Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Intravitreal injektion og kvantisering af infektionsparametre i en musemodel af bakteriel endophthalmitis

Published: February 6, 2021 doi: 10.3791/61749
Automatic Translation
*1,2, *1, 2,3, 4, 2,3, 1,2,3
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver her en metode til intravitreal injektion og efterfølgende bakteriel kvælning i musemodel af bakteriel endophthalmitis. Denne protokol kan udvides til måling af værtens immunrespons og bakterielle og værtsgenetielle udtryk.

Abstract

Intraokulære bakterielle infektioner er en fare for synet. Forskere bruger dyremodeller til at undersøge værten og bakterielle faktorer og immunrespons veje forbundet med infektion til at identificere levedygtige terapeutiske mål og til at teste lægemidler til at forebygge blindhed. Den intravitreal injektion teknik bruges til at injicere organismer, narkotika, eller andre stoffer direkte ind i glaslegemen i den bageste del af øjet. Her demonstrerede vi denne injektionsteknik for at starte infektion i museøjet og teknikken med kvantificering af intraokulære bakterier. Bacillus cereus blev dyrket i hjernens hjerteinfusion flydende medier i 18 timer og resuspenderet til en koncentration 100 kolonidannende enheder (CFU)/0,5 μL. En C57BL/6J mus blev bedøvet ved hjælp af en kombination af ketamin og xylazin. Ved hjælp af en picoliter mikroinjektor og glas kapillær nåle, 0,5 μL af Bacillus suspension blev injiceret i midten glaslegeme af museøjet. Det kontralaterale kontroløje blev enten injiceret med sterile medier (kirurgisk kontrol) eller blev ikke injiceret (absolut kontrol). Efter 10 timer efter infektion blev mus aflivet, og øjnene blev høstet ved hjælp af sterile kirurgiske pincet og placeret i et rør, der indeholder 400 μL steril PBS og 1 mm sterile glasperler. For ELISAs eller myeloperoxidase assays, proteinase hæmmer blev tilsat til rørene. Til RNA-ekstraktion blev den relevante lysisbuffer tilsat. Øjnene blev homogeniseret i en vævshomogenisator i 1-2 minutter. Homogenater blev seriefortyndet 10 gange i PBS og spor fortyndet på agar plader. Resten af homogenaterne blev opbevaret ved -80 °C for yderligere analyser. Pladerne blev inkuberet i 24 timer, og CFU pr. øje blev kvantificeret. Disse teknikker resulterer i reproducerbare infektioner i museøjne og lette kvantiteten af levedygtige bakterier, værten immunrespons, og omics af vært og bakteriel genekspression.

Introduction

Bakteriel endophthalmitis er en ødelæggende infektion, der forårsager betændelse, og, hvis de ikke behandles ordentligt, kan resultere i tab af syn eller blindhed. Endophthalmitis skyldes, at bakterierne kommer ind i det indre af øjet1,2,3,4,5. Når i øjet, bakterier replikere, producere toksiner og andre skadelige faktorer, og kan forårsage uoprettelige skader på sarte retinale celler og væv. Øjenskader kan også være forårsaget af betændelse, på grund af aktivering af inflammatoriske veje, der fører til inflammatoriskcelletilstrømning i det indreaføjet1,5,6. Endophthalmitis kan forekomme efter intraokulært kirurgi (postoperativ), en gennemtrængende skade på øjet (posttraumatisk), eller fra metastatisk spredning af bakterier i øjet fra et andet anatomisk sted (endogen)7,8,9,10. Behandlinger for bakteriel endophthalmitis omfatter antibiotika, anti-inflammatoriske lægemidler, eller kirurgisk indgreb3,4,11. Selv med disse behandlinger, vision eller øjet selv kan gå tabt. Den visuelle prognose efter bakteriel endophthalmitis varierer generelt afhængigt af behandlingseffektiviteten, den visuelle skarphed ved præsentationen og den inficerende organismes virulens.

Bacillus cereus (B. cereus) er en af de vigtigste bakterielle patogener, der forårsager post-traumatisk endophthalmitis7,12. Et flertal af B. cereus endophthalmitis tilfælde har en hurtig kurs, hvilket kan resultere i blindhed inden for et par dage. Kendetegnende for B. cereus endophthalmitis omfatter hurtigt udvikler intraokulært inflammation, øjensmerter, hurtigt tab af synsstyrke, og feber. B. cereus vokser hurtigt i øjet i forhold til andrebakterier,som almindeligvis forårsager øjeninfektioner2,4,12 og besidder mange virulensfaktorer. Derfor er vinduet for vellykket terapeutisk interventionrelativt kort 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Behandlinger for denne infektion er normalt en succes i behandling af endophthalmitis forårsaget af andre mindre virulente patogener, men B. cereus endophthalmitis almindeligvis resulterer i større end 70% af patienter, der lider af betydelige synstab. Omkring 50% af disse patienter gennemgår udtagning eller enucleation af det inficerede øje7,16,22,23. Den destruktive og hurtige karakter af B. cereus endophthalmitis kræver øjeblikkelig og korrekt behandling. De seneste fremskridt med hensyn til at skelne de underliggende mekanismer for sygdomsudvikling har identificeret potentielle mål for intervention19,26,27. Eksperimentelle musemodeller af B. cereus endophthalmitis fortsat være nyttige i at skelne mekanismerne for infektion og test potentielle terapeutiske, der kan forhindre synstab.

Eksperimentel intraokulært infektion af mus med B. cereus har været en instrumental model for forståelse af bakterielle og værtsfaktorer, samt deres interaktioner, under endophthalmitis28. Denne model efterligner en post-traumatisk eller post-operative begivenhed, hvor bakterier indføres i øjet under en skade. Denne model er meget reproducerbar og har været nyttig til afprøvning af eksperimentelle behandlingsformer og tilvejebringelse af data til forbedringer i standarden for pleje1,6,19,29,30. Ligesom mange andre infektion modeller, denne model giver mulighed for uafhængig kontrol af mange parametre for infektion og muliggør en effektiv og reproducerbar undersøgelse af infektion resultater. Undersøgelser i en lignende model hos kaniner i de seneste årtier har undersøgt virkningerne af B. cereus virulensfaktorer iøjet 2,4,13,14,31. Ved at indsprøjte B. cereus mutant stammer mangler individuelle eller flere virlensfaktorer, kan bidraget af disse virulensfaktorer til sygdommens sværhedsgrad måles ved resultater såsom koncentration af bakterier ved forskellige tidspunkter efter infektion eller tab af visuel funktion13,14,27,31,32. Desuden er værtsfaktorer blevet undersøgt i denne model ved at inficere knockout musestammer, der mangler specifikke inflammatoriske værtsfaktorer26,29,33,34,35. Modellen er også nyttig til at teste potentielle behandlinger for denne sygdom ved at indsprøjte nye forbindelser i øjet efter infektion30,36. I dette manuskript beskriver vi en detaljeret protokol, som omfatter at inficere et museøje med B. cereus,høste øjet efter infektion, kvantificere intraokulært bakteriebelastning og bevare prøver for at analysere yderligere parametre for sygdommens sværhedsgrad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev udført efter anbefalingerne i vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr og Association for Research in Vision og Oftalmology Statement for the Use of Animals in Oftalmmic and Vision Research. Protokollerne blev godkendt af Den Institutionelle Animal Care and Use Committee ved University of Oklahoma Health Sciences Center (protokol numre 15-103, 18-043, og 18-087).

1. Sterile glasnåle

  1. Tænd for nålepipettetrækeren.
  2. Juster varmeknappen, indtil displayet viser 12.6.
  3. Åbn lågen, og før det 5 μL kapillære rør manuelt gennem den øverste klemme og varmeapparatet, indtil halvdelen af slangen strækker sig under glødetråden (Figur 1A).
  4. Bekræft, at kapillærrøret er i "V"-rillen i den øverste klemme. Stram den øverste klemme.
  5. Når den nederste klemme er åben, skal du manuelt justere den lodrette slide op, indtil den nederste klemme når sin øvre grænse. Bekræft, at røret er i "V"-rillen i den nederste klemme. Stram den nederste klemme.
  6. Luk døren og bekræft, at 'Ready' lyset er tændt. Tryk på startknappen for at starte varmeapparatet og trække sekvens(Figur 1B).
  7. Sørg for, at varmeapparatet slukker automatisk, når varme og tyngdekraft trækker kapillærrøret fra hinanden(Figur 1C),og at diaset bevæger sig nedad.
  8. Åbn døren. Mens du holder toppen af kapillær røret, stramme den øverste klemme. Fjern det øvre kapillærrør og sæt det til side.
  9. Hold kapillærrøret i den nederste rutsjebane og stram den nederste klemme. Fjern det nederste kapillærrør og sæt det til side.
  10. Brug en mikroelektrode faceveler med en 0,05 μm aluminiumoxid abrasive slibeplade til at facet den trukket kapillær rør til at skabe injektion nåle.
  11. Pipette nok vand på slibepladen til at dække overfladen (Figur 1D).
  12. Tænd for bevelleren, så den begynder at rotere ved 60 omdrejninger i minuttet. Sæt det trak kapillærrør ind i pipetteklemmen i "V"-rillen. Stram klemmen og juster vinklen på pipetteklemmen til 30°.
  13. Juster spidsen af kapillærrørets spidse kant ca. to tredjedele afstand fra slibepladens rotationscentrum.
  14. Sænk det fastspændte kapillærrør ved at justere den grove betjeningsknap øverst på manipulatoren. Fortsæt med at sænke kapillærrøret, indtil spidsen af kapillærrøret strækker sig under vandoverfladen og kontakter slibepladens slibeflade.
  15. Overvåg beveling fremskridt ved hjælp af mikroskop knyttet til beveller. Efter 5 min, justeres den fine kontrol for at hæve glasnålen fra slibepladen.
  16. Glasnålen fjernes, og den anbringes under 10x forstørrelse for at kontrollere spidsen af kapillærrøret (Figur 1E,F).
  17. For at sikre, at der ikke er blokeringer, skal du sætte glasnålen i en pipetteholder på en sprøjte og skubbe luft ind i et 1 ml rør med 99 % ethanol. Hvis der dannes luftbobler på spidsen af nålen, har nålen ingen blokeringer og kan bruges til mikroinjektion. Denne proces sikrer også steriliteten af glasnålene.
  18. Et kapillærrør kan rumme op til 5 μL væske. Kapillærrøret anbringes i 10 sektioner for at beregne afstandene på nålen for at markere 0,5 μL volumener. Marker en skala med den afstand, der holder 0,5 μL til fremtidig forberedelse. For en 5 μL nål svarer afstande med 0,7 mm til 0,5 μL (Figur 1G).

2. Bacillus cereus kultur

  1. Udfør alle procedurer i dette afsnit under Biosikkerhedsniveau 2 betingelser.
  2. Stribefryser på B. cereus ATCC 14579 for isolering af enkeltkolonier på en 5% agarplade af fåreblod og inkuberes natten over ved 37 °C (figur 2A).
  3. Pipette 5 ml steril brain heart infusion (BHI) bouillon i en 10 ml steril snap-cap rør (Figur 2B). Ved hjælp af en steril løkke eller nål skal du vælge en enkelt koloni af B. cereus ATCC 14579 fra agarpladen og inokuler væsken BHI.
  4. Vortex prøven kort. Sæt snap-cap-røret i en roterende inkubator. Temperaturen indstilles til 37 °C og hastigheden ved 200 omdrejninger i minuttet. Efter 18 timer fjernes kulturen fra kuvøsen (Figur 2B).

3. Bakteriel fortynding til intravitreal injektion

  1. Udfør alle procedurer i dette afsnit under Biosikkerhedsniveau 2 betingelser.
  2. Beregn mængden af natten B. cereus kultur for at tilføje til 10 ml frisk BHI at opnå 200 kolonidannende enheder pr mikroliter (CFU / μL). For eksempel replikerer en overnight kultur af B. cereus i BHI til ca. 2 x 108 CFU/ml, som derefter kan fortyndes til 200 CFU/μL ved pipettering 10 μL af natten kultur i 10 ml frisk BHI.
  3. Pipette 1 ml af den nyfortyndede kultur i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Vedligehold dette rør på is indtil intravitreal injektion. Udfør den intravitreale injektion inden for 60 min fortynding af bakteriekulturen.

4. Intravitreal injektion af mus

  1. Udfør alle procedurer i dette afsnit under Biosikkerhedsniveau 2 betingelser.
  2. Forbered procedurestedet ved at placere medicinske underpuder på operationsbordet.
  3. Tænd for mikroinjektoren, og åbn gasventilen på tryklufttanken, der er fastgjort til mikroinjektoren. Juster tankregulatoren, indtil gasleveringen er ca. 60 psi.
  4. Tryk på Tilstanden på mikroinjektoren, indtil skærmen viser Balance. Tryk på Balance, og placer computermusen på operationsbordet. Tilslut pipetteholderen i rustfrit stål til injektorens fyld/udgang. Dette rør er altid forbundet til injektoren.
  5. Sæt kapillærnålen i den anden ende af pipetteholderen ved at skrue pipetteholderstikket rundt om nålen.
  6. Tænd for det oftalmologiske mikroskop og tænd lyset til en intensitet på 50%. Juster mikroskopet over procedurestedet på operationsbordet, og juster mikroskopet til det ønskede fokus.
  7. Før proceduren begynder, skal du bekræfte, at musen er tilstrækkeligt bedøvet ved at teste pedalen tilbagetrækning refleks. Sørg for at følge din IACUC godkendte protokol for anæstesi.
  8. Placer bedøvet musen på den medicinske underpads med næsen pegede mod højre og læner sig på sin venstre side.
  9. Kig på det højre øje af musen gennem oftalmologiske mikroskop og åbne lågene ved at åbne tang af en omvendt handling tang på hver side af øjet til at eksponere injektionsstedet (Figur 3C).
  10. Fyld kapillærnålen med 200 CFU/μL fortynding ved venstre klikke på musemåtten tilsluttet mikroinjektoren (Figur 3D).
  11. Fastgør dyrets hoved med venstre hånd og læg spidsen af nålen på limbus i øjet. Når nålen er i facett position og i 45 ° vinkel, punktere museøjet, men sørg for, at kun den skarpe spids af nålen (~ 0,5 mm) er indsat ved injektion.
  12. Når nålespidsen er sat i, skal du flytte venstre hånd fra musehovedet til musemåtten og højreklikke på musemåtten for at injicere 0,5 μL af B. cereus fortyndingen. For at undgå lækage skal nålespidsen efterlades inde i museøjet i 2-3 sekunder, før du fjerner(Figur 3E)1,19,26,27,32,34,36,37,38.
  13. Slip sceinerne og læg musen i et bur, der sidder på en opvarmning pad. Disse mus overvåges, indtil de er kommet sig efter bedøvelse (Figur 3F).
  14. Når mus er genvundet fra anæstesi, returnere buret til sin rette rack. Hvis musene vil blive udsat for retinal funktion analyse ved elektroretinografi, bure bør returneres til et mørkt rum for korrekt mørk tilpasning.

5. Forberedelse af høstrør

  1. Placer 1 mm sterile glasperler i 1,5 ml skruelrør.
  2. Steriliser disse rør i en autoklave på tør indstilling. Lad rørene køle af til stuetemperatur før brug.
  3. Der tilsættes 10 ml 1x sterilt fosfat-bufferet saltvand (PBS) til et sterilt 15 ml centrifugerør.
  4. Tilsæt 1 tablet proteasehæmmercocktailtablet i røret. Bland ved vortexing19,27,29,34,35.
  5. Pipette 400 μL 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS), der indeholder proteasehæmmer, i hvert autoklaveret høstrør. Mærl rørene og læg dem på is. (Figur 4A).

6. Høst af øjnene

  1. Udfør alle procedurer i dette afsnit under Biosikkerhedsniveau 2 betingelser.
  2. Aflive musen ved CO2 indånding. Brug en sekundær metode til at bekræfte aktiv dødshjælp.
  3. Hold det aflivede musehoved sikkert og åbn den fine spids, der snæser på hver side af det inficerede øje. Skub ned mod hovedet for at proptose øjet. Når tangen er bag kloden af øjet, klemme tang sammen. Træk hænden væk fra hovedet for at løsne øjeæblet (Figur 4B).
  4. Straks placere øjeæblet i en mærket høst rør. Rør på is i højst 60 min (Figur 4C).

7. Intraokulært bakterietal

  1. Udfør alle procedurer i dette afsnit under Biosikkerhedsniveau 2 betingelser.
  2. Bekræft, at alle høstrør er tæt lukkede og er afbalancerede, mens de er i vævshomogenisatoren (Figur 5A). Tænd for vævshomogenisatoren i 1 min. for at homogenisere prøverne. Vent i 30 s, og tænd derefter i endnu et minut. Læg rør på is (Figur 5B,C).
  3. Serielt fortyndes hver prøve 10 gange ved sekventielt at overføre 20 μL af homogenatet til 180 μL steril 1x PBS. Fortyndes, indtil en faktor på 10-7 er nået (Figur 5D).
  4. Mærsk hver række af en varm, firkantet BHI plade med den rette fortynding faktorer. Der overføres 10 μL af hver fortynding i træk til den øverste BHI-plade, der vippes ca. 45°. Lad prøven køre, indtil den næsten når bunden af pladen, og læg derefter pladen fladt (Figur 5E)39.
  5. Når prøven absorberes i BHI agar, overføres pladen til en 37 °C-inkubator. Kolonier bør begynde at være synlige 8 timer efter at være blevet placeret i rugemaskinen.
  6. Fjern pladen fra inkubatoren, før B. cereuskoloniernes vækst forstyrrer identifikationen af de enkelte kolonier (Figur 5F).
  7. For at opnå en nøjagtig gengivelse af koncentrationen i prøven skal du tælle den række, der har mellem 10-100 kolonier. For eksempel vil en række med fortyndingsfraktionen på 10-4, der har 45 kolonier, have en koncentration på 4,5 x 105 CFU/ml.
  8. For at beregne det samlede antal bakterier pr. øje skal koncentrationen ganges med 0,4, hvilket repræsenterer millilitervolumenet på 1x PBS, der anvendes til at homogenisere øjet. For eksempel ville 4,5 x 105 CFU/ml koncentration oversætte til 1,8 x 105 CFU B. cereus per øje.

8. Opbevaring af prøver

  1. Der tilstænskes homogenprøverne i en mærket fryseboks, og denne kasse sættes i en -80 °C fryser. Disse prøver kan senere anvendes til inflammatorisk mediatoranalyse af ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generering af en reproducerbar inokulum og nøjagtigheden af den intravitreale injektion procedure er vigtige trin i udviklingen af modeller af mikrobiel endophthalmitis. Her viste vi den intravitreale injektionsprocedure ved hjælp af Gram-positiv Bacillus cereus. Vi injicerede 100 CFU/0,5 μL B. cereus i midten af glaslege udglasset med fem C57BL6-mus. Efter 10 timer efter infektion observerede vi intraokulært vækst af B. cereus til ca. 1,8 x 105 CFU/eye. Figur 1 viser konstruktionen af glasnåle for at levere bakterierne ind i de midvitreous af musens øjne. Bacillus cereus, der vokser på en blodgarplade og i dyrkningsrør, er vist i figur 2. Figur 3 viser musens intravitreale injektionsprocedure ved hjælp af et lufttryksindsprøjtningssystem. Figur 4 viser processen med at høste de inficerede øjne efter den ønskede tid efter infektion. Figur 5 viser teknikken til homogenisering af de inficerede øjne. Figur 6 viser de intraokulære bakterietal fra fem forskellige museøjne ved 10 h postinfektion. Figur 7 viser den overordnede procedure og en grafisk gengivelse af en intravitreal injektion af musen.

Figure 1
Figur 1: Fremstilling af skråt glasnåle. Glasnåle blev lavet af engangsmikrokapilla pipetter ved hjælp af en nål / pipette puller og en mikropipette faceveler. a) Fastspændt glaskapillærrør i nålen/pipettetrækeren. (B,C) Oprettelse af glasnåle ved hjælp af den ønskede spænding. d) Udjævning af glasmikropipetter. (E,F) Glas mikropipetter før og efter facet. (E) Skalering af glasnåle. Mellemrum mellem to sorte punkter holder 0,5 μL. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Bacillus cereus ATCC 14579. (A) Bacillus cereus vokser på en blod agar plade. Individuelle kolonier af B. cereus viser typisk klare zoner af hæmolyse på en blod agar plade. b) Turbid overnight kulturer B. cereus. c) Gram-farvning af B. cereus. B. cereus er Gram-positive stangformede bakterier. d) Elektronmikrograf af Bacillus cereus. Denne elektron mikrograf viser stang formet Bacillus cereus med hår som strukturer kaldet flagella. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Intravitreal injektion af mus. Injektionsproceduren udføres ved hjælp af en trykluftinjektor med visning af operationsfeltet ved hjælp af et kommercielt mikroskop (A)ketamin og xylazin stof til at bedøve musen. B) Administration af ketamin og xylazin ved intraperitoneal injektion for at bedøve musen. (C) Fastspænding periokulært hud tilbage til proptose øjet. D) Påfyldning af nålene med bakterier ved hjælp af lufttrykinjektoren. e) Intravitreal injektion. (F) Overvågning inficeret mus efter anæstesi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Høst mus inficeret øje. Post-infektion, efter det ønskede tidspunkt, høste inficerede museøjne ved hjælp af sterile pincet. a) PBS indeholdende sterile glasperler. (B) Høst af det inficerede øje. c )Høstrør,der indeholder et museøje. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Behandling af det høstede øje for intraokulært bakterietal. (A)Høstrør med inficeret øje fastspændt stramt til en vævshomogenisator. b) Inficerede øjne blev homogeniseret to gange i 1 min. hver. Spor fortynding (D) af øjet homogenater (C) og efterfølgende plating (E) for bakteriemængden. e )Repræsentativenkelt Bacillus cereus koloni efter sporfortynding. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Intraokulære bakterietal ved 10 timer efter infektion. M, musenummer. CFU, kolonidannende enheder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Intravitreal injektion af mus. a) Samlet rutediagram over musens intravitreale injektionsprocedure. b) Grafisk præsentation af den intravitreale injektion. Under proceduren indsættes sterile, skrå glasnåle, der indeholder en kultur af B. cereus, ind i det midvitreøse museøje, og B. cereus leveres ved hjælp af et mikroinfektionssystem med lufttryk. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv med tilgængeligheden af potente antibiotika, anti-inflammatoriske lægemidler, og vitektomi kirurgi, bakteriel endophthalmitis kan blinde en patient. Kliniske undersøgelser har været nyttige i at studere endophthalmitis; imidlertid giver eksperimentelle modeller af endophthalmitis hurtige og reproducerbare resultater, der kan oversættes til fremskridt inden for behandlingsstandard, hvilket resulterer i bedre visuelt resultat for patienterne.

Museøjets glasagtige volumen er ca. 7 μL40. Denne lille volumen kun tillader en begrænset mængde materiale, der skal injiceres. Der må ikke injiceres mængder på over 1,0 μL for at undgå øjenskader. Processen kræver specifikt udstyr og praksis af teknikker til at sikre reproducerbarhed og nøjagtighed. Endophthalmitis er blevet undersøgt hos primater, svin, kaniner, rotter, marsvin og mus28,41,42,43,44,45. Blandt de større arter, øjne er meget tættere i størrelse til menneskelige øjne, og intravitreal injektioner i større øjne kan udføres uden særligt udstyr. Bortset fra musen, fraværet af knockout stammer og reagenser til at studere værten immunrespons i andre dyremodeller begrænser deres anvendelighed i eksperimentel endophthalmitis.

Endophthalmitis forekommer hyppigst som en komplikation af grå stær kirurgi. Denne infektion kan også opstå efter gennemtrængende okulære traumer eller systemisk infektion. Det visuelle resultat ved denne sygdom afhænger til dels af vilenensen af det inficerende patogen. Hos mus afhænger det visuelle resultat også af deres immunstatus. Forståelse af mekanismerne i sygdomspatogenese er blevet lettet ved at studere sygdommen i eksperimentelle dyremodeller28. Protokollen for intravitreal injektion af mus og kvantificeringen af infektionsparametre kan tilpasses til undersøgelse af endophthalmitis indledt med næsten enhver form for bakterie- eller svampepatogen28. Desuden kan denne protokol også anvendes og ændres til at studere anatomiske ændringer, inflammatoriske processer, og genekspression profiler af både bakterier og vært under infektion.

Intravitreal injektion af musen og efterfølgende analyse af infektionsparametre består af flere kritiske trin (figur 7). Glasnålen skal være præcist skabt, mærket og steriliseret. Den skarpe ende af skrå glas nål og korrekt skalering bestemmer tilstrækkelig levering af bakterier og kloden punktering. Hvis enden af nålen er kort og ikke er passende affaset, kan det skabe et stort hul på kloden, som kan forårsage lækage, forurening af kloden, og en unøjagtig sygdom resultat. Derfor anbefales det at observere glasmikropipetterne, mens de beudvikler under 10 x optisk zoom på et lyst feltmikroskop. For at sikre, at den korrekte bakteriemængde leveres, skal fortyndingerne beregnes på forhånd, og den korrekte volumenskala skal mærkes på glasnålen. Parametrene for nåletræk og beveling ved hjælp af andre typer udstyr kan variere.

Den beskrevne intravitreal injektionsteknik anvender et mikroinjektorsystem med lufttryk til korrekt levering af bakterierne imuseøjet 1. En hensigtsmæssig anvendelse af denne mikroinjektor er afgørende for de reproducerbare infektionsparametre. Da lufttrykket bestemmer leveringshastigheden, kan overdreven kraft hurtigt injicere en større volumen i øjnene, forårsager overdreven intraokulært tryk og / eller kloden brud. Derfor er anbefalingen at bruge et tryk på 10-13 psi til at fylde og injicere under proceduren. Et andet potentielt problem er lækage af bakterieopløsningen fra glasnålene efter påfyldning. Lækage kan resultere i injektion af unøjagtige mængder i musens øjne. Kontroller altid tilslutningerne mellem injektionssystemet, slangen og glasnålene før injektioner.

Indsprøjtning nøjagtige mængder af bakterier er afgørende for reproducerbarheden af eksperimentel bakteriel endophthalmitis. Forskellige eksperimentelle endophthalmitis modeller kræver vaccination af specifikke antal bakterier12,28,46,47,48,49. For B. cereus endophthalmitis er injektion af 100 CFU nødvendig for at starte en reproducerbar infektion1. Da bakterievækst afhænger af vækstmediet og betingelserne, skal vækstmiljøet, medierne og fortyndingerne gentages hver gang. Det anbefales derfor at teste dyrkelsesforholdene før forsøget for at reproducere det nøjagtige inokulum i det relevante volumen til injektion. Som nævnt ovenfor er den øvre grænse for intravitreal injektion i museøjnene 1,0 μL28. En overdreven volumen hæver det intraokulære tryk, som kan resultere i grøn stær, løsrive nethinden fra den bageste segment, eller brud kloden. Intravitreal injektion og den deraf følgende infektion i mus kan ikke perfekt efterligne B. cereus endophthalmitis hos et menneske. De fleste dyremodeller af sygdomme hos mennesker er begrænset på denne måde. Kendte mængder B. cereus sprøjtes ind i øjet efter vækst i næringsrige medier. For kliniske tilfælde af B. cereus endophthalmitis kendes de inficerende mængder ikke, og forureningskilderne varierer. Men fordelene ved at bruge karakteriserede organismer og mus stammer og generere reproducerbare infektion kurser opvejer disse begrænsninger.

Korrekt høst af inficerede øjne er et andet kritisk skridt. Det er vigtigt at opretholde aseptiske forhold for at undgå krydskontaminering, som kan forstyrre fortolkningen af dataene. Derfor anbefales det at desinficere arbejdsbordet og alle instrumenter med 70% ethanol før høst. Bakterietallet stiger hurtigt inde i glaslege ud af det glasrige miljø under infektion, hvilket kan forårsage hævelse af øjet. Derfor bør der være omhu for forsigtigt at fjerne øjet under høst forhindre brud på kloden. Endvidere skal hætten på høstrøret, der indeholder det inficerede øje, strammes tilstrækkeligt, før røret anbringes i vævshomogenisator. En løs hætte vil resultere i lækage og forurening af vævshomogenisatoren, hvilket fører til unøjagtige mængder bakterier i de utætte rør. Øjet homogenisering procedure også hæver temperaturer i rørene. Derfor anbefales det at homogenisere 1 minut ad gangen. Forhøjede temperaturer kan påvirke mængden af nogle infektion parametre. Mens denne metode ikke giver antallet af bakterier inden for specifikke steder i øjet, når det kombineres med histologiske metoder, kan vi vurdere, hvor bakterier kan lokaliseres. Lokalisering af B. cereus i øjet under endophthalmitis er blevet rapporteret hos kaniner, hvis øjne er større og lettere dissekeret i subcompartments. 2.

Intravitreal injektion efterligner levering af organismer til den bageste del af øjet, som initierer infektion. Dette første trin letter den kvalitative og kvantitative undersøgelse af infektionsparametre i en meget reproducerbar musemodel af eksperimentel endophthalmitis. Disse modeller bruges også til at estimere okulær inflammation ved at kvantificere myeloperoxidase i infiltrerende neutrofiler, identificere specifikke celletyper efter flowcytometri, kvantificere cytokiner og chemokines ved real-time PCR og / eller ELISA, og observere okulær arkitektur ved histopatologi1,6,19,20,26,27,34,35,38. Inficerede museøjne høstes med forskellige fortyndingstyper afhængigt af den type infektionsparametre, der skal måles. Til genudtryksanalyse kræves der en anden lysisbuffer26. Til histopatologisk undersøgelse placeres høstede øjne i en fiksativ opløsning. De mange genetiske knockout mus letter også undersøgelsen rolle forskellige immunfaktorer og celler. Intravitreal injektion er derfor en grundpille teknik for forskere inden for intraokulære infektioner og terapeutiske.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen finansielle konflikter at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Feng Li og Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) for deres hjælp. Vores forskning er blevet støttet af National Institutes of Health tilskud R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947, og R01EY024140. Vores forskning er også blevet støttet af P30EY21725 (NIH CORE tilskud til Live Animal Imaging and Analysis, Molekylær biologi, og Cellular Imaging). Vores forskning er også blevet støttet af NEI Vision Science Pre-ph.d.-trainee program 5T32EY023202, en Presbyterian Health Foundation Research Support tilskud, og en ubegrænset tilskud til Dean A. McGee Eye Institute fra Forskning for at forebygge blindhed.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Pathogenesis of gram-positive bacterial endophthalmitis. Infection and Immunity. 67 (7), 3348-3356 (1999).
  3. Durand, M. L. Bacterial and Fungal Endophthalmitis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (3), 597-613 (2017).
  4. Callegan, M. C., Engelbert, M., Parke, D. W., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Bacterial endophthalmitis: Epidemiology, therapeutics, and bacterium-host interactions. Clinical Microbiology Reviews. 15 (1), 111-124 (2002).
  5. Livingston, E. T., Mursalin, M. H., Callegan, M. C. A Pyrrhic Victory: The PMN Response to Ocular Bacterial Infections. Microorganisms. 7 (11), 537 (2019).
  6. Ramadan, R. T., Moyer, A. L., Callegan, M. C. A role for tumor necrosis factor-alpha in experimental Bacillus cereus endophthalmitis pathogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (10), 4482-4489 (2008).
  7. Davey, R. T., Tauber, W. B. Posttraumatic endophthalmitis: The emerging role of Bacillus cereus infection. Reviews of Infectious Dissease. 9 (1), 110-123 (1987).
  8. Ramappa, M., et al. An outbreak of acute post-cataract surgery Pseudomonas sp. endophthalmitis caused by contaminated hydrophilic intraocular lens solution. Ophthalmology. 119 (3), 564-570 (2012).
  9. Coburn, P. S., et al. Bloodstream-To-Eye Infections Are Facilitated by Outer Blood-Retinal Barrier Dysfunction. PLoS One. 11 (5), 015560 (2016).
  10. Ness, T., Pelz, K., Hansen, L. L. Endogenous endophthalmitis: Microorganisms, disposition and prognosis. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (8), 852-856 (2007).
  11. Novosad, B. D., Callegan, M. C. Severe bacterial endophthalmitis: Towards improving clinical outcomes. Expert Review of Ophthalmology. 5 (5), 689-698 (2010).
  12. Mursalin, M. H., Livingston, E. T., Callegan, M. C. The cereus matter of Bacillus endophthalmitis. Experimental Eye Research. 193, 107959 (2020).
  13. Callegan, M. C., et al. Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infection and Immunity. 71 (6), 3116-3124 (2003).
  14. Beecher, D. J., Pulido, J. S., Barney, N. P., Wong, A. C. Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infection and Immunity. 63 (2), 632-639 (1995).
  15. Callegan, M. C., et al. Contribution of membrane-damaging toxins to Bacillus endophthalmitis pathogenesis. Infection and Immunity. 70 (10), 5381-5389 (2002).
  16. Cowan, C. L. Jr, Madden, W. M., Hatem, G. F., Merritt, J. C. Endogenous Bacillus cereus panophthalmitis. Annals of Ophthalmology. 19 (2), 65-68 (1987).
  17. Callegan, M. C., et al. Virulence factor profiles and antimicrobial susceptibilities of ocular Bacillus isolates. Current Eye Research. 31 (9), 693-702 (2006).
  18. Callegan, M. C., et al. Bacillus endophthalmitis: Roles of bacterial toxins and motility during infection. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3233-3238 (2005).
  19. Mursalin, M. H. Bacillus S-layer-mediated innate interactions during endophthalmitis. Frontiers in Immunology. 11 (215), (2020).
  20. Moyer, A. L., Ramadan, R. T., Novosad, B. D., Astley, R., Callegan, M. C. Bacillus cereus-induced permeability of the blood-ocular barrier during experimental endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3783-3793 (2009).
  21. Callegan, M. C., et al. Efficacy of vitrectomy in improving the outcome of Bacillus cereus endophthalmitis. Retina. 31 (8), 1518-1524 (2011).
  22. David, D. B., Kirkby, G. R., Noble, B. A. Bacillus cereus endophthalmitis. British Journal of Ophthalmology. 78 (7), 577-580 (1994).
  23. Vahey, J. B., Flynn, H. W. Jr Results in the management of Bacillus endophthalmitis. Ophthalmic Surgery. 22 (11), 681-686 (1991).
  24. Wiskur, B. J., Robinson, M. L., Farrand, A. J., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Toward improving therapeutic regimens for Bacillus endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (4), 1480-1487 (2008).
  25. Alfaro, D. V., et al. Experimental Bacillus cereus post-traumatic endophthalmitis and treatment with ciprofloxacin. British Journal of Ophthalmology. 80 (8), 755-758 (1996).
  26. Coburn, P. S., et al. TLR4 modulates inflammatory gene targets in the retina during Bacillus cereus endophthalmitis. BMC Ophthalmology. 18 (1), 96 (2018).
  27. Mursalin, M. H., et al. S-layer Impacts the Virulence of Bacillus in Endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (12), 3727-3739 (2019).
  28. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  29. Parkunan, S. M., et al. CXCL1, but not IL-6, significantly impacts intraocular inflammation during infection. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1125-1134 (2016).
  30. LaGrow, A. L., et al. A Novel Biomimetic Nanosponge Protects the Retina from the Enterococcus faecalis Cytolysin. mSphere. 2 (6), 00335 (2017).
  31. Beecher, D. J., Olsen, T. W., Somers, E. B., Wong, A. C. Evidence for contribution of tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholine-preferring phospholipase C, and collagenase to virulence of Bacillus cereus endophthalmitis. Infection and Immunity. 68 (9), 5269-5276 (2000).
  32. Callegan, M. C., et al. The role of pili in Bacillus cereus intraocular infection. Experimental Eye Research. 159, 69-76 (2017).
  33. Miller, F. C., et al. Targets of immunomodulation in bacterial endophthalmitis. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100763 (2019).
  34. Parkunan, S. M., Astley, R., Callegan, M. C. Role of TLR5 and flagella in Bacillus intraocular infection. PLoS One. 9 (6), 100543 (2014).
  35. Parkunan, S. M., et al. Unexpected roles for Toll-Like receptor 4 and TRIF in intraocular infection with Gram-positive bacteria. Infection and Immunity. 83 (10), 3926-3936 (2015).
  36. Coburn, P. S., et al. Disarming Pore-Forming Toxins with Biomimetic Nanosponges in Intraocular Infections. mSphere. 4 (3), 00262-00319 (2019).
  37. LaGrow, A., et al. Biomimetic nanosponges augment gatifloxacin in reducing retinal damage during experimental MRSA endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (9), 4632 (2019).
  38. Novosad, B. D., Astley, R. A., Callegan, M. C. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 in experimental Bacillus cereus endophthalmitis. PLoS One. 6 (12), 28619 (2011).
  39. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
  40. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution in the mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (3), 1109-1112 (2006).
  41. Beyer, T. L., O'Donnell, F. E., Goncalves, V., Singh, R. Role of the posterior capsule in the prevention of postoperative bacterial endophthalmitis: experimental primate studies and clinical implications. British Journal of Ophthalmology. 69 (11), 841-846 (1985).
  42. Tucker, D. N., Forster, R. K. Experimental bacterial endophthalmitis. Archives of Ophthalmology. 88 (6), 647-649 (1972).
  43. Alfaro, D. V., et al. Experimental pseudomonal posttraumatic endophthalmitis in a swine model. Treatment with ceftazidime, amikacin, and imipenem. Retina. 17 (2), 139-145 (1997).
  44. Silverstein, A. M., Zimmerman, L. E. Immunogenic endophthalmitis produced in the guinea pig by different pathogenetic mechanisms. American Journal of Ophthalmology. 48 (5), 435-447 (1959).
  45. Ravindranath, R. M., Hasan, S. A., Mondino, B. J. Immunopathologic features of Staphylococcus epidermidis-induced endophthalmitis in the rat. Current Eye Research. 16 (10), 1036-1043 (1997).
  46. Kumar, A., Singh, C. N., Glybina, I. V., Mahmoud, T. H., Yu, F. S. Toll-like receptor 2 ligand-induced protection against bacterial endophthalmitis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 255-263 (2010).
  47. Mylonakis, E., et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model. Infection and Immunity. 70 (8), 4678-4681 (2002).
  48. Sanders, M. E., et al. The Streptococcus pneumoniae capsule is required for full virulence in pneumococcal endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 865-872 (2011).
  49. Hunt, J. J., Astley, R., Wheatley, N., Wang, J. T., Callegan, M. C. TLR4 contributes to the host response to Klebsiella intraocular infection. Current Eye Research. 39 (8), 790-802 (2014).

Tags

Immunologi og infektion Problem 168 bakteriel øjeninfektion intraokulært bakteriel kvantificering okulær infektion parametre intravitreal injektion intraokulært injektion endophthalmitis
Intravitreal injektion og kvantisering af infektionsparametre i en musemodel af bakteriel endophthalmitis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mursalin, M. H., Livingston, E.,… More

Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter