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Immunology and Infection

बैक्टीरियल एंडोफ्थैल्माइटिस के माउस मॉडल में संक्रमण मापदंडों का इंट्राविट्रियल इंजेक्शन और क्वांटिटेशन

Published: February 6, 2021 doi: 10.3791/61749
Automatic Translation
*1,2, *1, 2,3, 4, 2,3, 1,2,3
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

हम यहां बैक्टीरियल एंडोफ्थैल्माइटिस के माउस मॉडल में इंट्राविट्रियल इंजेक्शन और बाद में बैक्टीरियल क्वांटिटेशन की एक विधि का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और जीवाणु और मेजबान जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

Abstract

इंट्राओकुलर बैक्टीरियल संक्रमण दृष्टि के लिए खतरा हैं। शोधकर्ताओं ने पशु मॉडल का उपयोग मेजबान और जीवाणु कारकों और संक्रमण से जुड़े प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया रास्तों की जांच करने के लिए व्यवहार्य चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने और अंधापन को रोकने के लिए दवाओं का परीक्षण करने के लिए । इंट्राविट्रियल इंजेक्शन तकनीक का उपयोग आंखों के पीछे के खंड में सीधे विट्रियस गुहा में जीवों, दवाओं या अन्य पदार्थों को इंजेक्ट करने के लिए किया जाता है। यहां, हमने माउस की आंख में संक्रमण शुरू करने और इंट्राओक्यूलर बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करने की तकनीक के लिए इस इंजेक्शन तकनीक का प्रदर्शन किया। बैसिलस सेरियस 18 घंटे के लिए मस्तिष्क हृदय जलसेक तरल मीडिया में उगाया गया था और एक एकाग्रता १०० कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) /0.5 μL को फिर से निलंबित कर दिया । एक C57BL/6J माउस केटामाइन और जाइलाज़ीन के संयोजन का उपयोग कर एनेस्थेटाइज्ड किया गया था । एक पिकालियर माइक्रोइंजेक्टर और ग्लास केशिका सुइयों का उपयोग करके, बेसिलस निलंबन के 0.5 माइक्रोन को माउस आंख के मध्य विट्रियस में इंजेक्ट किया गया था। कॉन्ट्रालेट्रल कंट्रोल आई को या तो बाँझ मीडिया (सर्जिकल कंट्रोल) के साथ इंजेक्ट किया गया था या इंजेक्शन (पूर्ण नियंत्रण) नहीं किया गया था। संक्रमण के बाद 10 घंटे में, चूहों को इच्छामृत्यु दी गई थी, और आंखों को बाँझ सर्जिकल चिमटी का उपयोग करके काटा गया था और 400 माइक्रोन बाँझ पीबीएस और 1 मिमी बाँझ ग्लास मोती वाली ट्यूब में रखा गया था। ELISAs या myeloperoxidase परख के लिए, प्रोटीन अवरोधक ट्यूबों में जोड़ा गया था । आरएनए निकालने के लिए उपयुक्त लाइसिस बफर जोड़ा गया। आंखों को 1-2 मिनट के लिए एक ऊतक समरूप में समरूप किया गया था। होमोजेनेट को पीबीएस में 10 गुना तक क्रमिक रूप से पतला किया गया था और आगर प्लेटों पर पतला ट्रैक किया गया था। शेष समरूपों को अतिरिक्त परख के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। प्लेटों को 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया गया था और प्रति आंख सीएलयू को मात्रा निर्धारित की गई थी । इन तकनीकों के परिणामस्वरूप माउस आंखों में प्रजनन योग्य संक्रमण होते हैं और व्यवहार्य बैक्टीरिया, मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और मेजबान और बैक्टीरियल जीन अभिव्यक्ति के ओमिक्स के मात्रा की सुविधा प्रदान करते हैं।

Introduction

बैक्टीरियल एंडोफेथैल्माइटिस एक विनाशकारी संक्रमण है जो सूजन का कारण बनता है, और, यदि ठीक से इलाज नहीं किया जाता है, तो दृष्टि या अंधापन की हानि हो सकती है। एंडोफ्थल्माइटिस का परिणाम आंखों के अंदरूनी हिस्से में बैक्टीरिया के प्रवेश से होता है1,2,3, 4,5. एक बार आंख में, बैक्टीरिया दोहराने, विषाक्त पदार्थों और अन्य हानिकारक कारकों का उत्पादन, और नाजुक रेटिना कोशिकाओं और ऊतकों को अपरिवर्तनीय क्षति पैदा कर सकता है । सूजन के कारण नेत्र क्षति भी हो सकती है, भड़काऊ रास्तों के सक्रिय होनेके कारण आंख1,5,6के इंटीरियर में भड़काऊ सेल आमद होती है। एंडोफेथैल्माइटिस इंट्राओक्यूलर सर्जरी (पोस्ट-ऑपरेटिव), आंखों में एक मर्मज्ञ चोट (पोस्ट-ट्रॉमेटिक) या बैक्टीरिया के मेटास्टैटिक फैलने से एक अलग शारीरिक साइट (अंतर्जात)7,8,9,10के बाद हो सकता है। बैक्टीरियल एंडोफ्थल्माइटिस के उपचार में एंटीबायोटिक्स, एंटी-भड़काऊ दवाएं, या सर्जिकल हस्तक्षेप3,4,11शामिल हैं। यहां तक कि इन उपचारों के साथ, दृष्टि या आंख ही खो सकता है। बैक्टीरियल एंडोफेथैल्माइटिस के बाद दृश्य पूर्वानुमान आम तौर पर उपचार प्रभावशीलता, प्रस्तुति पर दृश्य तीक्ष्णता, और संक्रमित जीव की उग्रता के आधार पर भिन्न होता है।

बैसिलस सेरियस (बी सेरियस)प्रमुख जीवाणु रोगजनकों में से एक है जो पोस्ट-ट्रॉमेटिक एंडोफेथैल्माइटिस7,12का कारण बनता है। अधिकांश बी सेरियस एंडोफेथैल्माइटिस मामलों में तेजी से पाठ्यक्रम होता है, जिसके परिणामस्वरूप कुछ दिनों के भीतर अंधापन हो सकता है। बी सेरियस एंडोफेथैल्माइटिस की पहचान में जल्दी से विकसित होने वाली इंट्राओकुलर सूजन, आंखों में दर्द, दृश्य तीक्ष्णता की तेजी से कमी और बुखार शामिल हैं। B. मस्तिष्क अन्य बैक्टीरिया की तुलना में आंखों में तेजी से बढ़ता है जो आमतौर पर आंखों के संक्रमण का कारण बनता है2,4,12 और कई उग्रता कारकों के पास। इसलिए सफल चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए खिड़की अपेक्षाकृत कम 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25. इस संक्रमण के उपचार आमतौर पर अन्य कम उग्र रोगजनकों के कारण एंडोफेथैल्माइटिस के इलाज में सफल होते हैं, लेकिन बी सेरियस एंडोफेथैल्माइटिस आमतौर पर महत्वपूर्ण दृष्टि हानि से पीड़ित रोगियों के 70% से अधिक परिणाम देता है। उन रोगियों में से लगभग 50% संक्रमित नेत्रों के 7,16, 22,23के लिए ईविसेरेशन या नाभिन सेगुजरतेहैं . बी सेरियस एंडोफेथैल्माइटिस की विनाशकारी और तीव्र प्रकृति तत्काल और उचित उपचार के लिए कहती है। रोग विकास के अंतर्निहित तंत्रों को समझने में हाल की प्रगति ने हस्तक्षेप के संभावित लक्ष्यों की पहचान की है ,19,26,27. बी सेरियस एंडोफेथैल्माइटिस के प्रायोगिक माउस मॉडल संक्रमण के तंत्र को समझने और संभावित चिकित्सीय परीक्षण करने में उपयोगी बने रहते हैं जो दृष्टि हानि को रोक सकते हैं।

बी सेरियस के साथ चूहों का प्रायोगिक इंट्राओकुलर संक्रमण एंडोफेथैल्माइटिस28के दौरान बैक्टीरियल और होस्ट कारकों के साथ-साथ उनकी बातचीत को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल रहा है। यह मॉडल एक पोस्ट-ट्रॉमेटिक या पोस्ट-ऑपरेटिव इवेंट की नकल करता है, जिसमें चोट के दौरान बैक्टीरिया को आंख में पेश किया जाता है। यह मॉडल अत्यधिक पुन: उत्पन्न करने योग्य है और प्रायोगिक चिकित्साओं के परीक्षण और देखभाल के मानक 1 , 6,19,29,30में सुधार के लिए आंकड़े उपलब्धकरानेके लिए उपयोगी रहा है । कई अन्य संक्रमण मॉडलों की तरह, यह मॉडल संक्रमण के कई मापदंडों के स्वतंत्र नियंत्रण के लिए अनुमति देता है और संक्रमण परिणामों की कुशल और प्रजनन योग्य परीक्षा को सक्षम बनाता है। पिछले कुछ दशकों में खरगोशों में इसी तरह के मॉडल में किए गए अध्ययनों ने आंखों में बी सेरियस उग्रता कारकों के प्रभावों की जांच की है2,4,13,14,31. बी सेरियस उत्परिवर्ती उपभेदों को व्यक्तिगत या कई उग्रता कारकों की कमी के इंजेक्शन द्वारा, रोग की गंभीरता में इन उग्रता कारकों के योगदान को विभिन्नघंटों के बाद के संक्रमण या दृश्य समारोह13, 14, 27, 31,32के नुकसान जैसे परिणामों द्वारा मापा जा सकता है। इसके अलावा , नॉकआउट माउस उपभेदों को संक्रमित करके इस मॉडल में मेजबान कारकों की जांच की गई है जिसमें विशिष्ट भड़काऊ मेजबान कारकों की कमी है26,29,33,34, 35. यह मॉडल संक्रमण के बाद आंखों में उपन्यास यौगिकों को इंजेक्शन लगाकर इस बीमारी के संभावित उपचारों का परीक्षण करने के लिए भी उपयोगी है30,36. इस पांडुलिपि में, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें बी सेरियस केसाथ माउस आंख को संक्रमित करना, संक्रमण के बाद आंखों की कटाई करना, इंट्राओक्यूलर बैक्टीरियल लोड की मात्रा बताना और रोग गंभीरता के अतिरिक्त मापदंडों को परखने के लिए नमूनों को संरक्षित करना शामिल है।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के बाद प्रदर्शन किया गया और नेत्र और नेत्र विज्ञान में पशुओं के उपयोग के लिए दृष्टि और नेत्र विज्ञान बयान में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन नेत्र और दृष्टि अनुसंधान । प्रोटोकॉल को यूनिवर्सिटी ऑफ ओकलाहोमा हेल्थ साइंसेज सेंटर (प्रोटोकॉल नंबर 15-103, 18-043, और 18-087) की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी ने मंजूरी दी थी ।

1. बाँझ कांच सुई

  1. सुई पिपेट खींचने वाला चालू करें।
  2. हीटर घुंडी समायोजित करें जब तक प्रदर्शन १२.६ दिखाता है ।
  3. दरवाजा खोलें और मैन्युअल रूप से ऊपरी क्लैंप और हीटर फिलामेंट के माध्यम से 5 माइक्रोन केशिका ट्यूब को खिलाएं जब तक कि टयूबिंग का आधा फिलामेंट(चित्रा 1 ए) से नीचेनहीं फैला होता।
  4. पुष्टि करें कि केशिका ट्यूब ऊपरी क्लैंप में "वी" नाली में है। ऊपरी क्लैंप को कस लें।
  5. कम क्लैंप खुले होने के साथ, वर्टिकल स्लाइड को तब तक मैन्युअल रूप से समायोजित करें जब तक कि निचला क्लैंप इसकी ऊपरी सीमा तक न पहुंच न जा। पुष्टि करें कि ट्यूब निचले क्लैंप में "वी" नाली में है। निचले क्लैंप को कस लें।
  6. दरवाजा बंद करें और पुष्टि करें कि 'तैयार' प्रकाश चालन है। हीटर और पुलिंग सीक्वेंस(चित्रा 1B)शुरू करने के लिए स्टार्ट बटन पुश करें।
  7. सुनिश्चित करें कि गर्मी और गुरुत्वाकर्षण के बाद हीटर स्वचालित रूप से बंद हो जाता है केशिका ट्यूब के अलावा खींचतीहै (चित्रा 1C),और स्लाइड नीचे की ओर बढ़ता है ।
  8. दरवाजा खोलो। केशिका ट्यूब के शीर्ष को पकड़े हुए, शीर्ष क्लैंप को अनटाइट करें। ऊपरी केशिका ट्यूब निकालें और इसे अलग सेट करें।
  9. नीचे स्लाइड में केशिका ट्यूब पकड़ो और कम क्लैंप को अनटाइट करें। निचले केशिका ट्यूब को हटा दें और इसे अलग सेट करें।
  10. इंजेक्शन सुई बनाने के लिए खींचा केशिका ट्यूब को बीवेल करने के लिए 0.05 माइक्रोन एल्यूमीना घर्षण पीस प्लेट के साथ माइक्रोइलेक्ट्रोड बेवेलर का उपयोग करें।
  11. सतह(चित्रा 1D)को कवर करने के लिए पीसने वाली प्लेट पर पर्याप्त पानी पिपेट करें।
  12. बेवेलर चालू करें ताकि यह 60 आरपीएम पर घुमाना शुरू कर दे। खींचे गए केशिका ट्यूब को "वी" नाली में पिपेट क्लैंप में रखें। क्लैंप को कस लें और पिपेट क्लैंप के कोण को 30 डिग्री तक समायोजित करें।
  13. पीसने वाली प्लेट के रोटेशन के केंद्र से लगभग दो तिहाई दूरी पर केशिका ट्यूब के नुकीले किनारे की नोक को समायोजित करें।
  14. जोड़तोड़ के शीर्ष पर मोटे नियंत्रण घुंडी को समायोजित करके क्लैंप्ड केशिका ट्यूब को कम करें। केशिका ट्यूब को तब तक कम करना जारी रखें जब तक कि केशिका ट्यूब की नोक पानी की सतह से नीचे नहीं फैली और पीसने वाली प्लेट की घर्षण सतह से संपर्क न करे।
  15. बेवेलर से जुड़े माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बेवेलिंग प्रगति की निगरानी करें। 5 मिनट के बाद, पीसने की थाली से कांच की सुई उठाने के लिए ठीक नियंत्रण समायोजित करें।
  16. कांच की सुई निकालें और केशिका ट्यूब(चित्रा1ई, एफ)की नोक की जांच करने के लिए इसे 10x आवर्धन के तहत रखें।
  17. यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई रुकावट नहीं है, एक सिरिंज पर एक पिपेट धारक में कांच की सुई डालें और हवा को 99% इथेनॉल की 1 एमएल ट्यूब में धकेल दें। यदि सुई की नोक पर हवा के बुलबुले बनते हैं, तो सुई में कोई रुकावट नहीं होती है और इसका उपयोग माइक्रोइंजेक्शन के लिए किया जा सकता है। यह प्रक्रिया कांच की सुइयों की बंध्यता भी सुनिश्चित करती है।
  18. एक केशिका ट्यूब 5 माइक्रोन तरल पदार्थ तक पकड़ सकती है। 0.5 माइक्रोन वॉल्यूम के लिए चिह्नित करने के लिए सुई पर दूरी की गणना करने के लिए केशिका ट्यूब को 10 खंडों में चिह्नित करें। उस दूरी के साथ एक पैमाने को चिह्नित करें जो भविष्य की तैयारी के लिए 0.5 माइक्रोन रखती है। 5 माइक्रोल सुई के लिए, 0.7 मिमी की दूरी 0.5 माइक्रोल(चित्रा 1G)के बराबर है।

2. बैसिलस सेरियस संस्कृति

  1. बायोसेफ्टी लेवल 2 शर्तों के तहत इस अनुभाग में सभी प्रक्रियाओं को करें।
  2. बी सेरियस एटीसीसी 14579 का स्ट्रीक फ्रीजर स्टॉक 5% भेड़ रक्त आगार प्लेट पर एकल कॉलोनी अलगाव के लिए और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 2 ए)पर इनक्यूबेट करता है।
  3. बाँझ मस्तिष्क हृदय जलसेक के पिपेट 5 एमएल एक 10 एमएल बाँझ स्नैप-कैप ट्यूब(चित्रा 2B)में शोरबा । बाँझ पाश या सुई का उपयोग करके, आगर प्लेट से बी सेरियस एटीसीसी 14579 की एक कॉलोनी चुनें और तरल बीएची को टीका लगाएं।
  4. भंवर नमूना संक्षेप में। स्नैप-कैप ट्यूब को घूर्णन इनक्यूबेटर में रखें। तापमान 37 डिग्री सेल्सियस और गति 200 आरपीएम पर सेट करें। 18 घंटे के बाद, इनक्यूबेटर(चित्रा 2B)से संस्कृति को हटा दें।

3. इंट्राविट्रियल इंजेक्शन के लिए बैक्टीरियल कमजोर पड़ने

  1. बायोसेफ्टी लेवल 2 शर्तों के तहत इस अनुभाग में सभी प्रक्रियाओं को करें।
  2. माइक्रोलीटर (सीएलयू/माइक्रोल) प्रति 200 कॉलोनी बनाने इकाइयों को प्राप्त करने के लिए ताजा बीएची के 10 एमएल में जोड़ने के लिए रातोंरात बी सेरियस संस्कृति की मात्रा की गणना करें। उदाहरण के लिए, बीएचआई में बी सेरियस की एक रात की संस्कृति लगभग 2 x 108 सीएलयू/एमएल की प्रतिकृति है, जिसे तब ताजा बीएचआई के 10 एमएल में रातोंरात संस्कृति के 10 माइक्रोन को पाइपिंग करके 200 सीएलयू/माइक्रोन को पतला किया जा सकता है।
  3. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में हौसले से पतला संस्कृति का पिपेट 1 एमएल। इंट्राविट्रियल इंजेक्शन तक बर्फ पर इस ट्यूब को बनाए रखें। बैक्टीरियल संस्कृति को कमजोर करने के 60 मिनट के भीतर इंट्राविट्रियल इंजेक्शन का प्रदर्शन करें।

4. माउस इंट्राविट्रियल इंजेक्शन

  1. बायोसेफ्टी लेवल 2 शर्तों के तहत इस अनुभाग में सभी प्रक्रियाओं को करें।
  2. ऑपरेटिंग टेबल पर मेडिकल अंडरपैड रखकर प्रक्रिया स्थल तैयार करें।
  3. माइक्रोइंजेक्टर चालू करें और माइक्रोइंजेक्टर से जुड़े कंप्रेस्ड एयर टैंक पर गैस वाल्व खोलें। टैंक नियामक को तब तक समायोजित करें जब तक कि गैस वितरण लगभग 60 साई न हो जाए।
  4. माइक्रोइंजेक्टर पर, प्रेस मोड जब तक स्क्रीन संतुलन दिखाता है। बैलेंस दबाएं और ऑपरेटिंग टेबल पर कंप्यूटर माउस रखें। स्टेनलेस-स्टील पिपेट धारक को इंजेक्टर के 'फिल/आउटपुट' से जुड़ी ट्यूबिंग से कनेक्ट करें। यह ट्यूब हमेशा इंजेक्टर से जुड़ी रहती है।
  5. सुई के चारों ओर पिपेट धारक कनेक्टर को तंग करके पिपेट धारक के दूसरे छोर पर केशिका सुई डालें।
  6. नेत्र माइक्रोस्कोप चालू करें और इसके प्रकाश को 50% की तीव्रता में चालू करें। ऑपरेटिंग टेबल पर प्रक्रिया साइट पर माइक्रोस्कोप को समायोजित करें और माइक्रोस्कोप को वांछित फोकस में समायोजित करें।
  7. प्रक्रिया शुरू होने से पहले, पुष्टि करें कि पैडल निकासी पलटा का परीक्षण करके माउस को पर्याप्त रूप से एनेस्थेटाइज्ड किया गया है। संज्ञाहरण के लिए अपने IACUC अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन करना सुनिश्चित करें।
  8. अपनी नाक के साथ चिकित्सा अंडरपैड पर एनेस्थेटाइज्ड माउस रखें और इसके बाईं ओर झुकाव।
  9. नेत्र माइक्रोस्कोप के माध्यम से माउस की दाईं आंख को देखें और इंजेक्शन साइट(चित्रा 3 सी)का पर्दाफाश करने के लिए आंख के दोनों ओर रिवर्स एक्शन संदंश के चिमटे को खोलकर ढक्कन खोलें।
  10. माइक्रोइंजेक्टर(चित्रा 3 डी)से जुड़े माउस पैड पर क्लिक करके 200 CFU/μL कमजोर पड़ने के साथ केशिका सुई भरें।
  11. बाएं हाथ से जानवर के सिर को सुरक्षित करें और सुई की नोक को आंख के अंगों पर रखें। बेवेल अप स्थिति में सुई के साथ और 45 डिग्री कोण पर, माउस आंख पंचर, लेकिन यह सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन देते समय केवल सुई की तेज नोक (~ 0.5 मिमी) डाला जाता है।
  12. एक बार सुई टिप डालने के बाद, बाएं हाथ को माउस हेड से माउस पैड पर ले जाएं और माउस पैड पर दाएं क्लिक करें बी सेरियस कमजोर पड़ने के 0.5 माइक्रोन इंजेक्ट करें। रिसाव को रोकने के लिए, सुई की नोक को हटाने से पहले 2-3 सेकंड के लिए माउस की आंख के अंदर छोड़ दें (चित्रा 3E)1,19,26,27,32,34,36,37, 37,38.
  13. संदंश जारी करें और माउस को एक पिंजरे में रखें जो वार्मिंग पैड पर बैठा है। इन चूहों की निगरानी तब तक करें जब तक कि वे संज्ञाहरण(चित्रा 3F)से बरामद न हो जाते।
  14. एक बार चूहों संज्ञाहरण से बरामद कर रहे हैं, अपने उचित रैक के लिए पिंजरे वापस । यदि चूहों को इलेक्ट्रोरेटिनोग्राफी द्वारा रेटिना फ़ंक्शन विश्लेषण के अधीन किया जाएगा, तो पिंजरों को उचित अंधेरे अनुकूलन के लिए एक अंधेरे कमरे में वापस कर दिया जाना चाहिए।

5. हार्वेस्टिंग ट्यूब की तैयारी

  1. 1 मिमी बाँझ ग्लास मोती को 1.5 एमएल स्क्रू कैप ट्यूब में रखें।
  2. इन ट्यूबों को सूखी सेटिंग पर एक ऑटोक्लेव में स्टरलाइज करें। उपयोग से पहले ट्यूबों को कमरे के तापमान में ठंडा होने दें।
  3. एक बाँझ 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में 1x बाँझ फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के 10 एमएल जोड़ें।
  4. ट्यूब में प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल टैबलेट के 1 टैबलेट जोड़ें। 19,27 ,29,34,35को भंवर से मिलाएं ।
  5. प्रत्येक ऑटोक्लेव फसल ट्यूब में प्रोटीज अवरोधक युक्त 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के पिपेट 400 माइक्रोन। ट्यूबों को लेबल करें और बर्फ पर रखें। (चित्रा 4A)।

6. आंखों की कटाई

  1. बायोसेफ्टी लेवल 2 शर्तों के तहत इस अनुभाग में सभी प्रक्रियाओं को करें।
  2. सीओ2 साँस लेना द्वारा माउस इच्छामृत्यु। इच्छामृत्यु की पुष्टि के लिए एक माध्यमिक विधि का उपयोग करें।
  3. इच्छामृत्यु माउस सिर को सुरक्षित रखें और संक्रमित आंख के दोनों ओर ठीक टिप संदंश खोलें। आंख को सहारा देने के लिए सिर की ओर नीचे धकेलें। एक बार चिमटे आंख की दुनिया के पीछे हैं, चिमटे एक साथ निचोड़ । आंखों की पुतली(चित्रा 4B)को अलग करने के लिए सिर से दूर संदंश खींचें।
  4. तुरंत एक लेबल हार्वेस्टिंग ट्यूब में आंखों की पुतली रखें। बर्फ पर ट्यूबों को 60 मिनट(चित्रा 4C)से अधिक नहीं रखें।

7. इंट्राओक्यूलर बैक्टीरियल काउंट

  1. बायोसेफ्टी लेवल 2 शर्तों के तहत इस अनुभाग में सभी प्रक्रियाओं को करें।
  2. पुष्टि करें कि सभी फसल ट्यूब कसकर बंद हो जाते हैं और ऊतक समरूप(चित्रा 5A)में संतुलित होते हैं। नमूनों को समरूप बनाने के लिए ऊतक समरूप को 1 मिनट के लिए चालू करें। 30 एस के लिए रुको, तो एक और मिनट के लिए चालू करें । बर्फ पर ट्यूब रखें(चित्रा 5बी, सी)।
  3. क्रमिक रूप से 10 गुना प्रत्येक नमूने को क्रमिक रूप से 180 μL बाँझ 1x PBS में स्थानांतरित करके 10 गुना पतला। तनु जब तक 10-7 का एक कारक तक पहुंच गया है(चित्रा 5D)।
  4. उचित कमजोर पड़ने वाले कारकों के साथ एक गर्म, वर्ग बीएची प्लेट की प्रत्येक पंक्ति को लेबल करें। लगभग 45 डिग्री झुका हुआ शीर्ष बीएचआई प्लेट में एक पंक्ति में प्रत्येक कमजोर पड़ने के 10 माइक्रोन को स्थानांतरित करें। नमूना तब तक चलने दें जब तक कि यह लगभग प्लेट के नीचे तक न पहुंच जाए, फिर प्लेट फ्लैट(चित्रा 5E)39रखें।
  5. जब नमूना बीएचआई एगर में अवशोषित हो जाता है, तो प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। इनक्यूबेटर में रखे जाने के बाद कॉलोनियों को 8 घंटे दिखाई देना शुरू कर देना चाहिए।
  6. बी सेरियस कॉलोनियों के विकास से पहले इनक्यूबेटर से प्लेट निकालें व्यक्तिगत कालोनियों(चित्रा 5F)की पहचान करने में हस्तक्षेप करता है।
  7. नमूने में एकाग्रता के सटीक प्रतिनिधित्व के लिए, 10-100 कॉलोनियों के बीच की पंक्ति को गिनें। उदाहरण के लिए, 10-4 के कमजोर पड़ने के अंश के साथ एक पंक्ति जिसमें 45 कॉलोनियां हैं, 4.5 x 105 सीएलयू/एमएल की एकाग्रता होगी।
  8. प्रति आंख बैक्टीरिया की कुल संख्या की गणना करने के लिए, एकाग्रता को 0.4 से गुणा करें, जो आंख को समरूप बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले 1x पीबीएस की मिलीलीटर मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है। उदाहरण के लिए, 4.5 x 105 10 5 एमएल एकाग्रता 1.8 x 105 सीएलयू बी सेरियस प्रति आंख में अनुवाद करेगी।

8. नमूनों का संरक्षण

  1. एक लेबल फ्रीजर बॉक्स में समरूप नमूनों रखें और इस बॉक्स को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें। इन नमूनों का उपयोग बाद में एलिसा द्वारा भड़काऊ मध्यस्थ विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

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Representative Results

इंट्राविएट्रियल इंजेक्शन प्रक्रिया की एक पुन: उत्पन्न योग्य इनोकुलम और सटीकता पैदा करना माइक्रोबियल एंडोथैल्माइटिस के मॉडल विकसित करने में महत्वपूर्ण कदम हैं। यहां, हमने ग्राम-पॉजिटिव बेसिलस सेरियसका उपयोग करके इंट्राविट्रियल इंजेक्शन प्रक्रिया का प्रदर्शन किया। हमने पांच C57BL6 चूहों के मध्य-विट्रियस में बी सेरियस के 100 CFU/0.5 μL इंजेक्ट किए। 10 घंटे के बाद, हमने बी सेरियस की इंट्राओक्यूलर वृद्धि को लगभग 1.8 x 105 सीएफयू/आई तक देखा। चित्रा 1 माउस आंखों के मध्य में बैक्टीरिया को वितरित करने के लिए कांच की सुइयों के निर्माण को दर्शाता है। ब्लड एगर प्लेट और कल्चर ट्यूब्स में उगने वाले बैसिलस सेरियस को चित्र 2में दिखाया गया है । चित्रा 3 एक हवा दबाव इंजेक्शन प्रणाली का उपयोग कर माउस इंट्राविट्रियल इंजेक्शन प्रक्रिया से पता चलता है। चित्रा 4 वांछित समय के बाद संक्रमित आंखों की कटाई की प्रक्रिया को दर्शाता है। चित्रा 5 संक्रमित आंखों को समरूप बनाने की तकनीक दिखाता है। चित्रा 6 10 घंटे के बाद संक्रमण पर पांच अलग माउस आंखों से इंट्राओकुलर बैक्टीरियल मायने रखता है दर्शाता है । चित्रा 7 समग्र प्रक्रिया और माउस इंट्राविट्रियल इंजेक्शन के ग्राफिकल प्रतिनिधित्व को दर्शाता है।

Figure 1
चित्रा 1: बेवल ग्लास सुई बनाना। कांच की सुइयां एक सुई/पिपेट पुलर और एक माइक्रोपिपेट बेवेलर का उपयोग करके डिस्पोजेबल माइक्रोकैपिलरी पिपेट से बनाई गई थीं । (A)सुई/पिपेट खींचने वाले में क्लैंप्ड ग्लास केशिका ट्यूब । (B,C) वांछित वोल्टेज का उपयोग करके कांच की सुइयों का निर्माण। (घ)ग्लास माइक्रोपिपेट्स को बेवेलिंग करें। (ई,एफ) ग्लास माइक्रोपिपेट्स से पहले और बाद में beveling। (ई)कांच की सुइयों को स्केलिंग करना। दो काले बिंदुओं के बीच की जगह 0.5 माइक्रोन रखती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: बैसिलस सेरियस एटीसीसी 14579। (A)ब्लड एगर प्लेट पर बढ़ रहे बैसिलस सेरियस । बी सेरियस की व्यक्तिगत उपनिवेश आमतौर पर रक्त आगार प्लेट पर हीमोलिसिस के स्पष्ट क्षेत्र प्रदर्शित करते हैं। (ख) बी सेरियसकी रातोंरात संस्कृतियों टर्बिड । (ग) बी सेरियसका चने का धुंधला । B. सेरियस ग्राम-सकारात्मक रॉड के आकार के बैक्टीरिया हैं। (घ) बैसिलस सेरियसका इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ । इस इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ में रॉड के आकार के बैसिलस सेरियस को बालों जैसी संरचनाओं के साथ फ्लैगेला कहा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: माउस इंट्राविट्रियल इंजेक्शन। इंजेक्शन प्रक्रिया माउस को एनेस्थेटाइज करने के लिए एक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप(ए)केटामाइन और जाइलाज़ीन दवा का उपयोग करके ऑपरेटिंग फील्ड को देखने के साथ एक दबाव वाले हवा इंजेक्टर का उपयोग करके की जाती है। (ख)माउस को एनेस्थेटाइज करने के लिए इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा केटामाइन और जाइलाज़ीन का प्रशासन। (ग)आंखों को प्रॉप्ट करने के लिए पेरिओकुलर स्किन को वापस क्लैंपिंग करना । (घ)हवा दबाव इंजेक्टर का उपयोग कर बैक्टीरिया के साथ सुइयों को भरना । (ई)इंट्राविट्रियल इंजेक्शन। (च)संज्ञाहरण के बाद संक्रमित माउस की निगरानी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: माउस संक्रमित आंख की कटाई। संक्रमण के बाद, वांछित समय बिंदु के बाद, बाँझ चिमटी का उपयोग करके फसल संक्रमित माउस आंखें। (A)बाँझ कांच के मोती युक्त पीबीएस। (ख)संक्रमित आंख की कटाई। (ग)हार्वेस्ट ट्यूब जिसमें माउस की आंख होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: इंट्राओक्यूलर बैक्टीरियल काउंट के लिए काटी गई आंख को प्रोसेस करना। (क)संक्रमित आंखों के साथ हार्वेस्ट ट्यूब एक ऊतक समरूप को कसकर क्लैंप किया जाता है । (ख)संक्रमित आंखों को 1 मिनट के लिए दो बार समरूप किया गया । बैक्टीरियल क्वांटिटेशन के लिए आंखों के समरूपों(सी)और बाद में चढ़ाना(ई)का ट्रैक कमजोर पड़ना (डी) । (ई)ट्रैक कमजोर पड़ने के बाद प्रतिनिधि व्यक्तिगत बैसिलस सेरियस कॉलोनी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: इंट्राओक्यूलर बैक्टीरियल 10 घंटे के बाद संक्रमण पर गिना जाता है। एम, माउस नंबर। आरएफयू, कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: माउस इंट्राविट्रियल इंजेक्शन। (ए)माउस इंट्राविट्रियल इंजेक्शन प्रक्रिया का समग्र प्रवाह। (ख)इंट्राविट्रियल इंजेक्शन की ग्राफिकल प्रस्तुति। प्रक्रिया के दौरान, बी सेरियस की संस्कृति वाले बाँझ, बेवेल्ड ग्लास सुइयों को माउस आंख के मध्य में डाला जाता है, और बी सेरियस को हवा-दबाव वाले माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम का उपयोग करके वितरित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां तक कि शक्तिशाली एंटीबायोटिक दवाओं, विरोधी भड़काऊ दवाओं, और विट्रेक्टॉमी सर्जरी की उपलब्धता के साथ, बैक्टीरियल एंडोफेथैल्माइटिस एक मरीज को अंधा कर सकता है। एंडोफ्थैल्माइटिस का अध्ययन करने में नैदानिक अध्ययन उपयोगी रहे हैं; हालांकि, एंडोफ्थल्माइटिस के प्रयोगात्मक मॉडल त्वरित और प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान करते हैं जिनका परीक्षण देखभाल के मानक में प्रगति के लिए किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप रोगियों के लिए बेहतर दृश्य परिणाम होते हैं।

माउस की आंख की विट्रियस मात्रा लगभग 7 माइक्रोल40है। यह छोटी मात्रा केवल सीमित मात्रा में सामग्री इंजेक्शन लगाने की अनुमति देती है। नेत्र क्षति से बचने के लिए 1.0 माइक्रोन से अधिक वॉल्यूम इंजेक्ट नहीं किए जाने चाहिए। इस प्रक्रिया में प्रजनन क्षमता और सटीकता सुनिश्चित करने के लिए विशिष्ट उपकरणों और तकनीकों के अभ्यास की आवश्यकता होती है। एंडोफ्थल्माइटिस का अध्ययन वानरों, सूअर, खरगोशों, चूहों, गिनी सूअरों और माउस28, 41, 42,43,44,45में किया गया है। बड़ी प्रजातियों में, आंखें मानव आंखों के आकार में बहुत करीब हैं, और बड़ी आंखों में इंट्राविट्रियल इंजेक्शन विशेष उपकरणों के बिना किया जा सकता है। माउस को छोड़कर, अन्य पशु मॉडलों में मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए नॉकआउट उपभेदों और अभिकर्मकों की अनुपस्थिति प्रयोगात्मक एंडोफ्थल्माइटिस में उनकी उपयोगिता को बाधित करती है।

एंडोफ्थल्माइटिस मोतियाबिंद सर्जरी की जटिलता के रूप में सबसे अधिक बार होता है। यह संक्रमण मर्मज्ञ नेत्र आघात या प्रणालीगत संक्रमण के बाद भी हो सकता है। इस बीमारी में दृश्य परिणाम आंशिक रूप से संक्रमित रोगजनक की उग्रता पर निर्भर करता है। चूहों में, दृश्य परिणाम भी उनकी प्रतिरक्षा स्थिति पर निर्भर करता है। प्रायोगिक पशु मॉडल28में रोग का अध्ययन करके रोग रोगजनकता के तंत्र को समझने में मदद की गई है । माउस इंट्राविट्रियल इंजेक्शन के लिए प्रोटोकॉल और संक्रमण के मापदंडों के मात्राकरण को लगभग किसी भी प्रकार के बैक्टीरियल या फंगल रोगजनक28के साथ शुरू किए गए एंडोफेथल्माइटिस का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को शारीरिक परिवर्तनों, भड़काऊ प्रक्रियाओं और संक्रमण के दौरान बैक्टीरिया और मेजबान दोनों के जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए भी लागू और संशोधित किया जा सकता है।

माउस इंट्राविट्रियल इंजेक्शन और संक्रमण मापदंडों के बाद विश्लेषण कई महत्वपूर्ण कदम(चित्रा 7)से मिलकर बनता है । कांच की सुई को सही ढंग से बनाया जाना चाहिए, चिह्नित किया जाना चाहिए और निष्फल किया जाना चाहिए। बेवेल्ड ग्लास सुई और उचित स्केलिंग का तेज अंत बैक्टीरिया और ग्लोब पंचर के पर्याप्त वितरण को निर्धारित करता है। यदि सुई का अंत छोटा है और उचित रूप से खराब नहीं है, तो यह दुनिया पर एक बड़ा छेद बना सकता है जो रिसाव, दुनिया के प्रदूषण और एक गलत बीमारी परिणाम का कारण बन सकता है। इसलिए, एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के 10x ऑप्टिकल ज़ूम के तहत beveling करते हुए ग्लास माइक्रोपिपेटेस का निरीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। बैक्टीरिया की सही मात्रा की डिलीवरी सुनिश्चित करने के लिए, कमजोर पड़ने की गणना पहले से की जानी चाहिए, और कांच की सुई पर उचित मात्रा पैमाने को चिह्नित किया जाना चाहिए। अन्य प्रकार के उपकरणों का उपयोग करके सुई खींचने और बेवेलिंग के मापदंड भिन्न हो सकते हैं।

वर्णित इंट्राविट्रियल इंजेक्शन तकनीक माउस आंख1में बैक्टीरिया के उचित वितरण के लिए हवा से दबाव वाली माइक्रोइंजेक्टर प्रणाली का उपयोग करती है। प्रजनन योग्य संक्रमण मापदंडों के लिए इस माइक्रोइंजेक्टर का उचित उपयोग महत्वपूर्ण है। चूंकि हवा का दबाव प्रसव की गति निर्धारित करता है, अत्यधिक बल तेजी से आंखों में एक बड़ी मात्रा इंजेक्ट हो सकता है, अत्यधिक इंट्राओक्यूलर दबाव और/या ग्लोब टूटना के कारण । इसलिए, सिफारिश प्रक्रिया के दौरान भरने और इंजेक्शन लगाने के लिए 10-13 साई के दबाव का उपयोग करने के लिए है। एक अन्य संभावित मुद्दा भरने के बाद कांच की सुइयों से बैक्टीरियल समाधान का रिसाव है। रिसाव माउस आंखों में गलत मात्रा के इंजेक्शन में परिणाम सकता है । इंजेक्शन से पहले इंजेक्शन सिस्टम, ट्यूबिंग और कांच की सुइयों के बीच हमेशा कनेक्शन की जांच करें।

बैक्टीरिया की सटीक मात्रा इंजेक्शन प्रयोगात्मक बैक्टीरियल एंडोथैल्माइटिस की प्रजनन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है। विभिन्न प्रायोगिक एंडोथैल्माइटिस मॉडल के लिए विशिष्ट संख्या के बैक्टीरिया12 ,28,46,47,48,49के टीका लगाने की आवश्यकता होती है । बी सेरियस एंडोफेथैल्माइटिस के लिए, प्रजनन योग्य संक्रमण शुरू करने के लिए 100 सीएलयू इंजेक्शन की आवश्यकता होती है1. चूंकि बैक्टीरियल विकास विकास के माध्यम और स्थितियों पर निर्भर करता है, इसलिए विकास के माहौल, मीडिया और कमजोर पड़ने को हर बार दोहराया जाना चाहिए। इसलिए, इंजेक्शन के लिए उचित मात्रा में सटीक इनोकुलम को पुन: पेश करने के लिए प्रयोग से पहले संस्कृति की स्थिति का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, माउस आंखों में इंट्राविट्रियल इंजेक्शन के लिए ऊपरी सीमा 1.0 माइक्रोल28है। एक अत्यधिक मात्रा इंट्राओक्यूलर दबाव को बढ़ाती है जिसके परिणामस्वरूप मोतियाबिंद हो सकता है, रेटिना को पीछे के खंड से अलग कर सकता है, या दुनिया को टूटना होता है। इंट्राविट्रियल इंजेक्शन और चूहों में परिणामी संक्रमण मानव में बी सेरियस एंडोफेथैल्माइटिस की पूरी तरह से नकल नहीं कर सकता है। मानव रोग के अधिकांश पशु मॉडल इस तरह से सीमित हैं। पोषक तत्वों से भरपूर मीडिया में वृद्धि के बाद बी सेरियस की ज्ञात मात्रा आंख में इंजेक्ट की जाती है। बी सेरियस एंडोफेथैल्माइटिस के नैदानिक मामलों के लिए, संक्रमित मात्रा ज्ञात नहीं है और संदूषण के स्रोत भिन्न होते हैं। हालांकि, विशेषता वाले जीवों और माउस उपभेदों का उपयोग करने और प्रजनन योग्य संक्रमण पाठ्यक्रम पैदा करने के फायदे इन सीमाओं से पल्ला झाड़ लेते हैं।

संक्रमित आंखों की उचित कटाई एक और महत्वपूर्ण कदम है। किसी भी क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए एसेप्टिक स्थितियों को बनाए रखना आवश्यक है जो डेटा की व्याख्या में हस्तक्षेप कर सकता है। इसलिए, सिफारिश फसल से पहले 70% इथेनॉल के साथ कार्यक्षेत्र और सभी उपकरणों को कीटाणुरहित करने के लिए है। संक्रमण के दौरान विट्रियस वातावरण के अंदर बैक्टीरियल की संख्या तेजी से बढ़ती है, जिससे आंखों में सूजन आ सकती है। इसलिए, दुनिया के टूटने को रोकने के लिए कटाई के दौरान आंख को धीरे से हटाने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। इसके अलावा, संक्रमित आंख युक्त फसल ट्यूब की टोपी को ऊतक समरूप में ट्यूब रखने से पहले पर्याप्त रूप से कड़ा किया जाना चाहिए। एक ढीली टोपी के परिणामस्वरूप ऊतक समरूप के रिसाव और संदूषण में परिणाम होगा जिससे लीक ट्यूबों में बैक्टीरिया की गलत मात्रा हो जाएगी। आंख समरूपता प्रक्रिया भी ट्यूबों के तापमान को ऊपर बढ़ा देती है। इसलिए, एक समय में 1 मिनट समरूप बनाने की सिफारिश की जाती है। ऊंचा तापमान कुछ संक्रमण मापदंडों के मात्रा को प्रभावित कर सकता है। हालांकि यह विधि आंख के विशिष्ट स्थानों के भीतर बैक्टीरिया की संख्या प्रदान नहीं करती है, जब हिस्टोलॉजिकल तरीकों के साथ संयुक्त होती है, तो हम अनुमान लगा सकते हैं कि बैक्टीरिया को स्थानीयकृत किया जा सकता है। खरगोशों में एंडोफ्थल्माइटिस के दौरान आंखों में बी सेरियस का स्थानीयकरण सूचित किया गया है, जिनकी आंखें बड़ी हैं और अधिक आसानी से उपविभाग में विच्छेदित हैं। 2

इंट्राविट्रियल इंजेक्शन आंख के पीछे के खंड में जीवों के वितरण की नकल करता है, जो संक्रमण शुरू करता है। यह प्रारंभिक कदम प्रयोगात्मक एंडोफ्थल्माइटिस के अत्यधिक प्रजनन माउस मॉडल में संक्रमण मापदंडों के गुणात्मक और मात्रात्मक अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है। इन मॉडलों का उपयोग न्यूट्रोफिल में घुसपैठ करने में माइलोप्रोक्सिडेस को निर्धारित करके, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विशिष्ट कोशिका प्रकारों की पहचान करने, वास्तविक समय पीसीआर और/या एलिसा द्वारा साइटोकाइन की मात्रा और हिस्टोपैथोलॉजी1, 6,19,20,26,27,34,35,8 द्वारा नेत्र वास्तुकला का अवलोकन करके नेत्र सूजन का अनुमान लगाने के लिए भी कियाजाताहै। संक्रमित माउस आंखों को मापा जाने वाले संक्रमण मापदंडों के प्रकार के आधार पर विभिन्न मंदियों के साथ काटा जाता है। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए, एक अलग लाइसिस बफर की आवश्यकता है26। हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा के लिए, काटी गई आंखों को एक स्थिर समाधान में रखा जाता है। आनुवंशिक नॉकआउट चूहों की भीड़ भी विभिन्न प्रतिरक्षा कारकों और कोशिकाओं की भूमिका का अध्ययन करने की सुविधा प्रदान करती है। इंट्राविट्रियल इंजेक्शन इसलिए इंट्राओक्यूलर संक्रमण और चिकित्सीय के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए एक मुख्य आधार तकनीक है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कोई वित्तीय संघर्ष नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक डॉ फेंग ली और मार्क Dittmar (OUHSC P30 लाइव एनिमल इमेजिंग कोर, डीन ए मैकजी आई इंस्टीट्यूट, ओकलाहोमा सिटी, ओके, यूएसए) को उनकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं । हमारे शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया है R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947, और R01EY024140. हमारे शोध को P30EY21725 (एनआईएच कोर ग्रांट फॉर लाइव एनिमल इमेजिंग एंड एनालिसिस, मॉलिक्यूलर बायोलॉजी और सेलुलर इमेजिंग) द्वारा भी समर्थन दिया गया है। हमारे शोध को एनईआई विजन साइंस प्री-डॉक्टोरल ट्रेनी प्रोग्राम 5T32EY023202, प्रेस्बिटेरियन हेल्थ फाउंडेशन रिसर्च सपोर्ट ग्रांट और डीन ए मैकजी आई इंस्टीट्यूट को रिसर्च से अंधापन रोकने के लिए अप्रतिबंधित अनुदान का भी समर्थन किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 168 बैक्टीरियल आई संक्रमण इंट्राओक्यूलर बैक्टीरियल क्वांटिफिकेशन नेत्र संक्रमण पैरामीटर इंट्राविट्रियल इंजेक्शन इंट्राओक्यूलर इंजेक्शन एंडोफेथैल्माइटिस
बैक्टीरियल एंडोफ्थैल्माइटिस के माउस मॉडल में संक्रमण मापदंडों का इंट्राविट्रियल इंजेक्शन और क्वांटिटेशन
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Mursalin, M. H., Livingston, E.,… More

Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).

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