Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Intravitreale injectie en kwantificering van infectieparameters in een muismodel van bacteriële endoftalmitis

Published: February 6, 2021 doi: 10.3791/61749
Automatic Translation
*1,2, *1, 2,3, 4, 2,3, 1,2,3
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

We beschrijven hier een methode van intravitreale injectie en daaropvolgende bacteriële kwantificering in muismodel van bacteriële endoftalmitis. Dit protocol kan worden uitgebreid voor het meten van gastheer immuunresponsen en bacteriële en gastheer genexpressie.

Abstract

Intraoculaire bacteriële infecties vormen een gevaar voor het gezichtsvermogen. Onderzoekers gebruiken diermodellen om de gastheer- en bacteriële factoren en immuunresponstrajecten in verband met infectie te onderzoeken om levensvatbare therapeutische doelen te identificeren en om geneesmiddelen te testen om blindheid te voorkomen. De intravitreale injectietechniek wordt gebruikt om organismen, drugs of andere stoffen rechtstreeks in de glasholte in het achterste segment van het oog te injecteren. Hier hebben we deze injectietechniek aangetoond om infectie in het muizenoog te starten en de techniek van het kwantificeren van intraoculaire bacteriën. Bacillus cereus werd gekweekt in de hersenen hart infusie vloeibare media voor 18 uur en opnieuw geschorst tot een concentratie 100 kolonie vormen eenheden (CFU)/0.5 μL. Een C57BL/6J muis werd verdoofd met behulp van een combinatie van ketamine en xylazine. Met behulp van een picolitermicroinjector en glazen capillaire naalden werd 0,5 μL van de Bacillus-suspensie in het middenglas van het muizenoog geïnjecteerd. De contralaterale controle oog werd ofwel geïnjecteerd met steriele media (chirurgische controle) of werd niet geïnjecteerd (absolute controle). Na 10 uur na infectie werden muizen geëuthanaseerd en werden de ogen geoogst met steriele chirurgische pincet en in een buis geplaatst met 400 μL steriele PBS en 1 mm steriele glazen kralen. Voor ELISA's of myeloperoxidasetesten werd eiwitaseremmer aan de buizen toegevoegd. Voor RNA-extractie is de juiste lysisbuffer toegevoegd. Ogen werden gehomogeniseerd in een weefsel homogenisator voor 1-2 minuten. Homogenaten werden serieel verdund 10-voudig in PBS en track verdund op agar platen. De rest van de homogenaten werd opgeslagen bij -80 °C voor extra tests. Platen werden 24 uur lang geïncubeerd en CFU per oog werd gekwantificeerd. Deze technieken resulteren in reproduceerbare infecties in de ogen van de muis en vergemakkelijken kwantificering van levensvatbare bacteriën, de gastheer immuunrespons, en omica van gastheer en bacteriële genexpressie.

Introduction

Bacteriële endoftalmitis is een verwoestende infectie die ontstekingen veroorzaakt, en, indien niet goed behandeld, kan resulteren in verlies van gezichtsvermogen of blindheid. Endophthalmitis is het gevolg van de binnenkomst van bacteriën in het binnenste van het oog1,2,3,4,5. Eenmaal in het oog, bacteriën repliceren, produceren toxines en andere schadelijke factoren, en kan onomkeerbare schade aan delicate netvliescellen en weefsels veroorzaken. Oculaire schade kan ook worden veroorzaakt door ontsteking, als gevolg van de activering van ontstekingstrajecten die leiden tot inflammatoire celinstroom in het binnenste van het oog1,5,6. Endophthalmitis kan optreden na intraoculaire chirurgie (postoperatieve), een doordringende verwonding aan het oog (posttraumatisch), of van gemetastaserende verspreiding van bacteriën in het oog van een andere anatomische plaats (endogene)7,8,9,10. Behandelingen voor bacteriële endophthalmitis omvatten antibiotica, ontstekingsremmende geneesmiddelen of chirurgische ingreep3,4,11. Zelfs met deze behandelingen, visie of het oog zelf kan verloren gaan. De visuele prognose na bacteriële endophthalmitis varieert over het algemeen afhankelijk van de effectiviteit van de behandeling, de gezichtsscherpte bij de presentatie en de virulentie van het infecterende organisme.

Bacillus cereus (B. cereus) is een van de belangrijkste bacteriële pathogenen die posttraumatische endophthalmitis7,12veroorzaakt . Een meerderheid van B. cereus endophthalmitis gevallen hebben een snelle cursus, die kan resulteren in blindheid binnen een paar dagen. De kenmerken van B. cereus endophthalmitis omvatten snel evoluerende intraoculaire ontsteking, oogpijn, snel verlies van gezichtsscherpte, en koorts. B. cereus groeit snel in het oog in vergelijking met andere bacteriën die vaak ooginfecties veroorzaken2,4,12 en bezit vele virulentie factoren. Daarom is het venster voor succesvolle therapeutische interventie relatief kort1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Behandelingen voor deze infectie zijn meestal succesvol in de behandeling van endophthalmitis veroorzaakt door andere minder virulente ziekteverwekkers, maar B. cereus endoftalmitis resulteert meestal in meer dan 70% van de patiënten die lijden aan aanzienlijk verlies van het gezichtsvermogen. Ongeveer 50% van deze patiënten ondergaan ontdaan of inappucleratie van het geïnfecteerde oog7,16,22,23. De destructieve en snelle aard van B. cereus endoftalmitis vraagt om onmiddellijke en juiste behandeling. De recente vooruitgang bij het onderscheiden van de onderliggende mechanismen van ziekteontwikkeling heeft potentiële streefcijfers voor interventie19,26,27vastgesteld . Experimentele muismodellen van B. cereus endophthalmitis blijven nuttig bij het onderscheiden van de mechanismen van infectie en het testen van potentiële therapieën die verlies van het gezichtsvermogen kunnen voorkomen.

Experimentele intraoculaire infectie van muizen met B. cereus is een instrumenteel model voor het begrijpen van bacteriële en gastheer factoren, evenals hun interacties, tijdens endophthalmitis28. Dit model bootst een posttraumatisch of postoperatief voorval na, waarbij bacteriën in het oog worden gebracht tijdens een verwonding. Dit model is zeer reproduceerbaar en is nuttig geweest voor het testen van experimentele therapieën en het verstrekken van gegevens voor verbeteringen in de standaard van de zorg1,6,19,29,30. Net als veel andere infectie modellen, dit model zorgt voor onafhankelijke controle van vele parameters van infectie en maakt efficiënt en reproduceerbaar onderzoek van infectie resultaten. Studies in een soortgelijk model bij konijnen in de afgelopen decennia hebben de effecten onderzocht van B. cereus virulentiefactoren in het oog2,4,13,14,31. Door b. cereus mutantstammen te injecteren zonder individuele of meervoudige virulentiefactoren, kan de bijdrage van deze virulentiefactoren aan de ernst van de ziekte worden gemeten aan de gevolgen zoals de concentratie van bacteriën op verschillende uren nainfectie of het verlies van visuele functie13,14,27,31,32. Bovendien zijn in dit model hostfactoren onderzocht door knock-outmuisstammen te infecteren zonder specifieke ontstekingsfactoren26,29,33,34,35. Het model is ook nuttig voor het testen van mogelijke behandelingen voor deze ziekte door het injecteren van nieuwe verbindingen in het oog na infectie30,36. In dit manuscript beschrijven we een gedetailleerd protocol dat het infecteren van een muizenoog met B. cereusomvat, het oogsten van het oog na infectie, het kwantificeren van intraoculaire bacteriële belasting en het bewaren van specimens om extra parameters van de ernst van de ziekte te testen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd naar aanleiding van de aanbevelingen in de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren en de Association for Research in Vision and Ofhthalmology Statement for the Use of Animals in Oogheelkundig en Vision Research. De protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Oklahoma Health Sciences Center (protocolnummers 15-103, 18-043 en 18-087).

1. Steriele glazen naalden

  1. Zet de naaldpipettrekker aan.
  2. Pas de heater-knop aan totdat het display 12.6 toont.
  3. Open de deur en voer de 5 μL capillaire buis handmatig door de bovenste klem en de verwarming filament totdat de helft van de slang zich uitstrekt tot onder de gloeidraad (Figuur 1A).
  4. Bevestig dat de capillaire buis zich in de "V" groef in de bovenste klem bevindt. Draai de bovenste klem vast.
  5. Als de onderste klem open is, past u de verticale schuif handmatig aan tot de onderste klem de bovengrens bereikt. Bevestig dat de buis zich in de "V" groef in de onderste klem bevindt. Draai de onderste klem aan.
  6. Sluit de deur en bevestig dat het 'Ready' lampje aan staat. Druk op de startknop om de verwarmings- en trekvolgorde te starten(figuur 1B).
  7. Zorg ervoor dat de kachel automatisch wordt uitgeschakeld na hitte en de zwaartekracht trekt de capillaire buis uit elkaar(figuur 1C), en de dia beweegt naar beneden.
  8. Doe de deur open. Terwijl u de bovenkant van de capillaire buis vasthoudt, u de bovenste klem onttrekken. Verwijder de bovenste capillaire buis en zet deze opzij.
  9. Houd de capillaire buis in de onderste schuif en untighten de onderste klem. Verwijder de onderste capillaire buis en zet deze opzij.
  10. Gebruik een micro-elektrodeschuin met een aluminiumoxide-schuurplaat van 0,05 μm om de getrokken capillaire buis te schuintrekken om de injectienaalden te creëren.
  11. Pipette genoeg water op de slijpplaat om het oppervlak te bedekken (Figuur 1D).
  12. Zet de schuine kanter zo in dat deze begint te draaien bij 60 rpm. Plaats de getrokken capillaire buis in de pipetklem in de "V" groef. Draai de klem vast en stel de hoek van de pipetklem op 30°.
  13. Pas de punt van de puntige rand van de capillaire buis ongeveer twee derde afstand van het centrum van rotatie van de slijpplaat.
  14. Laat de geklemde capillaire buis zakken door de grove bedieningsknop aan de bovenkant van de manipulator aan te passen. Blijf de capillaire buis verlagen totdat de punt van de capillaire buis zich onder het wateroppervlak uitstrekt en het schurende oppervlak van de slijpplaat in contact komt.
  15. Controleer de afschuiningsvoortgang met behulp van de microscoop die aan de schuine kant is bevestigd. Pas na 5 minuten de fijne controle aan om de glazen naald van de slijpplaat te halen.
  16. Verwijder de glazen naald en plaats deze onder 10x vergroting om de punt van de capillaire buis te controleren (figuur 1E,F).
  17. Om ervoor te zorgen dat er geen blokkades zijn, steek je de glasnaald in een pipethouder op een spuit en duw je lucht in een buis van 99% ethanol. Als luchtbellen zich vormen aan het puntje van de naald, de naald heeft geen blokkades en kan worden gebruikt voor microinjectie. Dit proces zorgt ook voor de steriliteit van de glasnaalden.
  18. Eén capillaire buis kan tot 5 μL vloeistof bevatten. Markeer de capillaire buis in 10 secties om de afstanden op de naald te berekenen om te markeren voor 0,5 μL volumes. Markeer een weegschaal met die afstand die 0,5 μL bevat voor toekomstige voorbereiding. Voor een naald van 5 μL komen afstanden van 0,7 mm uit elkaar overeen met 0,5 μL (figuur 1G).

2. Bacillus cereus cultuur

  1. Voer alle procedures in deze sectie uit onder Biosafety Level 2 voorwaarden.
  2. Streep vriesbouillon van B. cereus ATCC 14579 voor eenkolonie isolatie van één kolonie op een 5% schapenbloed agar plaat en incubeer 's nachts bij 37 °C (Figuur 2A).
  3. Pipette 5 mL steriele Brain Heart Infusion (BHI) bouillon in een 10 mL steriele snap-cap buis (Figuur 2B). Kies met behulp van een steriele lus of naald een enkele kolonie B. cereus ATCC 14579 van de agarplaat en inent de vloeistof BHI.
  4. Vortex het monster kort. Plaats de snap-cap buis in een roterende couveuse. Stel de temperatuur in op 37 °C en snelheid op 200 tpm. Na 18 uur, verwijder de cultuur uit de couveuse (Figuur 2B).

3. Bacteriële verdunning voor intravitreale injectie

  1. Voer alle procedures in deze sectie uit onder Biosafety Level 2 voorwaarden.
  2. Bereken het volume van de 's nachts B. cereus cultuur toe te voegen aan 10 mL verse BHI tot 200 kolonievormende eenheden per microliter (CFU/μL) te bereiken. Bijvoorbeeld, een nachtelijke cultuur van B. cereus in BHI repliceert tot ongeveer 2 x 108 CFU/mL, die vervolgens kan worden verdund tot 200 CFU/μL door 10 μL van de nachtelijke cultuur in 10 mL verse BHI te pipetten.
  3. Pipette 1 mL van de vers verdunde cultuur in een 1,5 mL microcentrifuge buis. Houd deze buis op ijs tot intravitreal injectie. Voer de intravitreale injectie uit binnen 60 minuten na het verdunnen van de bacteriële cultuur.

4. Intravitreale injectie van muizen

  1. Voer alle procedures in deze sectie uit onder Biosafety Level 2 voorwaarden.
  2. Bereid de procedure site door het plaatsen van medische onderpads op de operatietafel.
  3. Zet de microinjector aan en open de gasklep op de persluchttank die aan de microinjector is bevestigd. Pas de tankregelaar aan tot de gastoevoer ongeveer 60 psi is.
  4. Druk op de microinjector op Modus totdat het scherm Balanstoont. Druk op Balans en plaats de computermuis op de operatietafel. Sluit de roestvrijstalen pipethouder aan op de slang die is bevestigd aan 'Fill/Output' van de injector. Deze buis is altijd verbonden met de injector.
  5. Plaats de capillaire naald aan de andere kant van de pipethouder door de pipethouderconnector rond de naald stevig te schroeven.
  6. Zet de oogheelkundige microscoop aan en zet het licht aan tot een intensiteit van 50%. Pas de microscoop over de proceduresite op de operatietafel en pas de microscoop aan de gewenste focus aan.
  7. Voordat de procedure begint, bevestig dan dat de muis voldoende verdoofd is door de pedaalherontwenningsreflex te testen. Zorg ervoor dat u uw IACUC goedgekeurd protocol voor anesthesie te volgen.
  8. Plaats de verdoofde muis op de medische onderpads met zijn neus naar rechts gericht en leunend aan de linkerkant.
  9. Kijk naar het rechteroog van de muis door de oogheelkundige microscoop en open de deksels door het openen van de tangen van een omgekeerde actie tangen aan weerszijden van het oog om de injectieplaats bloot te stellen (Figuur 3C).
  10. Vul de capillaire naald met de 200 CFU/μL verdunning door links te klikken op de muismat die is aangesloten op de microinjector (figuur 3D).
  11. Bevestig het hoofd van het dier met de linkerhand en plaats het puntje van de naald op de limbus van het oog. Met de naald in de schuine kant positie en onder 45° hoek, punctie het oog van de muis, maar zorg ervoor dat alleen de scherpe punt van de naald (~ 0,5 mm) wordt ingevoegd bij het injecteren.
  12. Zodra de naaldpunt is ingebracht, beweegt u de linkerhand van de muiskop naar de muismat en klikt u met de rechtermuisknop op de muismat om 0,5 μL van de B. cereusverdunning te injecteren. Om lekkage te voorkomen, laat u de naaldpunt 2-3 seconden in het oog van de muis voordat u deze verwijdert (figuur 3E)1,19,26,27,32,34,36,37,38.
  13. Laat de tangen los en plaats de muis in een kooi die op een warm pad zit. Controleer deze muizen totdat ze zijn hersteld van anesthesie(figuur 3F).
  14. Zodra muizen zijn hersteld van de verdoving, de kooi terug te keren naar de juiste rack. Als de muizen zullen worden onderworpen aan retinale functie analyse door elektroretinografie, kooien moeten worden teruggestuurd naar een donkere kamer voor een goede donkere aanpassing.

5. Bereiding van de oogstbuis

  1. Plaats 1 mm steriele glazen kralen in 1,5 mL schroefdopbuizen.
  2. Steriliseren deze buizen in een autoclave op een droge instelling. Laat de buizen afkoelen tot kamertemperatuur voor gebruik.
  3. Voeg 10 mL 1x steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan een steriele centrifugebuis van 15 mL.
  4. Voeg 1 tablet protease inhibitor cocktailtablet toe aan de buis. Meng door19,27,29,34,35tevortexen .
  5. Pipette 400 μL van 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met proteaseremmer in elke autoclaved oogstbuis. Label de buizen en plaats op ijs. (Figuur 4A).

6. Het oogsten van de ogen

  1. Voer alle procedures in deze sectie uit onder Biosafety Level 2 voorwaarden.
  2. Euthanaserië de muis door CO 2-inademing. Gebruik een secundaire methode om euthanasie te bevestigen.
  3. Houd de geëuthanaseerde muiskop veilig en open de fijne punt tang aan weerszijden van het geïnfecteerde oog. Duw naar beneden naar het hoofd om het oog te proptose. Zodra de tang achter de aardbol van het oog, knijp de tang samen. Trek tangen van het hoofd weg om de oogbol los te maken(figuur 4B).
  4. Plaats de oogbol onmiddellijk in een gelabelde oogstbuis. Plaats buizen op ijs voor niet meer dan 60 min (Figuur 4C).

7. Intraoculair bacterieaantal

  1. Voer alle procedures in deze sectie uit onder Biosafety Level 2 voorwaarden.
  2. Bevestig dat alle oogstbuizen goed gesloten zijn en in evenwicht zijn in de weefselhomogenisator(figuur 5A). Zet de weefselhomogenisator gedurende 1 min aan om de monsters te homogeniseren. Wacht tot 30 s, dan weer voor een minuut. Plaats buizen op ijs (figuur 5B,C).
  3. Verdun elk monster in serie 10-voudig door achtereenvolgens 20 μL van het homogenaat over te brengen in 180 μL steriele 1x PBS. Verdun tot een factor 10-7 is bereikt (figuur 5D).
  4. Label elke rij van een warme, vierkante BHI plaat met de juiste verdunningsfactoren. Breng 10 μL van elke verdunning op een rij over naar de bovenste BHI-plaat die ongeveer 45° gekanteld is. Laat het monster lopen totdat het bijna de onderkant van de plaat bereikt, leg dan de plaat plat (Figuur 5E)39.
  5. Wanneer het monster in de BHI agar wordt opgenomen, brengt u de plaat over naar een couveuse van 37 °C. Kolonies moeten 8 uur na plaatsing in de couveuse zichtbaar beginnen te zijn.
  6. Verwijder de plaat uit de couveuse voordat de groei van de B. cereuskolonies interfereert met het identificeren van individuele kolonies(figuur 5F).
  7. Voor een nauwkeurige weergave van de concentratie in het monster, tel de rij die tussen de 10-100 kolonies heeft. Bijvoorbeeld, een rij met de verdunningsfractie van 10-4 die 45 kolonies heeft, heeft een concentratie van 4,5 x 105 CFU/mL.
  8. Om het totale aantal bacteriën per oog te berekenen, vermenigvuldigt u de concentratie met 0,4, wat het millilitervolume van 1x PBS vertegenwoordigt dat wordt gebruikt om het oog te homogeniseren. De 4,5 x 105 CFU/mL-concentratie zou bijvoorbeeld zich vertalen naar 1,8 x 105 CFU B. cereus per oog.

8. Behoud van monsters

  1. Plaats homogenaatmonsters in een gelabelde vrieskist en plaats deze doos in een vriezer van -80 °C. Deze monsters kunnen later worden gebruikt voor ontstekingsmediatoranalyse door ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het genereren van een reproduceerbaar entmateriaal en nauwkeurigheid van de intravitreale injectieprocedure zijn belangrijke stappen in het ontwikkelen van modellen van microbiële endoftalmitis. Hier hebben we aangetoond dat de intravitreal injectie procedure met behulp van Gram-positieve Bacillus cereus. We injecteerden 100 CFU/0,5 μL B. cereus in het middenglas van vijf C57BL6 muizen. Na 10 uur nainfectie zagen we intraoculaire groei van B. cereus tot ongeveer 1,8 x 105 CFU/oog. Figuur 1 toont de constructie van glazen naalden om de bacteriën te leveren in het midden van de muisogen. Bacillus cereus die op een bloedagarplaat en in cultuurbuizen groeit wordt getoond in Figuur 2. Figuur 3 toont de intravitreale injectieprocedure van de muis met behulp van een luchtinjectiesysteem. Figuur 4 toont het proces van het oogsten van de geïnfecteerde ogen na de gewenste tijd postinfectie. Figuur 5 toont de techniek voor het homogeniseren van de geïnfecteerde ogen. Figuur 6 toont de intraoculaire bacteriële tellingen van vijf verschillende muisogen bij 10 uur postinfectie. Figuur 7 toont de algemene procedure en een grafische weergave van een intravitreale injectie van de muis.

Figure 1
Figuur 1: Het maken van afgeschuinde glazen naalden. Glazen naalden werden gemaakt van wegwerpmicrocapillaire pipetten met behulp van een naald/pipettrekker en een micropipetschuin. (A) Geklemde glazen capillaire buis in de naald/pipettrekker. (B,C) Creatie van glazen naalden met behulp van de gewenste spanning. (D) Schuine kanting van de glazen micropipetten. (E,F) Glazen micropipetten voor en na het afschuinen. (E) Het schalen van de glazen naalden. Ruimte tussen twee zwarte punten bevat 0,5 μL. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Bacillus cereus ATCC 14579. (A) Bacillus cereus groeien op een bloed agar plaat. Individuele kolonies van B. cereus tonen meestal duidelijke zones van hemolyse op een bloedagarplaat. (B) Turbid overnight culturen van B. cereus. c) Opdringing van B. cereus. B. cereus zijn Gram-positieve staaf-vormige bacteriën. (D) Elektronenmicrograaf van Bacillus cereus. Deze elektronenmicrograaf toont staafvormige Bacillus cereus met haar als structuren genoemd flagella. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Muis intravitreal injectie. De injectieprocedure wordt uitgevoerd met behulp van een luchtinjector onder druk met het bekijken van het werkveld met behulp van een commerciële microscoop(A)ketamine en xylazinemedicijn om de muis te verdoven. (B) Toediening van ketamine en xylazine door intraperitoneale injectie om de muis te verdoven. (C) Klemmen perioculaire huid terug naar proptose het oog. (D) Het vullen van de naalden met bacteriën met behulp van de lucht onder druk injector. (E) Intravitreal-injectie. (F) Monitoring geïnfecteerde muis na anesthesie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Oogst muis besmet oog. Na infectie, na het gewenste tijdpunt, oogst geïnfecteerde muisogen met steriele pincet. a) PBS met steriele glazen kralen. (B) Oogsten van het besmette oog. (C) Oogstbuis met een muizenoog. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Verwerking van het geoogste oog voor intraoculair bacterie tellen. (A) Oogstbuis met besmet oog stevig vastgeklemd aan een weefselhomogenisator. (B) Geïnfecteerde ogen werden twee keer gehomogeniseerd gedurende 1 min per stuk. Track verdunning (D) van de ooghomogenaten (C) en de daaropvolgende beplating (E) voor de bacteriële kwantificering. (E) Representatieve individuele Bacillus cereus kolonie na spoorverdunning. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Intraoculaire bacteriële tellingen bij 10 uur nainfectie. M, muisnummer. CFU, kolonievormende eenheden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Muis intravitreal injectie. (A)Algemeen stroomdiagram van de intravitreale injectieprocedure van de muis. b) grafische presentatie van de intravitreale injectie. Tijdens de procedure worden steriele, afgeschuinde glasnaalden met een cultuur van B. cereus in het midden van het muizenoog ingebracht en B. cereus wordt geleverd met behulp van een micro-injectiesysteem onder lucht. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zelfs met de beschikbaarheid van krachtige antibiotica, ontstekingsremmende geneesmiddelen en vitrectomiechirurgie, bacteriële endophthalmitis kan een patiënt blind maken. Klinische studies zijn nuttig geweest bij het bestuderen van endophthalmitis; echter, experimentele modellen van endoftalmitis bieden snelle en reproduceerbare resultaten die kunnen worden vertaald naar vooruitgang in de standaard van de zorg, wat resulteert in een betere visuele uitkomst voor patiënten.

Het glasvochtvolume van het muizenoog is ongeveer 7 μL40. Dit kleine volume maakt het slechts mogelijk om een beperkte hoeveelheid materiaal te injecteren. Volumes groter dan 1,0 μL mogen niet worden geïnjecteerd om oogschade te voorkomen. Het proces vereist specifieke apparatuur en de praktijk van technieken om reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid te garanderen. Endophthalmitis is onderzocht bij primaten, varkens, konijnen, ratten, cavia's en bij de muis28,41,42,43,44,45. Onder de grotere soorten, ogen zijn veel dichter in grootte aan de menselijke ogen, en intravitreal injecties in grotere ogen kunnen worden uitgevoerd zonder speciale apparatuur. Met uitzondering van de muis beperkt de afwezigheid van knock-outstammen en reagentia om de immuunrespons van de gastheer in andere diermodellen te bestuderen hun nut bij experimentele endoftalmitis.

Endophthalmitis komt het vaakst voor als een complicatie van staarchirurgie. Deze infectie kan ook optreden na indringende oculaire trauma of systemische infectie. De visuele uitkomst bij deze ziekte hangt deels af van de virulentie van de infecterende ziekteverwekker. Bij muizen hangt visuele uitkomst ook af van hun immuunstatus. Inzicht in de mechanismen van ziektepathogenese is vergemakkelijkt door het bestuderen van de ziekte in experimentele diermodellen28. Het protocol voor intravitreale injectie door muizen en de kwantificering van infectieparameters kunnen worden aangepast om endophthalmitis te bestuderen die is gestart met bijna elk type bacteriële of schimmelpathogen28. Bovendien kan dit protocol ook worden toegepast en aangepast om anatomische veranderingen, ontstekingsprocessen en de genexpressieprofielen van zowel de bacteriën als de gastheer tijdens infectie te bestuderen.

Muis intravitreale injectie en latere analyse van infectie parameters bestaan uit verschillende kritische stappen (figuur 7). De glazen naald moet nauwkeurig worden gemaakt, gemarkeerd en gesteriliseerd. Het scherpe uiteinde van schuine glazen naald en de juiste schaling bepaalt de adequate levering van de bacteriën en de bol punctie. Als het einde van de naald kort is en niet op de juiste wijze is afgeschuinde, kan het een groot gat op de aardbol creëren dat lekkage, verontreiniging van de aardbol en een onjuiste ziekteuitkomst kan veroorzaken. Daarom wordt aanbevolen om de glazen micropipetten te observeren terwijl u onder 10x optische zoom van een heldere veldmicroscoop hangt. Om de juiste hoeveelheid bacteriën te kunnen leveren, moeten verdunningen vooraf worden berekend en moet de juiste volumeschaal op de glazen naald worden gemarkeerd. Parameters voor naald trekken en schuintrekken met behulp van andere soorten apparatuur kan variëren.

De beschreven intravitreale injectietechniek maakt gebruik van een microinjectorsysteem onder lucht voor de juiste levering van de bacteriën in het muizenoog1. Het juiste gebruik van deze microinjector is cruciaal voor de reproduceerbare infectieparameters. Aangezien de luchtdruk de snelheid van de levering bepaalt, kan overmatige kracht snel een groter volume in de ogen injecteren, waardoor overmatige intraoculaire druk en/of een breuk op de aardbol ontstaat. Daarom is de aanbeveling om een druk van 10-13 psi te gebruiken om te vullen en te injecteren tijdens de procedure. Een ander mogelijk probleem is het lekken van de bacteriële oplossing uit de glasnaalden na het vullen. Lekkage kan leiden tot de injectie van onnauwkeurige volumes in de ogen van de muis. Controleer altijd de verbindingen tussen het injectiesysteem, de buizen en de glasnaalden vóór injecties.

Het injecteren van nauwkeurige hoeveelheden bacteriën is van vitaal belang voor de reproduceerbaarheid van experimentele bacteriële endophthalmitis. Verschillende experimentele endoftalmitismodellen vereisen inenting van specifieke aantallen bacteriën12,28,46,47,48,49. Voor B. cereus-endoftalmitis is het injecteren van 100 CFU nodig om een reproduceerbare infectie te starten1. Aangezien bacteriële groei afhankelijk is van het groeimedium en de omstandigheden, moeten het groeiklimaat, de media en de verdunningen telkens worden herhaald. Daarom wordt aanbevolen om de kweekomstandigheden vóór het experiment te testen om het nauwkeurige entmateriaal in het juiste volume voor injectie te reproduceren. Zoals hierboven vermeld, is de bovengrens voor intravitreale injectie in muisogen 1,0 μL28. Een overmatig volume verhoogt de intraoculaire druk die kan resulteren in glaucoom, het netvlies los te maken van het achterste segment, of scheur de wereldbol. Intravitreale injectie en de resulterende infectie bij muizen kunnen niet perfect na te bootsen B. cereus endoftalmitis bij een mens. De meeste diermodellen van menselijke ziekte zijn op deze manier beperkt. Bekende hoeveelheden B. cereus worden geïnjecteerd in het oog na de groei in voedselrijke media. Voor klinische gevallen van B. cereus-endoftalmitis zijn de infecterende hoeveelheden niet bekend en variëren de bronnen van besmetting. Echter, de voordelen van het gebruik van gekarakteriseerde organismen en muizenstammen en het genereren van reproduceerbare infectie cursussen opwegen tegen deze beperkingen.

Een goede oogst van geïnfecteerde ogen is een andere kritieke stap. Het handhaven van aseptische omstandigheden is essentieel om kruisbesmetting te voorkomen die de interpretatie van de gegevens zou kunnen verstoren. Daarom is de aanbeveling om de werkbank en alle instrumenten voor de oogst te desinfecteren met 70% ethanol. Bacteriële aantallen nemen snel toe in de glasachtige omgeving tijdens infectie, wat zwelling van het oog kan veroorzaken. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat het oog tijdens het oogsten voorzichtig wordt verwijderd om breuk van de aardbol te voorkomen. Bovendien moet de dop van de oogstbuis met het besmette oog voldoende worden aangedraaid voordat de buis in weefselhomogenisator wordt geplaatst. Een losse dop zal leiden tot lekkage en verontreiniging van de weefselhomogenisator die leidt tot onjuiste kwantificering van bacteriën in de lekkende buizen. De ooghomogenisatieprocedure verhoogt ook de temperaturen van de buizen. Daarom wordt aanbevolen om 1 minuut per keer te homogeniseren. Verhoogde temperaturen kunnen van invloed zijn op de kwantificering van sommige infectieparameters. Hoewel deze methode niet het aantal bacteriën binnen specifieke plaatsen van het oog biedt, in combinatie met histologische methoden, kunnen we schatten waar bacteriën kunnen worden gelokaliseerd. Lokalisatie van B. cereus in het oog tijdens endoftalmitis is gemeld bij konijnen, waarvan de ogen groter zijn en gemakkelijker ontleed in subcompartimenten. 2.

Intravitreal injectie bootst de levering van organismen aan het achterste segment van het oog, die infectie initieert. Deze eerste stap vergemakkelijkt de kwalitatieve en kwantitatieve studie van infectieparameters in een zeer reproduceerbaar muismodel van experimentele endophthalmitis. Deze modellen worden ook gebruikt om oculaire ontstekingen te schatten door myeloperoxidase te kwantificeren bij het infiltreren in neutrofielen, specifieke celtypen te identificeren door stromingscytometrie, cytokinen en chemokines te kwantificeren door real-time PCR en/of ELISA, en oculaire architectuur te observeren door histopathologie1,6,19,20,26,27,34,35,38. Geïnfecteerde muisogen worden geoogst met verschillende verdunningsels, afhankelijk van het type infectieparameters dat moet worden gemeten. Voor genexpressieanalyse is een andere lysisbuffer vereist26. Voor histopathologisch onderzoek worden geoogste ogen in een fixatieve oplossing geplaatst. De veelheid van genetische knock-out muizen vergemakkelijkt ook de studie van de rol van verschillende immuunfactoren en cellen. Intravitreale injectie is daarom een steunpilaar techniek voor onderzoekers op het gebied van intraoculaire infecties en therapieën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen financiële conflicten te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Dr. Feng Li en Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) voor hun hulp. Ons onderzoek is ondersteund door National Institutes of Health subsidies R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 en R01EY024140. Ons onderzoek is ook ondersteund door P30EY21725 (NIH CORE subsidie voor Live Animal Imaging and Analysis, Molecular Biology, en Cellular Imaging). Ons onderzoek is ook ondersteund door de NEI Vision Science Pre-doctoral Trainee programma 5T32EY023202, een Presbyterian Health Foundation Research Support subsidie, en een onbeperkte subsidie aan de decaan A. McGee Eye Institute van Research to Prevent Blindness.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Pathogenesis of gram-positive bacterial endophthalmitis. Infection and Immunity. 67 (7), 3348-3356 (1999).
  3. Durand, M. L. Bacterial and Fungal Endophthalmitis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (3), 597-613 (2017).
  4. Callegan, M. C., Engelbert, M., Parke, D. W., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Bacterial endophthalmitis: Epidemiology, therapeutics, and bacterium-host interactions. Clinical Microbiology Reviews. 15 (1), 111-124 (2002).
  5. Livingston, E. T., Mursalin, M. H., Callegan, M. C. A Pyrrhic Victory: The PMN Response to Ocular Bacterial Infections. Microorganisms. 7 (11), 537 (2019).
  6. Ramadan, R. T., Moyer, A. L., Callegan, M. C. A role for tumor necrosis factor-alpha in experimental Bacillus cereus endophthalmitis pathogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (10), 4482-4489 (2008).
  7. Davey, R. T., Tauber, W. B. Posttraumatic endophthalmitis: The emerging role of Bacillus cereus infection. Reviews of Infectious Dissease. 9 (1), 110-123 (1987).
  8. Ramappa, M., et al. An outbreak of acute post-cataract surgery Pseudomonas sp. endophthalmitis caused by contaminated hydrophilic intraocular lens solution. Ophthalmology. 119 (3), 564-570 (2012).
  9. Coburn, P. S., et al. Bloodstream-To-Eye Infections Are Facilitated by Outer Blood-Retinal Barrier Dysfunction. PLoS One. 11 (5), 015560 (2016).
  10. Ness, T., Pelz, K., Hansen, L. L. Endogenous endophthalmitis: Microorganisms, disposition and prognosis. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (8), 852-856 (2007).
  11. Novosad, B. D., Callegan, M. C. Severe bacterial endophthalmitis: Towards improving clinical outcomes. Expert Review of Ophthalmology. 5 (5), 689-698 (2010).
  12. Mursalin, M. H., Livingston, E. T., Callegan, M. C. The cereus matter of Bacillus endophthalmitis. Experimental Eye Research. 193, 107959 (2020).
  13. Callegan, M. C., et al. Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infection and Immunity. 71 (6), 3116-3124 (2003).
  14. Beecher, D. J., Pulido, J. S., Barney, N. P., Wong, A. C. Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infection and Immunity. 63 (2), 632-639 (1995).
  15. Callegan, M. C., et al. Contribution of membrane-damaging toxins to Bacillus endophthalmitis pathogenesis. Infection and Immunity. 70 (10), 5381-5389 (2002).
  16. Cowan, C. L. Jr, Madden, W. M., Hatem, G. F., Merritt, J. C. Endogenous Bacillus cereus panophthalmitis. Annals of Ophthalmology. 19 (2), 65-68 (1987).
  17. Callegan, M. C., et al. Virulence factor profiles and antimicrobial susceptibilities of ocular Bacillus isolates. Current Eye Research. 31 (9), 693-702 (2006).
  18. Callegan, M. C., et al. Bacillus endophthalmitis: Roles of bacterial toxins and motility during infection. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3233-3238 (2005).
  19. Mursalin, M. H. Bacillus S-layer-mediated innate interactions during endophthalmitis. Frontiers in Immunology. 11 (215), (2020).
  20. Moyer, A. L., Ramadan, R. T., Novosad, B. D., Astley, R., Callegan, M. C. Bacillus cereus-induced permeability of the blood-ocular barrier during experimental endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3783-3793 (2009).
  21. Callegan, M. C., et al. Efficacy of vitrectomy in improving the outcome of Bacillus cereus endophthalmitis. Retina. 31 (8), 1518-1524 (2011).
  22. David, D. B., Kirkby, G. R., Noble, B. A. Bacillus cereus endophthalmitis. British Journal of Ophthalmology. 78 (7), 577-580 (1994).
  23. Vahey, J. B., Flynn, H. W. Jr Results in the management of Bacillus endophthalmitis. Ophthalmic Surgery. 22 (11), 681-686 (1991).
  24. Wiskur, B. J., Robinson, M. L., Farrand, A. J., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Toward improving therapeutic regimens for Bacillus endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (4), 1480-1487 (2008).
  25. Alfaro, D. V., et al. Experimental Bacillus cereus post-traumatic endophthalmitis and treatment with ciprofloxacin. British Journal of Ophthalmology. 80 (8), 755-758 (1996).
  26. Coburn, P. S., et al. TLR4 modulates inflammatory gene targets in the retina during Bacillus cereus endophthalmitis. BMC Ophthalmology. 18 (1), 96 (2018).
  27. Mursalin, M. H., et al. S-layer Impacts the Virulence of Bacillus in Endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (12), 3727-3739 (2019).
  28. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  29. Parkunan, S. M., et al. CXCL1, but not IL-6, significantly impacts intraocular inflammation during infection. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1125-1134 (2016).
  30. LaGrow, A. L., et al. A Novel Biomimetic Nanosponge Protects the Retina from the Enterococcus faecalis Cytolysin. mSphere. 2 (6), 00335 (2017).
  31. Beecher, D. J., Olsen, T. W., Somers, E. B., Wong, A. C. Evidence for contribution of tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholine-preferring phospholipase C, and collagenase to virulence of Bacillus cereus endophthalmitis. Infection and Immunity. 68 (9), 5269-5276 (2000).
  32. Callegan, M. C., et al. The role of pili in Bacillus cereus intraocular infection. Experimental Eye Research. 159, 69-76 (2017).
  33. Miller, F. C., et al. Targets of immunomodulation in bacterial endophthalmitis. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100763 (2019).
  34. Parkunan, S. M., Astley, R., Callegan, M. C. Role of TLR5 and flagella in Bacillus intraocular infection. PLoS One. 9 (6), 100543 (2014).
  35. Parkunan, S. M., et al. Unexpected roles for Toll-Like receptor 4 and TRIF in intraocular infection with Gram-positive bacteria. Infection and Immunity. 83 (10), 3926-3936 (2015).
  36. Coburn, P. S., et al. Disarming Pore-Forming Toxins with Biomimetic Nanosponges in Intraocular Infections. mSphere. 4 (3), 00262-00319 (2019).
  37. LaGrow, A., et al. Biomimetic nanosponges augment gatifloxacin in reducing retinal damage during experimental MRSA endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (9), 4632 (2019).
  38. Novosad, B. D., Astley, R. A., Callegan, M. C. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 in experimental Bacillus cereus endophthalmitis. PLoS One. 6 (12), 28619 (2011).
  39. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
  40. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution in the mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (3), 1109-1112 (2006).
  41. Beyer, T. L., O'Donnell, F. E., Goncalves, V., Singh, R. Role of the posterior capsule in the prevention of postoperative bacterial endophthalmitis: experimental primate studies and clinical implications. British Journal of Ophthalmology. 69 (11), 841-846 (1985).
  42. Tucker, D. N., Forster, R. K. Experimental bacterial endophthalmitis. Archives of Ophthalmology. 88 (6), 647-649 (1972).
  43. Alfaro, D. V., et al. Experimental pseudomonal posttraumatic endophthalmitis in a swine model. Treatment with ceftazidime, amikacin, and imipenem. Retina. 17 (2), 139-145 (1997).
  44. Silverstein, A. M., Zimmerman, L. E. Immunogenic endophthalmitis produced in the guinea pig by different pathogenetic mechanisms. American Journal of Ophthalmology. 48 (5), 435-447 (1959).
  45. Ravindranath, R. M., Hasan, S. A., Mondino, B. J. Immunopathologic features of Staphylococcus epidermidis-induced endophthalmitis in the rat. Current Eye Research. 16 (10), 1036-1043 (1997).
  46. Kumar, A., Singh, C. N., Glybina, I. V., Mahmoud, T. H., Yu, F. S. Toll-like receptor 2 ligand-induced protection against bacterial endophthalmitis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 255-263 (2010).
  47. Mylonakis, E., et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model. Infection and Immunity. 70 (8), 4678-4681 (2002).
  48. Sanders, M. E., et al. The Streptococcus pneumoniae capsule is required for full virulence in pneumococcal endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 865-872 (2011).
  49. Hunt, J. J., Astley, R., Wheatley, N., Wang, J. T., Callegan, M. C. TLR4 contributes to the host response to Klebsiella intraocular infection. Current Eye Research. 39 (8), 790-802 (2014).

Tags

Immunologie en infectie probleem 168 bacteriële ooginfectie intraoculaire bacteriële kwantificering oculaire infectieparameters intravitreale injectie intraoculaire injectie endoftalmitis
Intravitreale injectie en kwantificering van infectieparameters in een muismodel van bacteriële endoftalmitis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mursalin, M. H., Livingston, E.,… More

Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter