit par les forces de souffle est une condition préalable à l’induction de déficits comportementaux, peut-être dus aux forces de rotation et au cisaillement. Une meilleure compréhension des changements physiopathologiques qui se produisent dans les traumatismes crâniens légers et en réponse aux commotions cérébrales aiderait également à déterminer les biomarqueurs cliniques et à identifier de nouvelles cibles pour le développement de traitements pour le TCC.
On sait peu de choses sur les changements physiopathologiques et la progression de la maladie à la suite d’un TCC léger répétitif (p. ex., commotion cérébrale répétitive vécue dans le sport). Ce modèle préclinique permet d’étudier les TCC légers répétitifs avec peu ou pas de mortalité. En revanche, certains modèles de TCC infligent des blessures graves et, par conséquent, il est souvent difficile, voire inhumain, d’induire d’autres blessures. De plus, les blessures graves sont souvent irréparables et la détection de changements physiologiques subtils peut être exclue. Ce modèle permet également l’étude évolutive de divers intervalles entre blessures; un paramètre critique pour les traumatismes crâniens légers répétitifs qui nécessite une caractérisation plus poussée. Après un TCC, une réponse à une blessure du SNC est déclenchée qui aide à protéger l’intégrité du cerveau et à prévenir la mort généralisée des cellules neuronales. L’intervention en cas de blessure peut en effet être considérablement influencée par l’induction d’une autre blessure dans un court laps de temps après la blessure initiale. Ce modèle permet d’étudier l’intervalle entre les lésions, qui est un aspect important de la conception des essais cliniques pour les traumatismes crâniens légers répétitifs. De plus, ce modèle évolutif permet un flux de travail rapide à haut débit, ce qui facilite l’étude de plusieurs paramètres simultanément, ainsi que l’évaluation de l’activité thérapeutique de nouvelles interventions.
L’une des limites de ce modèle est l’incapacité de contrôler les propriétés de l’onde de choc entre la sortie du tube et la tête de l’animal. Bien que l’onde de choc soit turbulente à la sortie du tube de choc, les mesures de résultat sont toujours fiables et reproductibles avec un positionnement cohérent de la tête du rongeur18. Par conséquent, il est important de maintenir les paramètres expérimentaux (c.-à-d. la position de la tête et la distance par rapport à la sortie du tube de choc) constants entre toutes les études. Afin d’optimiser la conception et le protocole du modèle, la dynamique de la forme d’onde entre la sortie du tube et la zone de placement de la tête a été mesurée (Figure 3) et modélisée à l’aide de simulations numériques18. Les projets futurs intégreront la modélisation par éléments finis pour déterminer comment la dynamique des forces se transfère du crâne aux méninges, au liquide céphalo-rachidien et enfin au tissu cérébral. L’interaction complexe de la dynamique des forces et de la biophysique et des réponses physiologiques qui en résultent sont des domaines importants de la recherche sur les traumatismes crâniens qui ont été jusqu’à présent sous-explorés.
En résumé, nous présentons ici un protocole et une expérience visualisée d’un modèle de lésion par ondes de souffle qui a été développé pour étudier les effets d’un TCC léger. L’expérience collective d’ingénieurs, de médecins et de scientifiques biomédicaux a contribué à l’optimisation de sa validité biophysique/physiologique et de sa pertinence neurobiologique. Ce modèle a été validé en profondeur et a déjà produit des résultats significatifs, en particulier dans la compréhension de la dynamique précoce du TCC léger17,19,20,21,22,23. L’exploitation de ce modèle préclinique pour étudier plus avant le TCC léger fera progresser considérablement notre compréhension de la physiopathologie et de l’étiologie du TCC et contribuera au développement de nouvelles interventions au profit des patients souffrant de TCC.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions R. Gettens, N. St. Johns, P. Bennet et J. Robson pour leur contribution à l’élaboration du modèle TBI. Des subventions narSAD pour jeunes chercheurs de la Brain & Behavior Research Foundation (F.P. et M.J.R.), une subvention de recherche du Darrell K. Royal Research Fund for Alzheimer’s Disease (F.P.) et une bourse de la Fondation PhRMA (M.J.R.) ont soutenu cette recherche. Ce travail a été soutenu par des bourses pré-doctorales de l’American Foundation for Pharmaceutical Education (A.F.L et B.P.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3/8 SAE High Pressure Hydraulic Hose | Eaton Aeroquip | R2-6-6-36M | Available from Grainger |
| 3/8'' Quick Connect Female Plugs | Karcher | KAR 86410440 | |
| 3/8'' Quick Connect Male Plugs | Karcher | KAR 86410440 | |
| ANY-maze video tracking software | Stoelting Co. | ANY-maze software | |
| Clear Mylar membrane | ePlastics.com | POLYCLR0.003 | http://www.eplastics.com/Plastic/Clear_Polyester_Film/POLYCLR0-003; Clear Mylar membrane is sold in various thicknesses. All are sold by vendor listed above. |
| Compound Slide Table (X2) | Grizzly Industrial | G5757 | |
| Deadman Gas Control Ball Valve | Coneraco Inc. | 71-502-01 | "Apollo", Available from Grainger |
| Driver and driven section (murine) | own design/production | n/a | For further information please contact the authors |
| Driver and driven section (rat) | own design/production | n/a | For further information please contact the authors |
| Ear Muffs | 3M | 37274 | Available from Grainger |
| Gas Regulator - Hi Flow 3500-600-580 | Harris | 3003539 | |
| Helium Gas | AirGas | HE 300 | Tanks are available in various sizes |
| Inhalation Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Input Module | National Instruments | NI 9223 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | Ordered by veterinarian |
| Laboratory Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | 50-550-352 | |
| Labview version 12.0 | National Instruments | Data Acquistion Software | |
| Magnetic Dial Indicator/Micrometer | Grizzly Industrial | G9849 | |
| MATLAB | MathWorks | Software for pressure recording analysis | |
| Oxygen Regulator | Medline | HCS8725M | |
| PC for Data Processing | Dell | ||
| Polyvinylchloride Tubing - 25.4 mm | FORMUFIT | P001FGP-WH-40x3 | |
| Pressure sensors | PCB Piezotronics | 102A05 | |
| Receiver USB Chassis | National Instruments | DAQ-9171 | |
| Sensor Signal Conditioner | PCB Piezotronics | 482C series | |
| Stainless NSF-Rated Mounting Table | Gridmann | GR06-WT2448 | |
| T Handle Allen Wrench - 3/16'' | S&K | 73310 |
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