Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Intravitreal injektion och kvantisering av infektionsparametrar i en mus modell av bakteriell endoftalmit

Published: February 6, 2021 doi: 10.3791/61749
Automatic Translation
*1,2, *1, 2,3, 4, 2,3, 1,2,3
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver här en metod för intravitreal injektion och efterföljande bakteriell kvantifiering i mus modell av bakteriell endophthalmitis. Detta protokoll kan utökas för mätning av värd immunsvar och bakterie- och värdgenuttryck.

Abstract

Intraokulära bakterieinfektioner är en fara för synen. Forskare använder djurmodeller för att undersöka värd- och bakteriefaktorer och immunsvarsvägar i samband med infektion för att identifiera livskraftiga terapeutiska mål och för att testa läkemedel för att förhindra blindhet. Den intravitreal injektion tekniken används för att injicera organismer, droger, eller andra ämnen direkt i glaskroppen hålighet i det bakre segmentet av ögat. Här visade vi denna injektion teknik för att inleda infektion i mus öga och tekniken för kvantifiera intraokulära bakterier. Bacillus cereus odlades i hjärnan hjärta infusion flytande media för 18 timmar och resuspended till en koncentration 100 koloni bildar enheter (CFU)/0.5 μL. En C57BL/6J mus var sövda med hjälp av en kombination av ketamin och xylazine. Med hjälp av en picoliter mikroinjektor och glas kapillär nålar, 0,5 μL av Bacillus suspensionen injicerades i mitten glaskroppen av musögat. Det kontralaterala kontrollögat injicerades antingen med sterila medier (kirurgisk kontroll) eller injicerades inte (absolut kontroll). Vid 10 timmar efter infektion, möss avlivades, och ögon skördades med sterila kirurgiska pincett och placeras i ett rör som innehåller 400 μL steril PBS och 1 mm sterila glaspärlor. För ELISAs eller myeloperoxidasanalyser tillsattes proteinashämmare i rören. För RNA-extraktion lades lämplig lysbuffert till. Ögon var homogeniserade i en vävnad homogenisator för 1-2 minuter. Homogenates var serieutspädd 10-faldig i PBS och spår utspädd på agar plattor. Återstoden av homogenatesna lagrades på -80 °C för extra assays. Plattor inkuberades i 24 timmar och CFU per öga kvantifierades. Dessa tekniker resulterar i reproducerbara infektioner i musögon och underlättar kvantisering av livskraftiga bakterier, värden immunsvar, och omics av värd och bakteriell genuttryck.

Introduction

Bakteriell endoftalmit är en förödande infektion som orsakar inflammation, och, om den inte behandlas på rätt sätt, kan resultera i förlust av syn eller blindhet. Endoftalmitis resultat från inträde av bakterier i det inre av ögat1,2,3,4,5. En gång i ögat, bakterier replikera, producera toxiner och andra skadliga faktorer, och kan orsaka irreversibla skador på känsliga näthinnans celler och vävnader. Okulära skador kan också orsakas av inflammation, på grund av aktivering av inflammatoriska vägar som leder till inflammatoriska celler tillströmning i det inre av ögat1,5,6. Endoftalmit kan uppstå efter intraokulär kirurgi (postoperativ), en genomträngande skada på ögat (posttraumatiskt), eller från metastaserande spridning av bakterier in i ögat från en annan anatomisk plats (endogen)7,8,9,10. Behandlingar för bakteriell endoftalmit inkluderar antibiotika, antiinflammatoriska läkemedel, eller kirurgiskt ingrepp3,4,11. Även med dessa behandlingar, syn eller ögat i sig kan gå förlorade. Den visuella prognosen efter bakteriell endoftalmit varierar i allmänhet beroende på behandlingseffektiviteten, synskärpan vid presentationen och den infekterande organismens virulens.

Bacillus cereus (B. cereus) är en av de stora bakteriella patogener som orsakar posttraumatisk endoftalmit7,12. En majoritet av B. cereus endoftalmitis fall har en snabb kurs, vilket kan resultera i blindhet inom några dagar. Kännetecknen för B. cereus endophthalmitis inkluderar snabbt utvecklas intraokulära inflammation, ögonsmärta, snabb förlust av synskärpa, och feber. B. cereus växer snabbt i ögat jämfört med andra bakterier som vanligen orsakarögoninfektioner 2,4,12 och besitter många virulensfaktorer. Därför fönstret för framgångsrik terapeutisk intervention är relativt kort1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Behandlingar för denna infektion är oftast framgångsrika vid behandling av endoftalmit orsakas av andra mindre virulent patogener, men B. cereus endophthalmitis vanligen resulterar i större än 70% av patienter som lider av betydande synförlust. Omkring 50% av dessa patienter genomgår urtagning eller enucleation av det infekterade ögat7,16,22,23. Den destruktiva och snabba karaktär B. cereus endoftalmitis kräver omedelbar och korrekt behandling. De senaste framstegen när det gäller att urskilja de underliggande mekanismerna för sjukdomsutveckling har identifierat potentiella mål för intervention19,26,27. Experimentell mus modeller av B. cereus endoftalmitis fortsätta att vara användbara i att urskilja mekanismerna för infektion och testa potentiella therapeutics som kan förhindra synförlust.

Experimentell intraokulär infektion av möss med B. cereus har varit en instrumental modell för att förstå bakterie- och värdfaktorer, liksom deras interaktioner, under endoftalmitis28. Denna modell härmar en posttraumatisk eller postoperativ händelse, där bakterier införs i ögat under en skada. Denna modell är mycket reproducerbar och har varit användbar för att testa experimentella terapier och tillhandahålla data för förbättringar i standard av vård1,6,19,29,30. Liksom många andra infektionsmodeller möjliggör denna modell oberoende kontroll av många parametrar för infektion och möjliggör effektiv och reproducerbar undersökning av infektionsutfall. Studier i en liknande modell i kaniner under de senaste decennierna har undersökt effekterna av B. cereus virulens faktorer i ögat2,4,13,14,31. Genom att injicera B. cereus mutantstammar som saknar individuella eller flera virulensfaktorer kan dessa virulensfaktorers bidrag till sjukdomsgradens svårighetsgrad mätas genom utfall som koncentrationen av bakterier vid olika timmar efterinfektion eller förlusten av synfunktionen13,14,27,31,32. Dessutom har värdfaktorer undersökts i denna modell genom att infektera knockout mus stammar saknar specifika inflammatoriska värd faktorer26,29,33,34,35. Modellen är också användbar för att testa potentiella behandlingar för denna sjukdom genom att injicera nya föreningar i ögat efter infektion30,36. I detta manuskript beskriver vi ett utförligt protokoll som inkluderar infekterar en mus öga med B. cereus, skörd ögat efter infektion, kvantifiera intraokulära bakteriell belastning och bevara exemplar för att assay ytterligare parametrar för sjukdomens allvarlighetsgrad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden utfördes efter rekommendationerna i handledningen för vård och användning av försöksdjur och Föreningen för forskning i syn och oftalmologi uttalande för användning av djur i oftalmisk och vision forskning. Protokollen godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Oklahoma Health Sciences Center (protokollnummer 15-103, 18-043 och 18-087).

1. Sterila glasnålar

  1. Slå på nålpipettdragaren.
  2. Justera Heater-vredet tills displayen visar 12.6.
  3. Öppna luckan och mata manuellt 5 μL kapillärröret genom den övre klämman och värmarens glödtråd tills hälften av slangen sträcker sig under glödtråden (Bild 1A).
  4. Bekräfta att kapillärröret ligger i "V"-spåret i den övre klämman. Dra åt den övre klämman.
  5. Med den nedre klämman öppen justerar du manuellt den vertikala glidningen uppåt tills den nedre klämman når sin övre gräns. Bekräfta att röret är i "V"-spåret i den nedre klämman. Dra åt den nedre klämman.
  6. Stäng luckan och bekräfta att 'Klar' lampan är tänd. Tryck på Startknappen för att initiera värmaren och dragsekvensen (Bild 1B).
  7. Se till att värmaren stängs av automatiskt efter att värme och gravitation drar isär kapillärröret (Bild 1C), och glidningen rör sig nedåt.
  8. Öppna dörren. Medan du håller toppen av kapillärröret, dra inte åt den övre klämman. Ta bort det övre kapillärröret och ställ det åt sidan.
  9. Håll kapillärröret i bottensglaset och dra av den undre klämman. Ta bort det nedre kapillärröret och ställ det åt sidan.
  10. Använd en mikroelektrodfaser med en 0,05 μm aluminiumoxid slipplatta för att avfasa det dragna kapillärröret för att skapa injektionsnålarna.
  11. Pipettera tillräckligt med vatten på slipplattan för att täcka ytan (Bild 1D).
  12. Slå På avfasningen så att den börjar rotera i 60 varv/min. Placera det dragna kapillärröret i pipettklämman i "V"-spåret. Dra åt klämman och justera pipettklämmans vinkel till 30°.
  13. Justera spetsen på den spetsiga kanten på kapillärröret ungefär två tredjedelars avstånd från mitten av rotationsplattan.
  14. Sänk fast det fastklämda kapillärröret genom att justera grovstyrningsratten upptill på manipulatorn. Fortsätt att sänka kapillärröret tills spetsen på kapillärröret sträcker sig under vattenytan och kontaktar slipplattans slipande yta.
  15. Övervaka avfasningsframsteget med hjälp av mikroskopet som sitter på avfasningsfasen. Efter 5 min, justera finkontrollen för att höja glasnålen från slipplattan.
  16. Ta bort glasnålen och placera den under 10x förstoring för att kontrollera toppen på kapillärröret (Bild 1E,F).
  17. För att säkerställa att det inte finns några blockeringar, för in glasnålen i en pipetthållare på en spruta och tryck in luft i ett 1 mL-rör med 99% etanol. Om det bildas luftbubblor vid nålspetsen har nålen inga blockeringar och kan användas för mikroinjektion. Denna process säkerställer också steriliteten hos glasnålarna.
  18. Ett kapillärrör kan rymma upp till 5 μL-vätska. Markera kapillärröret i 10 sektioner för att beräkna avstånden på nålen för att markera för 0,5 μL-volymer. Markera en skala med det avståndet som rymmer 0,5 μL för framtida beredning. För en 5 μL nål motsvarar avstånden på 0,7 mm från varandra 0,5 μL (Figur 1G).

2. Bacillus cereus kultur

  1. Utför alla procedurer i detta avsnitt under Biosäkerhetsnivå 2-förhållanden.
  2. Streck frys lager av B. cereus ATCC 14579 för enkelkoloni isolering på en 5% får blod agar tallrik och inkubera över natten vid 37 °C (Figur 2A).
  3. Pipett 5 mL steril Brain Heart Infusion (BHI) buljong till en 10 mL steril snap-cap röret (Figur 2B). Med hjälp av en steril slinga eller nål, plocka en enda koloni av B. cereus ATCC 14579 från agarplattan och inokulera vätskan BHI.
  4. Vortexa provet kort. Placera snaplockröret i en roterande inkubator. Ställ in temperaturen på 37 °C och hastigheten vid 200 varv/min. Efter 18 h, ta bort kulturen från inkubatorn (Figur 2B).

3. Bakteriell utspädning för intravitreal injektion

  1. Utför alla procedurer i detta avsnitt under Biosäkerhetsnivå 2-förhållanden.
  2. Beräkna volymen av den över natten B. cereus kultur att lägga till 10 mL av färska BHI att uppnå 200 koloni bildar enheter per mikroliter (CFU/μL). Till exempel replikerar en övernattningskultur av B. cereus i BHI till cirka 2 x 108 CFU/mL, som sedan kan spädas ut till 200 CFU/μL genom pipettering av 10 μL av över natten kultur i 10 mL färska BHI.
  3. Pipett 1 mL av den nyspädda kulturen till ett 1,5 mL mikrocentrifugrör. Bibehåll detta rör på is till intravitreal injektion. Utför den intravitreala injektionen inom 60 min av att späda bakteriekulturen.

4. Mus intravitreal injektion

  1. Utför alla procedurer i detta avsnitt under Biosäkerhetsnivå 2-förhållanden.
  2. Förbered proceduren plats genom att placera medicinska underpadar på operationsbordet.
  3. Slå På mikroinjektorn och öppna gasventilen på tryckluftstanken som sitter fast på mikroinjektorn. Justera tankregulatorn tills gasleveransen är cirka 60 psi.
  4. På mikroinjektorn trycker du på Läge tills skärmen visar Balans. Tryck på Balance och placera datormusen på operationsbordet. Anslut pipetthållaren i rostfritt stål till slangarna som är fäst vid 'Fill/Output' på spridaren. Detta rör är alltid anslutet till injektorn.
  5. Sätt i kapillärnålen i pipetthållarens andra ände genom att skruva åtsittande pipetthållarens kontakt runt nålen.
  6. Slå på oftalmmik mikroskop och slå på dess ljus till en intensitet på 50%. Justera mikroskopet över proceduren plats på operationsbordet och justera mikroskopet till önskad fokus.
  7. Innan proceduren börjar, bekräfta att musen är tillräckligt sövd genom att testa reflexen för pedaluttag. Var noga med att följa ditt IACUC-godkända protokoll för anestesi.
  8. Placera den sövda musen på de medicinska underpadarna med näsan riktad till höger och lutad på vänster sida.
  9. Titta på musens högra öga genom det oftalmiska mikroskopet och öppna locken genom att öppna tången hos en omvända verkan-tång på vardera sidan av ögat för att exponera injektionsstället (Figur 3C).
  10. Fyll på kapillärnålen med 200 CFU/μL-utspädningen genom att vänster klicka på musmattan som är ansluten till mikroinjektorn (Figur 3D).
  11. Säkra djurets huvud med vänster hand och placera nålspetsen vid ögats limbus. Med nålen i avfasning upp läge och i 45° vinkel, punktera musögat, men se till att endast den skarpa spetsen på nålen (~0,5 mm) sätts in vid injicering.
  12. När nålspetsen har satts in, för vänster hand från mushuvudet till musmattan och högerklickar på musmattan för att injicera 0,5 μL av B. cereus-utspädningen. För att förhindra läckage, lämna nålspetsen inne i musögat 2-3 sekunder innan du tar bort (Bild 3E)1,19,26,27,32,34,36,37,38.
  13. Släpp tlyset och placera musen i en bur som sitter på en värmande pad. Övervaka dessa möss tills de har återhämtat sig från anestesi (Figur 3F).
  14. När möss har återhämtat sig från anestesin, returnera buren till sin rätta rack. Om mössen kommer att utsättas för retinal funktionsanalys genom elektroretinografi, bör burar återföras till ett mörkt rum för korrekt mörk anpassning.

5. Beredning av knölar för skörd

  1. Placera 1 mm sterila glaspärlor i 1,5 mL skruvlocksrör.
  2. Sterilisera dessa rör i en autoklav på en torr inställning. Låt rören svalna till rumstemperatur före användning.
  3. Tillsätt 10 mL 1x steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till ett sterilt 15 mL centrifugrör.
  4. Tillsätt 1 tablett proteashämmare cocktail tablett i röret. Blanda genom att vortexa19,27,29,34,35.
  5. Pipett 400 μL av 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller proteashämmare i varje autoklaverat skörderör. Märk rören och lägg på is. (Figur 4A).

6. Skörda ögonen

  1. Utför alla procedurer i detta avsnitt under Biosäkerhetsnivå 2-förhållanden.
  2. Avliva musen genom CO2 inandning. Använd en sekundär metod för att bekräfta dödshjälp.
  3. Håll avlivade mus huvudet säkert och öppna den fina spets tåtan på vardera sidan av den infekterade ögat. Tryck ner mot huvudet för att propta ögat. När tången är bakom ögongloben, pressa ihop tången. Dra bort tycper från huvudet för att lösgöra ögongloben (Bild 4B).
  4. Placera omedelbart ögongloben i ett märkt skörderör. Placera rör på is i högst 60 min (Bild 4C).

7. Intraokulärt bakterieantal

  1. Utför alla procedurer i detta avsnitt under Biosäkerhetsnivå 2-förhållanden.
  2. Bekräfta att alla skörderör är tätt slutna och är balanserade medan de är i vävnads homogenisatorn (bild 5A). Sätt på vävnadshomogenatorn i 1 min för att homogenisera proverna. Vänta i 30 s, slå sedan på i ytterligare en minut. Placera rör på is (Bild 5B,C).
  3. Seriellt späd varje prov 10-faldigt genom att sekventiellt överföra 20 μL av homogenatet till 180 μL steril 1x PBS. Späd tills en faktor på 10-7 uppnåtts (Figur 5D).
  4. Märk varje rad av en varm, fyrkantig BHI-platta med rätt utspädningsfaktorer. Överför 10 μL av varje spädning i rad till den översta BHI-plattan som lutas cirka 45°. Låt provet rinna tills det nästan når botten av plattan, lägg sedan plattan platt (Bild 5E)39.
  5. När prov tas upp i BHI-agarn, överför du plattan till en 37 °C-inkubator. Kolonier ska börja synas 8 h efter att ha placerats i inkubatorn.
  6. Ta bort plattan från inkubatorn innan B. cereuskoloniernas tillväxt stör identifierande enskilda kolonier (Figur 5F).
  7. För en exakt återgivning av koncentrationen i provet, räkna den rad som har mellan 10-100 kolonier. Till exempel kommer en rad med utspädningsfraktionen på 10-4 som har 45 kolonier att ha en koncentration på 4,5 x 105 CFU/mL.
  8. För att beräkna det totala antalet bakterier per öga multiplicerar du koncentrationen med 0, 4, vilket representerar millilitervolymen på 1x PBS som används för att homogenisera ögat. Till exempel skulle 4,5 x 105 CFU/mL-koncentrationen översätta till 1,8 x 105 CFU B. cereus per öga.

8. Bevarande av prover

  1. Placera homogena prover i en etikettad fryslåda och placera denna låda i en frys -80 °C. Dessa prover kan användas senare för inflammatorisk mediator analys av ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generera en reproducerbar inokulat och noggrannhet av intravitreal injektion förfarandet är viktiga steg i utvecklingen av modeller av mikrobiell endoftalmit. Här, Vi visat den intravitreal injektion förfarande med gram-positiva Bacillus cereus. Vi injicerade 100 CFU/0,5 μL av B. cereus i mitten av glaskroppen av fem C57BL6-möss. Efter 10 h postinfection observerade vi intraokulära tillväxt av B. cereus till cirka 1,8 x 105 CFU/eye. Figur 1 visar byggandet av glasnålar för att leverera bakterierna i musens midvitreous. Bacillus cereus växer på en blodagarplatta och i odlingsrör visas i figur 2. Bild 3 visar musen intravitreal injektion förfarande med hjälp av en luft trycksatt injektion system. Figur 4 demonstrerar processen att skörda de infekterade ögonen efter den önskade tiden efterinfektion. Bild 5 visar tekniken för att homogenisera de infekterade ögonen. Bild 6 visar de intraokulära bakteriestammarna från fem olika mus ögon vid 10 h postinfection. Figur 7 skildrar det övergripande förfarandet och en grafisk representation av en mus intravitreal injektion.

Figure 1
Bild 1: Att tillverka avfasade glasnålar. Glas nålar gjordes från disponibel mikrokapillär pipetter med hjälp av en nål / pipett puller och en micropipette avfasningsspelare. (A) Fastklämd kapillärrör i nålen/pipettdragaren. (B,C) Skapande av glasnålar med hjälp av önskad spänning. (D) Avfasning av glaset mikropipetter. (E,F) Mikropipettes av glas före och efter avfasning. (E) Skalning av glasnålarna. Mellanslag mellan två svarta punkter rymmer 0,5 μL. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Bacillus cereus ATCC 14579. (A) Bacillus cereus växer på en blod agar platta. Enskilda kolonier av B. cereus visar typiskt tydliga zoner av hemolys på en blodagarplatta. (B) Turbid övernattning kulturer av B. cereus. (C) Gram-färgning av B. cereus. B. cereus är Gram-positiva stavformade bakterier. (D) Elektronmikrograf av Bacillus cereus. Denna elektron mikrograf visar stav formade Bacillus cereus med hår som strukturer som kallas flagella. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: Mus intravitreal injektion. Injektionsproceduren utförs med hjälp av en trycksatt luftinjektor med visning av operationsfältet med hjälp av ett kommersiellt mikroskop (A) ketamin och xylazin läkemedel för att söva musen. (B) Administrering av ketamin och xylazin genom intraperitoneal injektion för att söva musen. (C) Clamping periokulär hud tillbaka till proptose ögat. (D) Fylla på nålarna med bakterier med hjälp av lufttryckssprutaren. (E) Intravitreal injektion. (F) Övervakning infekterad mus efter anestesi. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Skörd mus infekterade öga. Post-infektion, efter önskad tidpunkt, skörd infekterade musögon med hjälp av steril pincett. (A) PBS som innehåller sterila glaspärlor. (B) Skörd av det infekterade ögat. (C) Skörderör som innehåller ett musöga. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Bearbetning av det skördade ögat för intraokulärt bakterieantal. (A) Harvest röret med infekterade ögat fastklämda tätt till en vävnad homogenisator. (B) Infekterade ögon var homogeniserade två gånger i 1 min vardera. Spårutspädning (D) av ögat homogenates (C) och efterföljande bordläggning (E) för den bakteriella kvanttifieringen. (E) Representativ individ Bacillus cereus koloni efter spår utspädning. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Intraokulära bakterieantal vid 10 h postininfektion. M, musnummer. CFU, kolonibildande enheter. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 7
Bild 7: Musk intravitreal injektion. (A) Övergripande flödesschema av musen intravitreal injektion förfarande. (B) Grafisk presentation av den intravitreala injektionen. Under förfarandet sätts sterila, avfasade glasnålar som innehåller en kultur av B. cereus in i musens midvitreous, och B. cereus levereras med hjälp av ett lufttrycksbetryckt mikroinjektionssystem. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även med tillgången på potenta antibiotika, antiinflammatoriska läkemedel, och vitrectomy kirurgi, kan bakteriell endoftalmit blind en patient. Kliniska studier har varit användbara i att studera endophthalmitis; emellertid, experimentella modeller av endophthalmitis ge snabb och reproducerbara resultat som kan översättas till framsteg i standard av vård, vilket resulterar i bättre visuella resultatet för patienter.

Musögats glaskroppsvolym är cirka 7 μL40. Denna lilla volym gör det bara möjligt att injicera en begränsad mängd material. Större volymer än 1,0 μL bör inte injiceras för att undvika okulära skador. Processen kräver särskild utrustning och praxis av tekniker för att säkerställa reproducerbarhet och noggrannhet. Endoftalmit har studerats på primater, svin, kaniner, råttor, marsvin och imusen 28,41,42,43,44,45. Bland de större arterna är ögonen mycket närmare i storlek till mänskliga ögon, och intravitreala injektioner i större ögon kan utföras utan specialutrustning. Med undantag för musen, avsaknad av knockout stammar och reagenser för att studera värd immunsvar i andra djurmodeller begränsar deras användbarhet i experimentell endoftalmit.

Endoftalmit förekommer oftast som en komplikation av katarakt kirurgi. Denna infektion kan också uppstå efter genomträngande okulär trauma eller systemisk infektion. Det visuella resultatet i denna sjukdom beror delvis på den infekterande patogenens virulens. Hos möss beror visuellt resultat också på deras immunstatus. Förståelsen av mekanismerna för sjukdomspatogenes har underlättats genom att studera sjukdomen i experimentella djurmodeller28. Protokollet för mus intravitreal injektion och kvantifiering av infektionsparametrar kan anpassas för att studera endoftalmit som inletts med nästan alla typer av bakterie- eller svamppatogener28. Vidare kan detta protokoll också tillämpas och modifieras för att studera anatomiska förändringar, inflammatoriska processer, och genuttrycksprofiler av både bakterier och värd under infektion.

Mus intravitreal injektion och efterföljande analys av infektionsparametrar består av flera kritiska steg (Figur 7). Glasnålen måste vara exakt skapad, markerad och steriliserad. Den skarpa änden av avfasade glas nål och korrekt skalning avgör tillräcklig leverans av bakterier och jordglob punktering. Om änden av nålen är kort och inte är lämpligt avfasad, kan det skapa ett stort hål på jorden som kan orsaka läckage, kontaminering av världen, och en felaktig sjukdom resultat. Därför rekommenderas att observera glaset mikropipetter medan avfasning under 10x optisk zoom av ett starkt fält mikroskop. För att säkerställa leverans av rätt mängd bakterier, bör spädningar beräknas i förväg, och rätt volymskala bör märkas på glasnålen. Parametrar för nåldragning och avfasning med hjälp av andra typer av utrustning kan variera.

Den beskrivna intravitreal injektionstekniken utnyttjar ett lufttrycksbetryckt mikroinjektorsystem för korrekt leverans av bakterierna i musögat1. Lämplig användning av denna mikroinjektor är avgörande för de reproducerbara infektionsparametrarna. Eftersom lufttrycket bestämmer leveranshastigheten, kan överdriven kraft snabbt injicera en större volym i ögonen, vilket orsakar överdrivet intraokulärt tryck och /eller jordglobsbristning. Därför är rekommendationen att använda ett tryck på 10-13 psi för att fylla och injicera under förfarandet. En annan potentiell fråga är läckage av bakterielösningen från glasnålarna efter påfyllning. Läckage kan leda till att felaktiga volymer in i musögonen kan insprutas. Kontrollera alltid anslutningar mellan injektionssystemet, slangar, och glasnålar före injektioner.

Injicera exakta mängder av bakterier är avgörande för reproducerbarhet av experimentell bakteriell endoftalmit. Olika experimentella endoftalmitmodeller kräver inokulering av specifika antal bakterier12,28,46,47,48,49. För B. cereus endoftalmit behövs injicera 100 CFU för att initiera en reproducerbar infektion1. Eftersom bakterietillväxt beror på tillväxtmedium och villkor, tillväxt miljö, media, och utspädningar måste upprepas varje gång. Därför rekommenderas att man testar odlingsförhållandena före försöket för att återge det exakta inokulatet i lämplig volym för injektion. Som konstaterats ovan är den övre gränsen för intravitreal injektion i musögon 1,0 μL28. En alltför hög volym höjer det intraokulära trycket vilket kan resultera i glaukom, lossa näthinnan från det bakre segmentet, eller brista i globen. Intravitreal injektion och den resulterande infektionen i möss får inte perfekt efterlikna B. cereus endoftalmitis i en människa. De flesta djurmodeller av sjukdomar hos människor är begränsade på detta sätt. Kända mängder av B. cereus injiceras i ögat efter tillväxt i näringsrika medier. För kliniska fall av B. cereus endoftalmitis är de smittande mängderna inte kända och kontamineringskällorna varierar. Men fördelarna med att använda karakteriserade organismer och musstammar och generera reproducerbara infektionskurser uppväger dessa begränsningar.

Korrekt skörd av infekterade ögon är ett annat kritiskt steg. Att upprätthålla aseptiska förhållanden är avgörande för att undvika all korskontaminering som skulle kunna störa tolkningen av uppgifterna. Därför är rekommendationen att desinficera arbetsbänken och alla instrument med 70% etanol före skörd. Bakterietalen ökar snabbt inne i glaskroppsmiljön under infektion, vilket kan orsaka svullnad i ögat. Därför bör man se till att försiktigt avlägsna ögat under skörden förhindra att klotet brister. Vidare måste locket på det skörderör som innehåller det infekterade ögat dras åt tillräckligt innan röret placeras i vävnadshomogenator. En lös mössa kommer att resultera i läckage och kontaminering av vävnaden homogenisator leder till felaktig kvantifiering av bakterier i de läckande rören. Ögonhomogeniseringsproceduren höjer också temperaturer på rören. Därför rekommenderas att homogenisera 1 minut i taget. Förhöjda temperaturer kan påverka kvantifieringen av vissa infektionsparametrar. Även om denna metod inte ger antalet bakterier inom specifika platser i ögat, i kombination med histologiska metoder, kan vi uppskatta var bakterier kan lokaliseras. Lokalisering av B. cereus i ögat under endophthalmitis har rapporterats i kaniner, vars ögon är större och lättare dissekeras i subcompartments. 2

Intravitreal injektion härmar leverans av organismer till det bakre segmentet av ögat, som initierar infektion. Detta inledande steg underlättar den kvalitativa och kvantitativa studien av infektionsparametrar i en mycket reproducerbar musmodell av experimentell endoftalmit. Dessa modeller används också för att uppskatta okulär inflammation genom att kvantifiera myeloperoxidas i infiltrera neutrofiler, identifiera specifika celltyper genom flödescytometri, kvantifiera cytokiner och kemokiner genom realtid PCR och/eller ELISA, och observera okulär arkitektur genom histopatologi1,6,19,20,26,27,34,35,38. Infekterade musögon skördas med olika spädningsvätska beroende på vilken typ av infektionsparametrar som ska mätas. För analys av genuttryck krävs en annan lysbuffert26. För histopatologisk undersökning placeras skördade ögon i en fixativ lösning. De många genetiska knockoutmössen underlättar också studiens roll för olika immunfaktorer och celler. Intravitreal injektion är därför en stöttepelare teknik för forskare inom området för intraokulära infektioner och therapeutics.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga ekonomiska konflikter att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar Dr Feng Li och Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) för deras hjälp. Vår forskning har fått stöd av National Institutes of Health bidrag R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947, och R01EY024140. Vår forskning har också stöttats av P30EY21725 (NIH CORE-anslag för Live Animal Imaging and Analysis, Molekylärbiologi och Cellulär avbildning). Vår forskning har också fått stöd av NEI Vision Science Pre-doctoral Trainee program 5T32EY023202, en Presbyterian Health Foundation Research Support bidrag, och ett obegränsat bidrag till Dean A. McGee Eye Institute från forskning för att förhindra blindhet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Pathogenesis of gram-positive bacterial endophthalmitis. Infection and Immunity. 67 (7), 3348-3356 (1999).
  3. Durand, M. L. Bacterial and Fungal Endophthalmitis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (3), 597-613 (2017).
  4. Callegan, M. C., Engelbert, M., Parke, D. W., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Bacterial endophthalmitis: Epidemiology, therapeutics, and bacterium-host interactions. Clinical Microbiology Reviews. 15 (1), 111-124 (2002).
  5. Livingston, E. T., Mursalin, M. H., Callegan, M. C. A Pyrrhic Victory: The PMN Response to Ocular Bacterial Infections. Microorganisms. 7 (11), 537 (2019).
  6. Ramadan, R. T., Moyer, A. L., Callegan, M. C. A role for tumor necrosis factor-alpha in experimental Bacillus cereus endophthalmitis pathogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (10), 4482-4489 (2008).
  7. Davey, R. T., Tauber, W. B. Posttraumatic endophthalmitis: The emerging role of Bacillus cereus infection. Reviews of Infectious Dissease. 9 (1), 110-123 (1987).
  8. Ramappa, M., et al. An outbreak of acute post-cataract surgery Pseudomonas sp. endophthalmitis caused by contaminated hydrophilic intraocular lens solution. Ophthalmology. 119 (3), 564-570 (2012).
  9. Coburn, P. S., et al. Bloodstream-To-Eye Infections Are Facilitated by Outer Blood-Retinal Barrier Dysfunction. PLoS One. 11 (5), 015560 (2016).
  10. Ness, T., Pelz, K., Hansen, L. L. Endogenous endophthalmitis: Microorganisms, disposition and prognosis. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (8), 852-856 (2007).
  11. Novosad, B. D., Callegan, M. C. Severe bacterial endophthalmitis: Towards improving clinical outcomes. Expert Review of Ophthalmology. 5 (5), 689-698 (2010).
  12. Mursalin, M. H., Livingston, E. T., Callegan, M. C. The cereus matter of Bacillus endophthalmitis. Experimental Eye Research. 193, 107959 (2020).
  13. Callegan, M. C., et al. Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infection and Immunity. 71 (6), 3116-3124 (2003).
  14. Beecher, D. J., Pulido, J. S., Barney, N. P., Wong, A. C. Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infection and Immunity. 63 (2), 632-639 (1995).
  15. Callegan, M. C., et al. Contribution of membrane-damaging toxins to Bacillus endophthalmitis pathogenesis. Infection and Immunity. 70 (10), 5381-5389 (2002).
  16. Cowan, C. L. Jr, Madden, W. M., Hatem, G. F., Merritt, J. C. Endogenous Bacillus cereus panophthalmitis. Annals of Ophthalmology. 19 (2), 65-68 (1987).
  17. Callegan, M. C., et al. Virulence factor profiles and antimicrobial susceptibilities of ocular Bacillus isolates. Current Eye Research. 31 (9), 693-702 (2006).
  18. Callegan, M. C., et al. Bacillus endophthalmitis: Roles of bacterial toxins and motility during infection. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3233-3238 (2005).
  19. Mursalin, M. H. Bacillus S-layer-mediated innate interactions during endophthalmitis. Frontiers in Immunology. 11 (215), (2020).
  20. Moyer, A. L., Ramadan, R. T., Novosad, B. D., Astley, R., Callegan, M. C. Bacillus cereus-induced permeability of the blood-ocular barrier during experimental endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3783-3793 (2009).
  21. Callegan, M. C., et al. Efficacy of vitrectomy in improving the outcome of Bacillus cereus endophthalmitis. Retina. 31 (8), 1518-1524 (2011).
  22. David, D. B., Kirkby, G. R., Noble, B. A. Bacillus cereus endophthalmitis. British Journal of Ophthalmology. 78 (7), 577-580 (1994).
  23. Vahey, J. B., Flynn, H. W. Jr Results in the management of Bacillus endophthalmitis. Ophthalmic Surgery. 22 (11), 681-686 (1991).
  24. Wiskur, B. J., Robinson, M. L., Farrand, A. J., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Toward improving therapeutic regimens for Bacillus endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (4), 1480-1487 (2008).
  25. Alfaro, D. V., et al. Experimental Bacillus cereus post-traumatic endophthalmitis and treatment with ciprofloxacin. British Journal of Ophthalmology. 80 (8), 755-758 (1996).
  26. Coburn, P. S., et al. TLR4 modulates inflammatory gene targets in the retina during Bacillus cereus endophthalmitis. BMC Ophthalmology. 18 (1), 96 (2018).
  27. Mursalin, M. H., et al. S-layer Impacts the Virulence of Bacillus in Endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (12), 3727-3739 (2019).
  28. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  29. Parkunan, S. M., et al. CXCL1, but not IL-6, significantly impacts intraocular inflammation during infection. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1125-1134 (2016).
  30. LaGrow, A. L., et al. A Novel Biomimetic Nanosponge Protects the Retina from the Enterococcus faecalis Cytolysin. mSphere. 2 (6), 00335 (2017).
  31. Beecher, D. J., Olsen, T. W., Somers, E. B., Wong, A. C. Evidence for contribution of tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholine-preferring phospholipase C, and collagenase to virulence of Bacillus cereus endophthalmitis. Infection and Immunity. 68 (9), 5269-5276 (2000).
  32. Callegan, M. C., et al. The role of pili in Bacillus cereus intraocular infection. Experimental Eye Research. 159, 69-76 (2017).
  33. Miller, F. C., et al. Targets of immunomodulation in bacterial endophthalmitis. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100763 (2019).
  34. Parkunan, S. M., Astley, R., Callegan, M. C. Role of TLR5 and flagella in Bacillus intraocular infection. PLoS One. 9 (6), 100543 (2014).
  35. Parkunan, S. M., et al. Unexpected roles for Toll-Like receptor 4 and TRIF in intraocular infection with Gram-positive bacteria. Infection and Immunity. 83 (10), 3926-3936 (2015).
  36. Coburn, P. S., et al. Disarming Pore-Forming Toxins with Biomimetic Nanosponges in Intraocular Infections. mSphere. 4 (3), 00262-00319 (2019).
  37. LaGrow, A., et al. Biomimetic nanosponges augment gatifloxacin in reducing retinal damage during experimental MRSA endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (9), 4632 (2019).
  38. Novosad, B. D., Astley, R. A., Callegan, M. C. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 in experimental Bacillus cereus endophthalmitis. PLoS One. 6 (12), 28619 (2011).
  39. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
  40. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution in the mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (3), 1109-1112 (2006).
  41. Beyer, T. L., O'Donnell, F. E., Goncalves, V., Singh, R. Role of the posterior capsule in the prevention of postoperative bacterial endophthalmitis: experimental primate studies and clinical implications. British Journal of Ophthalmology. 69 (11), 841-846 (1985).
  42. Tucker, D. N., Forster, R. K. Experimental bacterial endophthalmitis. Archives of Ophthalmology. 88 (6), 647-649 (1972).
  43. Alfaro, D. V., et al. Experimental pseudomonal posttraumatic endophthalmitis in a swine model. Treatment with ceftazidime, amikacin, and imipenem. Retina. 17 (2), 139-145 (1997).
  44. Silverstein, A. M., Zimmerman, L. E. Immunogenic endophthalmitis produced in the guinea pig by different pathogenetic mechanisms. American Journal of Ophthalmology. 48 (5), 435-447 (1959).
  45. Ravindranath, R. M., Hasan, S. A., Mondino, B. J. Immunopathologic features of Staphylococcus epidermidis-induced endophthalmitis in the rat. Current Eye Research. 16 (10), 1036-1043 (1997).
  46. Kumar, A., Singh, C. N., Glybina, I. V., Mahmoud, T. H., Yu, F. S. Toll-like receptor 2 ligand-induced protection against bacterial endophthalmitis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 255-263 (2010).
  47. Mylonakis, E., et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model. Infection and Immunity. 70 (8), 4678-4681 (2002).
  48. Sanders, M. E., et al. The Streptococcus pneumoniae capsule is required for full virulence in pneumococcal endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 865-872 (2011).
  49. Hunt, J. J., Astley, R., Wheatley, N., Wang, J. T., Callegan, M. C. TLR4 contributes to the host response to Klebsiella intraocular infection. Current Eye Research. 39 (8), 790-802 (2014).

Tags

Immunologi och infektion bakteriell ögoninfektion intraokulär bakteriekvantifiering parametrar för okulär infektion intravitreal injektion intraokulär injektion endoftalmit
Intravitreal injektion och kvantisering av infektionsparametrar i en mus modell av bakteriell endoftalmit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mursalin, M. H., Livingston, E.,… More

Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter