Summary
ここでは細菌性内膜炎のマウスモデルにおけるビトリアル内注射とその後の細菌定量の方法について説明する。このプロトコルは、宿主の免疫応答および細菌および宿主遺伝子発現を測定するために拡張することができる。
Abstract
眼内細菌感染は視力にとって危険である。研究者は、動物モデルを使用して、感染に関連する宿主および細菌因子および免疫応答経路を調査し、実行可能な治療標的を同定し、失明を予防するための薬物を検査する。細胞内注射技術は、眼の後部の膜腔に生物、薬物、または他の物質を直接注入するために使用される。ここでは、マウス眼での感染を開始するこの注射技術と眼内細菌を定量する技術を実証した。 セレウス菌 は脳心注入液培地中で18時間成長し、100コロニー形成ユニット(CFU)/0.5μLの濃度に再懸濁した。ケタミンとキシラジンを併用してC57BL/6Jマウスを麻酔した。ピコリットルマイクロインジェクターとガラス毛細血管針を用いて、0.5μLの バチルス 懸濁液をマウス眼の中硝子に注入した。対照眼は滅菌培地を注射したか(外科的制御)、注入されなかった(絶対対照)。感染後10時間で、マウスを安楽死させ、無菌手術用ピンセットを使用して目を採取し、400μLの無菌PBSおよび1mmの無菌ガラスビーズを含むチューブに入れた。ELISAまたは骨髄ペルオキシダーゼアッセイの場合、プロテイナーゼ阻害剤をチューブに添加した。RNA抽出のために、適当なリシスバッファーを添加した。目を組織ホモジナイザーで1〜2分間ホモジナイザー化した。ホモジェナートをPBSで10倍に連続して希釈し、寒天プレートにトラック希釈した。ホモジエートの残りの部分は、追加のアッセイのために-80°Cで保存した。プレートを24時間インキュベートし、1眼当たりのCFUを定量化した。これらの技術は、マウスの目に再現性の感染症をもたらし、生存可能な細菌、宿主の免疫応答、および宿主および細菌遺伝子発現のオミックスの定量を促進する。
Introduction
細菌性心内炎は炎症を引き起こす壊滅的な感染症であり、適切に治療しないと視力や失明を引き起こす可能性があります。眼内炎は、目1、2、3、4、5の内部に細菌が入り込んだ結果である。一度目に入ると、細菌は複製し、毒素やその他の有害因子を産生し、繊細な眼下の細胞および組織に不可逆的な損傷を引き起こす可能性がある。眼の損傷は、炎症によっても引き起こされ得るが、眼の内部に炎症細胞が流入する炎症経路の活性化に起因する1、5、6。子宮内膜炎は、眼内手術(術後)、眼への貫通傷害(心的外傷後)、または異なる解剖学的部位(内因性)7、8、9、10から眼への細菌の転移性の広がりから起こり得る。細菌性眼内炎の治療には、抗生物質、抗炎症薬、または外科的介入3、4、11が含まれる。これらの治療を受けても、視力や目自体が失われる可能性があります。細菌性心内炎後の視覚予後は、一般に、治療効果、提示時の視力、および感染性生物の毒性によって異なる。
セレウス菌(B.セレウス)は、心的外傷後心内膜炎7、12を引き起こす主要な細菌病原体の1つである。B.セレウス心内炎の症例の大半は急速な経過を有し、数日以内に失明を引き起こす可能性がある。B.セレウス心内炎の特徴は、急速に進化する眼内炎症、眼痛、視力の急速な喪失、発熱を含む。B. セレウスは、一般的に眼感染症2、4、12を引き起こす他の細菌と比較して目に急速に成長し、多くの病原性因子を有する。したがって、治療介入を成功させるためのウィンドウは、1、2、3、4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25である。 この感染症の治療は、通常、他の毒性の低い病原体によって引き起こされる心内炎の治療に成功するが、B.セレウス心内膜炎は一般的に有意な視力低下に苦しむ患者の70%以上をもたらす。これらの患者の約50%は、感染した眼の摘出または摘出を受ける7、16、22、23である。B.セレウス眼内炎の破壊的かつ迅速な性質は、即時かつ適切な治療を必要とする。最近、疾患開発の基礎的なメカニズムを見極める上での進歩は、介入のための潜在的な標的を特定した19,26,27.B.セレウス眼内炎の実験的マウスモデルは、感染のメカニズムを識別し、視力低下を防ぐ可能性のある潜在的な治療法をテストするのに引き続き有用である。
B.セレウスを有するマウスの実験的眼内感染は、子宮内膜炎28の間に細菌および宿主因子、ならびにそれらの相互作用を理解するためのインストゥルメンタルモデルであった。このモデルは、外傷後または術後の事象を模倣し、怪我の間に細菌が目に導入される。このモデルは非常に再現性が高く、試験的療法のテストや、ケアの標準の改善のためのデータを提供するのに有用であった1、6、 19、29、30。他の多くの感染モデルと同様に、このモデルは感染の多くのパラメータの独立した制御を可能にし、感染結果の効率的で再現可能な検査を可能にする。過去数十年にわたるウサギの同様のモデルの研究は、目2、4、13、14、31におけるB.セレウス毒性因子の影響を調べた。個々または複数の病原性因子を欠く変異株B.セレウスを注入することにより、これらの病原性因子の疾患重症度への寄与は、異なる時間の感染時における細菌の濃度または視覚機能13、14、27、31、32の喪失などの結果によって測定することができる。さらに、特定の炎症性宿主因子26、29、33、34、35を欠くノックアウトマウス株に感染することにより、このモデルでホスト因子が検討されている。このモデルは、感染後に目に新しい化合物を注入することによって、この疾患の潜在的な治療法をテストするのにも有用である30,36.本稿では、B.セレウスにマウスの眼を感染させること、感染後の眼を収穫すること、眼内細菌負荷を定量化すること、および疾患の重症度の追加パラメータをアッセイするために標本を保存することを含む詳細なプロトコルを記述する。
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Protocol
すべての手順は、実験動物のケアと使用のためのガイドと眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚および眼科研究協会の勧告に従って行われました。このプロトコルは、オクラホマ大学保健科学センターの施設動物管理および使用委員会(プロトコル番号15-103、18-043、および18-087)によって承認されました。
1. 滅菌ガラス針
- 針ピペットの引き手を オンに します。
- ディスプレイに 12.6 が表示されるまで ヒーター ノブを調整します。
- ドアを開けて、5 μL のキャピラリーチューブを上部クランプとヒーターフィラメントに手動で供給し、チューブの半分がフィラメントの下に広がるまで(図 1A)。
- キャピラリーチューブが上部クランプの「V」溝に入っていることを確認します。上部クランプを締めます。
- 下側のクランプを開いた後、下側クランプが上限に達するまで垂直スライドを手動で調整します。チューブが下側クランプの「V」溝に入っていることを確認します。下側クランプを締めます。
- ドアを閉めて、「レディ」ライトが点灯していることを確認します。[スタート]ボタンを押してヒーターとプルシーケンスを開始します(図1B)。
- 熱と重力がキャピラリーチューブを引き離した後、ヒーターが自動的にオフになっていることを確認します(図1C)、スライドは下方に移動します。
- 戸を開けて下さい。キャピラリーチューブの上部を保持したまま、上部クランプを締め付けます。上の毛管チューブを取り外し、脇に置きます。
- キャピラリーチューブを下のスライドに持ち、下側クランプを締め付けます。下の毛管チューブを取り外し、脇に置きます。
- 0.05 μm アルミナ研磨砥石プレート付きのマイクロ電極ベベラーを使用して、引っ張られた毛細管をベベルして注射針を作成します。
- 表面を覆うのに十分な水を研削板にピペット(図1D)。.
- ベベラーを オンに して、60 rpmで回転し始めます。引っ張られたキャピラリーチューブを「V」溝のピペットクランプに入れなさい。クランプを締め、ピペットクランプの角度を30°に調整します。
- 粉砕プレートの回転の中心から約 3 分の距離のキャピラリー チューブの先端を調整します。
- マニピュレータの上部にある粗いコントロールノブを調整して、クランプされたキャピラリーチューブを下げます。キャピラリーチューブの先端が水面の下に伸び、粉砕板の研磨面に接触するまでキャピラリーチューブを下げ続けます。
- ベベラーに取り付けられた顕微鏡を使用して、ベベルの進行を監視します。5分後、細かいコントロールを調整して、グラス針を研削板から上げます。
- ガラス針を取り外し、10倍の倍率でキャピラリーチューブの先端を確認します(図1E,F)。
- 閉塞がないことを確認するには、ガラスの針をシリンジのピペットホルダーに挿入し、空気を99%エタノールの1 mLチューブに押し込みます。針の先端に気泡が形成される場合、針は閉塞を持たないし、マイクロインジェクションに使用することができます。このプロセスはまたガラスの針の無菌性を保障する。
- 1つの毛細管は5 μLまで液体を握ることができる。毛細管を10セクションにマークして、針の距離を計算して0.5 μLのボリュームにマークします。将来の準備のために0.5 μLを保持する距離でスケールをマークします。5 μL 針の場合、0.7 mm 離れた距離は 0.5 μL に相当します (図 1G)。
2.バチルス・セレウス文化
- バイオセーフティレベル2の条件下で、このセクションのすべての手順を実行します。
- 5%の羊の血液寒天プレート上の単一コロニー分離のためのB.セレウスATCC 14579のストリークフリーザーストックは、37°Cで一晩インキュベートする(図2A)。
- ピペット5 mLの無菌脳心注入(BHI)は、10 mLの無菌スナップキャップチューブにブロスする(図2B)。滅菌ループまたは針を使用して、寒天プレートから B.セレウス ATCC 14579の単一コロニーを選び、液体BHIを接種する。
- サンプルを簡単に渦を出す。スナップキャップチューブを回転インキュベーターに入れる。温度を37°C、速度を200rpmに設定します。18時間後、培養器から培養液を取り除く(図2B)。
3. ビトリアルインジェクション用の細菌希釈液
- バイオセーフティレベル2の条件下で、このセクションのすべての手順を実行します。
- 1マイクロリットル当たり200コロニー形成単位(CFU/μL)を達成するために新鮮なBHIの10 mLに加える一晩 のB.セレウス 培養の体積を計算する。例えば、BHIの B.セレウス の一晩培養は約2 x 108 CFU/mLに複製され、10μLの一晩培養を10mLの新鮮なBHIにピペット化することによって200 CFU/μLに希釈することができる。
- 1.5 mLマイクロ遠心チューブに希釈したばかりの培養のピペット1mL。このチューブを氷の上に置いて、ビトリアルインジェクションまで続けます。細菌培養物を希釈して60分以内にビトリアル注射を行う。
4. マウスのビトリア内注射
- バイオセーフティレベル2の条件下で、このセクションのすべての手順を実行します。
- 手術台の上に医療の下パッドを置くことによって処置の場所を準備する。
- マイクロインジェクター をオンに し、マイクロインジェクタに取り付けられた圧縮空気タンクのガスバルブを開きます。ガスの供給がおよそ60 psiになるまでタンクレギュレータを調節して下さい。
- マイクロインジェクタで、画面にバランスが表示されるまでモードを押します。バランスを押して、コンピュータを操作テーブルの上に置きます。ステンレス製のピペットホルダーを、インジェクタの「充填/出力」に取り付けられたチューブに接続します。この管は常に注入器に接続される。
- ピペットホルダーのコネクタを針の周りにしっかりとねじ込んで、ピペットホルダーのもう一方の端に毛細血管針を挿入します。
- 眼科顕微鏡をオンにし、その光を50%の強度に点灯します。手術台の手順部位に顕微鏡を調整し、顕微鏡を所望の焦点に合わせます。
- 手順が始まる前に、ペダル離脱反射をテストしてマウスが適切に麻酔されていることを確認します。麻酔のためのあなたのIACUC承認されたプロトコルに従ってください。
- 麻酔マウスを医療下パッドの上に置き、鼻を右に向け、左側に傾きます。
- 眼科顕微鏡を通してマウスの右目を見て、眼の両側の逆作用鉗子のトングを開いて注射部位を露出させることで蓋を開けて、注射部位を露出させる(図3C)。
- マイクロインジェクターに接続されたマウスパッドを左クリックして、キャピラリー針に200 CFU/μL希釈液を充填します(図3D)。
- 左手で動物の頭を固定し、針の先端を目の手足に置きます。針をベベルアップ位置と45°角度にして、マウスの目を穿刺しますが、注射時には針の鋭い先端(約0.5mm)のみが挿入されるようにします。
- 針先を挿入したら、マウスヘッドからマウスパッドに左手を動かし、マウスパッドを右クリックしてB.セレウス希釈液の0.5 μLを注入します。漏れを防ぐために、マウスの目の中に針の先端を2〜3秒間放置してから(図3E)1、19、26、27、32、34、36、37、38を取り除きます。
- 鉗子を放し、加温パッドに座っているケージにマウスを置きます。麻酔から回復するまでこれらのマウスを監視する(図3F)。
- マウスが麻酔から回復したら、ケージを適切なラックに戻します。マウスが電気レティノグラフィーによるレチン機能解析を受ける場合、ケージは適切な暗い適応のために暗い部屋に戻す必要があります。
5.収穫管の準備
- 1 mmの無菌ガラスビーズを1.5 mLのスクリューキャップチューブに入れます。
- 乾燥した設定でオートクレーブでこれらのチューブを殺菌します。チューブを室温まで冷ましてから使用してください。
- 1x無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の10 mLを無菌15 mL遠心チューブに加えます。
- 1錠のプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレットをチューブに加えます。19、27、29、34、35を渦によって混ぜます。
- プロテアーゼ阻害剤を含む1xリン酸緩衝生理食塩基(PBS)のピペット400μLをオートクレーブ収穫チューブに各オートクレーブ収穫管に入れた。チューブにラベルを付け、氷の上に置きます。(図4A)
6. 目の収穫
- バイオセーフティレベル2の条件下で、このセクションのすべての手順を実行します。
- マウスをCO2 吸入で安楽死させる。安楽死を確認するために二次的な方法を使用してください。
- 安楽死させたマウスヘッドを安全に保持し、感染した眼の両側の細かい先端鉗子を開きます。頭に向かって押し下げて目をプロトーゼします。トングが目の地球の後ろになったら、トングを一緒に絞ります。鉗子を頭から引き離して眼球を取り外す(図4B)。
- すぐに眼球を標識された収穫管に入れます。氷の上にチューブを60分以下に置きます(図4C)。
7. 眼内細菌数
- バイオセーフティレベル2の条件下で、このセクションのすべての手順を実行します。
- すべての収穫管がしっかりと閉じられ、組織ホモジナイザーの中でバランスが取れているか確認してください(図5A)。サンプルを均質化するために1分間、組織ホモジナイザーをオンにします。30 s を待ってから、さらに 1 分間電源を入れます。氷の上にチューブを置く(図5B,C)。
- ホモジネートの20 μLを180 μLの無菌1x PBSに順次移して、各サンプルを10倍に連続して希釈します。10-7の因子に達するまで希釈する(図5D)。
- 適切な希釈因子で暖かい、正方形のBHIプレートの各行にラベルを付けます。各希釈液の10 μLを、約45°の傾きの上部BHIプレートに一列に移動します。サンプルがプレートの底に近くなるまで実行し、プレートを平らにして配置します(図5E)39。
- サンプルをBHI寒天に吸収したら、プレートを37°Cインキュベーターに移します。コロニーは、インキュベーターに入れられた後8時間目に見えるように開始する必要があります。
- B.セレウスコロニーの成長前にインキュベーターからプレートを取り出し、個々のコロニーを識別するのを妨げる(図5F)。
- サンプル中の濃度を正確に表す場合は、10~100コロニーの間の行を数えます。たとえば、45 コロニーを持つ10-4 の希釈分率を持つ行は、4.5 x 10 5 CFU/mL の濃度を 持つことになります。
- 1眼あたりの細菌の総数を計算するには、濃度に0.4を掛け、眼の均質化に使用される1x PBSのミリリットル体積を表します。たとえば、4.5 x 105 CFU/mL濃度は、1眼あたり1.8 x 105 CFU B.セレウス に変換されます。
8. サンプルの保存
- ホモジュネートサンプルをラベル付きの冷凍庫ボックスに入れ、この箱を-80°Cの冷凍庫に入れます。これらのサンプルは、後でELISAによる炎症性メディエーター分析に使用することができる。
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Representative Results
再現性の接種およびビトウィーン内注入手順の精度を生成することは、微生物内眼炎のモデルを開発する上で重要なステップです。ここでは、グラム陽性 バチルスセレウスを用いたビトリア内注入手順を実証した。5匹のC57BL6マウスの中部に100CFU/0.5μLの B.セレウス を注入した。10時間の後の感染後、我々はおよそ1.8 x 10 5 CFU/眼に B.セレウス の眼内成長を 観察した。 図1 は、マウスの目の中に細菌を送達するためのガラス針の構造を示しています。血液寒天板や培養管に成長する セレウス菌 を 図2に示す。 図3 は、空気加圧注入システムを用いたマウスのビトリアル内注入手順を示す。 図4 は、感染した眼を所望のポスト感染後に収穫する過程を示す。 図5 は、感染した眼を均質化する技術を示す。 図6 は、10時間のポスト感染時に5つの異なるマウス眼からの眼内細菌数を示す。 図 7 は、マウスのビリトリアルインジェクションの全体的な手順とグラフィカルな表現を示しています。
図1:ベベガラス針を作る。ガラスの針は針/ピペットの引き手およびマイクロピペットのベベラーを使用して使い捨てマイクロキャピラリーピペットからなされた。(A)針/ピペットプーラーにクランプガラスキャピラリーチューブ。(B,C)希望の電圧を使用してガラス針の作成。(D) ガラスマイクロピペットをベベルする。(E, F)ガラスのマイクロピペットは、ベベル前後。(E) ガラス針をスケーリングする。2つの黒い点の間のスペースは0.5 μLを保持します。
図2: バチルス・セレウス ATCC 14579。(A)血天寒天板上で生育する セレウス 菌。 B.セレウス の個々のコロニーは、通常、血中寒天プレート上の血中炎の明確なゾーンを表示します。(B) B. セレウスの一晩の文化を濁った.(C) B. セレウスのグラム染色 . B. セレウス はグラム陽性の棒状の細菌である。(D) セレウス菌の電子顕微鏡写真.この電子顕微鏡写真は、毛髪を持つ棒状の バチルスセレウス を、flagellaと呼ばれる構造を示しています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウスのビトリア内注射。注射手順は、市販の顕微鏡(A)ケタミンおよびキシラジン薬を使用して操作場を観察してマウスを麻酔する加圧空気注入器を用いて行われる。(B)マウスを麻酔剤に対する腹腔内注射によるケタミンおよびキシラジンの投与。(C)眼をプロトシングするために、眼球の皮膚をクランプバックする。(D)空気加圧インジェクターを用いて、針を細菌で満たします。(E) ビトリアル内注射.(F) 麻酔後に感染したマウスを監視する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マウス感染眼の収穫。感染後、所望の時点の後に、滅菌ピンセットを使用して感染したマウスの目を収穫する。(無菌ガラスビーズを含む)PBS。(B) 感染した眼の収穫。(C)マウスの目を含む収穫管。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:眼内細菌数に対して採取した眼を処理する。(A)感染した眼を組織ホモジナイザーにしっかりと締め付けた収穫管。(B)感染した眼をそれぞれ1分間2回均質化した。細菌定量のための眼のホモジネーション(C)および後続のめっき(E)のトラック希釈(D)。(E)代表的な個々のバチルスセレウスコロニーは、トラック希釈後。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:眼内細菌は、感染後10時間で数える。M、マウス番号。CFU、コロニー形成ユニット。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:マウスのビトリア内注射。(A) マウスのビトリアル内注入手順の全体的なフローチャート。(B) ビトリアルインジェクションのグラフィカルなプレゼンテーション。処置の間、B. セレウス の培養物を含む無菌の斜面ガラス針がマウスの眼の中に挿入され 、B.セレウス は空気加圧マイクロインジェクションシステムを使用して送達される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
強力な抗生物質、抗炎症薬、および虚内切開手術が可能であっても、細菌性子宮内膜炎は患者を盲目にすることができます。臨床研究は、眼内炎の研究に有用であった;しかし、眼科医炎の実験モデルは、迅速かつ再現性の高い結果を提供し、治療水準の進歩に変換することができ、患者の視覚結果を向上させます。
マウスアイの膜状ボリュームは約7μL40です。この小さい容積は限られた量の物質を注入することを可能にする。1.0 μL を超えるボリュームは、眼の損傷を避けるために注入しないでください。このプロセスでは、再現性と正確性を確保するために、特定の機器と技術の実践が必要です。内眼炎は霊長類、豚、ウサギ、ラット、モルモット、マウス28、41、42、43、44、45で研究されている。より大きな種の中で、目は人間の目にはるかに近いサイズであり、より大きな目へのビトリアル内注射は、特別な機器なしで行うことができます。マウスを除いて、ノックアウト株および試薬が存在しない他の動物モデルにおける宿主免疫応答を研究することは、実験的な眼内炎におけるそれらの有用性を制約する。
白内障手術の合併症として最も頻繁に子宮内炎が起こる。この感染は、眼外傷または全身感染後にも起こり得る。この疾患の視覚結果は、感染病原体の病原性に部分的に依存する。マウスでは、視覚の結果も免疫状態に依存します。疾患の病態のメカニズムを理解することは、実験動物モデル28で疾患を研究することによって促進された。マウスのウイルス内注射および感染パラメータの定量化のためのプロトコルは、細菌または真菌病原体28のほぼすべてのタイプで開始されたエンドフタル炎を研究するために適応することができる。さらに、このプロトコルは、感染時の細菌と宿主の解剖学的変化、炎症過程、および遺伝子発現プロファイルを研究するために適用および変更することもできる。
マウスのウイルス内注射とその後の感染パラメータの分析は、いくつかの重要なステップで構成されています (図7)。ガラス針は正確に作成、マーク、滅菌する必要があります。ベベガラス針の鋭い端と適切なスケーリングは、細菌と地球穿刺の適切な送達を決定します。針の端が短く、適切にベベが行われなければ、地球に大きな穴が開き、漏れ、地球の汚染、および不正確な病気の結果を引き起こす可能性があります。そのため、明視野顕微鏡の10倍光学ズーム下でガラスマイクロピペットを観察することが推奨されます。細菌の正しい量の送達を確実にするために、希釈液は事前に計算されるべきであり、適切な容積スケールはガラス針に印が付けられているべきである。他のタイプの機器を使用して針を引っ張り、ベベルするためのパラメータは異なる場合があります。
記載されたビトリアル内注入技術は、マウス眼1への細菌の適切な送達のための空気加圧マイクロインジェクターシステムを利用する。このマイクロインジェクターの適切な使用は、再現性の感染パラメータにとって非常に重要です。空気圧によって送達速度が決まりますので、過度の力が急速に大きな体積を眼に注入し、過度の眼圧や地球破裂を引き起こす可能性があります。したがって、推奨は、手順中に充填および注入するために10〜13 psiの圧力を使用することです。もう一つの潜在的な問題は、充填後のガラス針からの細菌溶液の漏出である。漏れは、マウスの目に不正確なボリュームの注入につながる可能性があります。注射の前に、注射システム、チューブ、およびガラスの針間の接続を常に確認してください。
実験細菌性内視鏡炎の再現性のためには、正確な量の細菌を注入することが不可欠です。異なる実験的な眼内炎モデルは、細菌12、28、46、47、48、49の特定の数の接種を必要とする。B. 子宮内腎炎の場合、100 CFUを注入して再現性の感染を開始する必要がある。細菌の増殖は成長培地や条件に依存するため、成長環境、培地、希釈液を毎回繰り返す必要があります。そのため、実験の前に培養条件をテストし、正確な接種を適切な量で射出に再現することが推奨されます。上述したように、マウス眼へのビトリアル内注射の上限は1.0 μL28である。過度の体積は、緑内障を引き起こし、後部セグメントから網膜を剥離したり、地球を破裂させる可能性のある眼圧を上昇させる。マウスにおけるウイルス内注射およびそれに伴う感染は、ヒトにおけるB.セレウス心内炎を完全に模倣していない可能性がある。ヒト疾患のほとんどの動物モデルは、このように制限されています。B.セレウスの既知の量は、栄養豊富な培地の成長後に目に注入されます。B.セレウス心内炎の臨床症例では、感染量は不明であり、汚染源はさまざまである。しかし、特徴付けられた生物とマウス株を使用し、再現性のある感染コースを生成するという利点は、これらの制限を上回る。
感染した目の適切な収穫は、もう一つの重要なステップです。無菌状態を維持することは、データの解釈を妨げる可能性のある相互汚染を避けるために不可欠です。したがって、推奨は、収穫前に70%エタノールでワークベンチとすべての器具を消毒することです。細菌の数は、感染時に、ウイルスの環境内で急速に増加し、眼の腫脹を引き起こす可能性があります。したがって、収穫時に、地球の破裂を防ぐ際に、眼を優しく除去するよう注意する必要があります。さらに、感染した眼を含む収穫管のキャップは、組織ホモジナイザーにチューブを入れる前に適切に締め付ける必要があります。緩い帽子は漏出し、漏出管の細菌の不正確な量に導くティッシュホモジナイザーの汚染をもたらす。目の均質化のプロシージャはまた管の温度を高める。そのため、一度に1分間の均質化を推奨します。高温は、いくつかの感染パラメータの定量に影響を与える可能性があります。この方法は、目の特定の場所内の細菌の数を提供していませんが、組織学的方法と組み合わせると、細菌が局在する可能性のある場所を推定することができます。眼内炎中の眼の B.セレウス の局在化は、眼が大きく、より容易にサブコンパートメントに解剖されるウサギで報告されている。2
細胞内注射は、感染を開始する眼の後部セグメントへの生物の送達を模倣する。この初期ステップは、実験的眼内炎の非常に再現性の高いマウスモデルにおける感染パラメータの質的および定量的研究を促進する。これらのモデルは、浸潤性好中球中のミエロペルオキシダーゼを定量し、フローサイトメトリーによって特定の細胞タイプを同定し、サイトカインおよびケモカインをリアルタイムPCRおよび/またはELISAによって定量し、組織病理学1、6、19、20、26、27、34によって眼のアーキテクチャを観察することによって眼の炎症を推定するためにも使用される。感染したマウスの目は、測定される感染パラメータの種類に応じて異なる希釈剤で収穫されます。遺伝子発現解析では、別のリシスバッファーが必要です。組織病理学的検査のために、収穫された目は固定液に置かれる。多くの遺伝的ノックアウトマウスはまた、様々な免疫因子および細胞の役割の研究を容易にする。したがって、細胞内注射は眼内感染および治療の分野における研究者にとって主力の技術である。
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Disclosures
著者らは開示する財政的な矛盾を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、フェン・リー博士とマーク・ディットマー博士(OUHSC P30ライブアニマルイメージングコア、ディーンA.マギーアイ研究所、オクラホマシティ、OK、米国)の支援に感謝します。私たちの研究は、国立衛生研究所の助成金R01EY028810、R01EY028066、R01EY025947、およびR01EY024140によってサポートされています。また、P30EY21725(生きた動物イメージングと分析、分子生物学、細胞イメージングのためのNIH CORE助成金)によっても研究が支援されています。私たちの研究はまた、NEIビジョンサイエンス博士後期研修プログラム5T32EY023202、長老派健康財団研究支援助成金、および失明防止研究からディーンA.マギーアイ研究所への無制限の助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-20 µL pipette | RANIN | L0696003G | NA |
| 37oC Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | NA |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 90003-032 | NA |
| Cell Microinjector | MicroData Instrument, Inc. | PM2000 | NA |
| Fine tip forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-122 | NA |
| Glass beads 1.0 mm | BioSpec | 11079110 | NA |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | NB-I2400 | NA |
| Microcapillary Pipets 5 Microliters | Kimble | 71900-5 | NA |
| Micro-Pipette Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | NA |
| Microscope Axiostar Plus | Zeiss | NA | |
| Microscope OPMI Lumera | Zeiss | NA | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | NA |
| Multichannel pipette 30-300 µL | Biohit | 15626090 | NA |
| Multichannel pipette 5-100 µL | Biohit | 9143724 | NA |
| Needle/Pipette Puller | Kopf | 730 | NA |
| PBS | GIBCO | 1897315 | Molecular grade |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Molecular grade |
| Reverse action forceps | Katena | K5-8228 | NA |
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