Summary
在这里,我们提出了一个分步方案来生成成熟的人视网膜类器官,并在光感受器毒性测定中利用它们来确定年龄相关性视网膜退行性疾病黄斑毛细血管扩张症 2 型 (MacTel) 的候选药物。
Abstract
类器官为研究疾病机制和治疗提供了一个有前途的平台,直接在具有细胞培养多功能性和通量的人体组织背景下。成熟的人视网膜类器官用于筛选与年龄相关的视网膜退行性疾病黄斑毛细血管扩张症 2 型 (MacTel) 的潜在药物治疗。
我们最近表明,MacTel 可能是由非典型脂质物种脱氧鞘脂 (deoxySL) 水平升高引起的。这些脂质对视网膜有毒,并可能导致MacTel患者发生的感光器损失。为了筛选药物预防脱氧SL感光器毒性的能力,我们从非MacTel诱导的多能干细胞(iPSC)系生成了人视网膜类器官,并将它们成熟到有丝分裂后年龄,在那里它们发育出视网膜的所有神经元谱系衍生细胞,包括功能成熟的光感受器。用脱氧SL代谢物处理视网膜类器官,并使用免疫组织化学测量光感受器层内的细胞凋亡。使用该毒性模型,筛选了防止脱氧SL诱导的感光器死亡的药理化合物。使用靶向候选方法,我们确定非诺贝特(一种通常用于治疗高胆固醇和甘油三酯的药物)也可以预防视网膜细胞中的脱氧SL毒性。
毒性筛查成功鉴定出FDA批准的可以预防感光器死亡的药物。由于测试了高度相关的疾病模型,这是一个直接可操作的发现。该平台可以轻松修改,以测试任意数量的代谢应激源和潜在的药物干预,以用于视网膜疾病的未来治疗发现。
Introduction
在细胞培养和动物模型中对人类疾病进行建模为发现、修改和验证药物治疗提供了宝贵的工具,使他们能够从候选药物发展到批准的治疗。尽管体外和非人体体内模型的组合长期以来一直是药物开发管道的关键组成部分,但它们经常无法预测新型候选药物的临床性能1。显然需要开发技术,弥合简单的人类细胞单一培养和临床试验之间的差距。自组织三维组织培养物类器官的最新技术进步提高了它们对模型组织的保真度,使其成为临床前药物开发管道中的有前途的工具2。
与非人类体内模型相比,人类细胞培养的一个主要优势是能够复制人类新陈代谢的特定复杂性,即使在人类和小鼠等高阶脊椎动物之间也可能有很大差异3。然而,这种特异性可能会被组织复杂性的损失所掩盖;视网膜组织就是这种情况,其中多种细胞类型错综复杂地交织在一起,并且在细胞亚型之间具有独特的共生代谢相互作用,无法在单一培养中复制4。人类类器官提供了复杂人体组织的传真,具有细胞培养的可及性和可扩展性,有可能克服这些疾病建模平台的缺陷。
来自干细胞的视网膜类器官已被证明在模拟人类神经视网膜的复杂组织方面特别忠实5。这使得视网膜类器官模型成为研究和治疗视网膜疾病6,7的有前途的技术。迄今为止,视网膜类器官的大部分疾病建模都集中在单基因视网膜疾病上,其中视网膜类器官来源于具有致病遗传变异的iPSC系7。这些通常是高渗透性突变,表现为发育表型。在衰老疾病方面,基因突变和环境压力源影响正常发育的组织的有效工作较少。衰老的神经退行性疾病可能具有复杂的遗传和环境压力源的贡献,这些环境应激源本质上很难使用短期细胞培养物进行建模。然而,在许多情况下,这些复杂的疾病可以结合在共同的细胞或代谢应激源上,当在完全发育的人体组织上进行测试时,可以为衰老的神经退行性疾病提供强有力的见解8。
迟发性黄斑退行性疾病,黄斑毛细血管扩张II型(MacTel),是一种遗传性复杂的神经退行性疾病的一个很好的例子,它融合在一个常见的代谢缺陷上。MacTel 是一种罕见的视网膜衰老退行性疾病,导致黄斑中光感受器和穆勒胶质细胞丢失,导致中心视力进行性丧失9,10,11,12,13。在MacTel中,一种未确定的,可能是多因素的遗传导致患者循环丝氨酸的共同减少,导致称为脱氧鞘脂(deoxySL)的神经毒性脂质种类增加14,15。为了证明脱氧SL的积累对视网膜有毒并验证潜在的药物治疗,我们开发了该协议来测定人视网膜类器官中的光感受器毒性14。
在这里,我们概述了用于区分人视网膜类器官,使用类器官建立毒性和救援测定以及量化结果的特定方案。我们提供了一个成功的例子,我们确定了可疑致病剂deoxySL的组织特异性毒性,并验证了使用安全的仿制药非诺贝特来治疗脱氧SL诱导的视网膜毒性。先前的工作表明,非诺贝特可以增加患者脱氧SL的降解并降低循环脱氧SL,然而,其在降低脱氧SL诱导的视网膜毒性方面的功效尚未经过测试16,17。尽管我们提出了一个具体的例子,但该协议可用于评估任何数量的代谢/环境应激源和潜在治疗药物对视网膜组织的影响。
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Protocol
1. 解冻、传代和扩增 iPSC/ESC
注意:对于所有细胞培养步骤,请使用最佳实践来维持无菌细胞培养。
- 用基底膜基质培养基包覆 6 孔细胞培养板。
- 要制备 1x 该培养基,请遵循产品规格或用 9 mL DMEM/F12 稀释 75 μL 冷基质培养基。在 6 孔板中每孔加入 1.5 mL 新鲜制备的 1x 培养基。在37°C孵育30分钟。
- 吸出基底膜基质培养基,并用 3 mL DMEM/F12 冲洗每个孔。加入 2 mL DMEM/F12 并在 37 °C 下孵育直至使用。准备好的那天使用盘子。
- 在PBS中制备10mM岩石抑制剂(Y-27632二盐酸盐)储备溶液,并储存在-20°C直至使用。
- 将一瓶 iPSC/ESC 解冻到 DMEM/F12 培养基中,并以 400 x g 离心 5 分钟。吸出上清液并将沉淀重悬于mTeSR培养基中。将1小瓶细胞板到mTeSR培养基中包被的6孔中,并用10μM岩石抑制剂(Y-27632二盐酸盐)孵育过夜。第二天,吸出培养基并重新添加mTeSR。
注:每天更换介质,直到通过。 - 通过在 500 mL PBS 中稀释 500 μL 0.5 M EDTA,在 PBS 中制备 0.5 mM EDTA。
- 当细胞达到80-90%汇合时传代细胞。每孔1:3或1:6分裂细胞,具体取决于细胞的生长速率。
- 为了从平板上去除粘附的细胞,吸出培养基并在室温下在PBS中与0.5mM EDTA孵育5分钟。孵育后,用 p1000 移液器将 1 mL mTeSR 培养基强行倒入细胞中,取出 EDTA 溶液并取出细胞。
- 继续吸吮并强行弹出mTeSR培养基和细胞,最多5倍,以去除粘附的剩余细胞。用mTeSR培养基将细胞接种到新鲜的基底膜基质涂层的6孔板上。继续每天更换培养基,直到板再次达到80-100%汇合度。
- 一旦细胞扩增到完整的6孔板并达到80-100%汇合度,留出一个孔以扩增细胞系以进行后续分化或冷冻以进行冷冻保存。使用剩余的五个孔通过制作胚状体开始分化过程。
2. 制作胚体 (EB)
注意:EB形成和分化培养基配方源自Cowan等人5,Ohlemacher等人18和Zhong等人19中的协议。
- 如下所述制备 1x 分散酶溶液和神经诱导培养基 (NIM)。
- 通过将粉末溶解在 DMEM/F12 中,制备 10 mg/mL 的 5x 分散酶储备溶液。使用0.22μm过滤器的无菌过滤器。将1mL等分试样储存在-20°C直至使用。
- 使用 5 x 分散酶溶液,在 DMEM/F12 中制备 1 mL/孔的 2 mg/mL 分散酶。将溶液在37°C下加热30分钟。
- 通过补充 DMEM/F12 以 180 U/mg 的 180 U/mg 补充 DMEM/F12 来制备 NIM。
- 准备 16 mL 的 3:1 mTeSR:NIM (12mL:4mL) 溶液并将其加热至室温。
- 去除分化的细胞并加入温热的分散酶溶液。
- 从 iPSC/ESC 细胞培养物中去除分化细胞。在解剖镜下,用 p10 移液器吸头刮掉不透明的白色菌落。从培养孔中吸出mTeSR培养基。这将去除刚刚刮掉的分化团块。
- 立即加入预热的分散酶溶液并在37°C下孵育,直到细胞集落的大部分边缘开始在显微镜下卷曲。这将需要4-8分钟。
注意:必须为每个实验室确定分散酶中细胞的孵育时间。细胞系之间的持续时间可能不同,接种3天或更长时间的细胞需要更长的孵育时间。生长缓慢的iPSC / ESCs需要超过3天才能达到汇合,将开始以更大的强度粘附在板上,使得难以将细胞取出。对于生长缓慢的细胞,尝试以 1:2 传代细胞以扩增到完整的 6 孔板,以减少从板到汇合的时间。
- 吸出溶液,每孔轻轻添加至少 2 mL DMEM/F12 培养基。将DMEM / F12培养基缓慢添加到孔的侧面,注意不要使细胞脱落。
- 吸出 DMEM/F12 培养基,然后用力将新鲜的 1 mL DMEM/F12 直接添加到细胞上,以从平板上提升细胞集落。使用 p1000 移液器反复吸吮并用力将 DMEM/F12 喷射到孔中,最高可达 5 倍,以去除尽可能多的细胞菌落。
注意:分化/分化的 iPSC/ESC 比未分化的 iPSC/ESC 更粘附在平板上。重复移液后不会脱落的细胞最好留下。过量移液会杀死细胞并降低EB生产效率。细胞团块每团块将有 100-400 个细胞。
- 吸出 DMEM/F12 培养基,然后用力将新鲜的 1 mL DMEM/F12 直接添加到细胞上,以从平板上提升细胞集落。使用 p1000 移液器反复吸吮并用力将 DMEM/F12 喷射到孔中,最高可达 5 倍,以去除尽可能多的细胞菌落。
- 将浮动菌落转移到 15 mL 锥形管中,并在每孔中额外用 1 mL DMEM/F12 培养基冲洗孔,以收集任何剩余的浮动菌落。
- 让漂浮的菌落在重力作用下沉降不超过5分钟。沉淀后,除去除 1-2 mL 上清液以外的所有上清液。注意不要搅动底部的软颗粒。
- 将沉淀重悬于预热的 3:1 mTeSR:NIM 培养基中,并转移到超低附着的 T75 烧瓶中。孵育过夜以形成EB。这将被视为分化的第 0 天。
- 逐渐将培养基改为 NIM,开始将 EB 分化为神经祖细胞。
- 第二天,取出培养基并用 10 mL 的 1:1 mTeSR:NIM 培养基替换。要从自由漂浮的EB培养物中取出培养基,请将烧瓶向上倾斜,使EB收集到培养瓶的底角。吸出上清液,确保不要吸出底部沉淀中的任何EB。
- 第二天,用 10 mL 的 1:3 mTeSR:NIM 培养基更换培养基。
- 第二天,用完整的NIM培养基更换培养基。继续每 2 天用 NIM 培养基更换一次培养基,直到分散酶处理后 7 天。
3. 电镀EB和启动神经视网膜分化
- 分散酶处理一周后,将EB自由漂浮到涂有生长因子降低基底膜基质培养基的6孔板上。要涂覆板,请参阅步骤 1.1。
- 从 EB 中吸出用过的培养基,并用 12 mL 的 NIM 替换。
- 通过搅拌含EB的培养基重悬EB,确保EB均匀分布到每个孔中,然后快速取出1/6的培养基(2 mL)并分配到一个孔中。对剩余的孔重复此操作。
- 在孵育之前,轻轻摇动板,来回然后左右摇动,以均匀分布EB。如果EB聚集在中间,它们将无法正确区分。
注意:电镀密度对于差异化至关重要。确保每孔板大于30个EB。如果EB生产效率不高,则将EB分配到较少的井中。
- 每天使用NIM培养基更换培养基。将孔中的培养基水平保持在~3 mL。更换培养基时,取出除 1 mL 以外的所有培养基以免使镀板的 EB 变干,并在孔的侧面轻轻添加 2 mL 培养基,以免将细胞从板上提起。
- EB电镀后9天,开始在两天内将培养基从NIM更换为视网膜分化培养基(RDM)。
- 通过混合以下内容制备 RDM:48% DMEM/F12 (1:1) 和 48% DMEM,补充 2% 不含维生素 A、1% MEM NEAA 和 1% Pen-Strep 的 B27 补充剂。使用0.20μm过滤器进行过滤灭菌。RDM可以在4°C下储存长达一个月。
- 第一天,将介质切换到 NIM:RDM 的 1:1 混合。第二天,将媒体更改为 RDM。随后的所有日子,喂养细胞RDM。
注意:在接下来的几周内,电镀的EB将形成神经视网膜祖细胞,开始产生明显色素沉着的RPE。
4. 制作自由漂浮的类器官并保持自由漂浮的类器官培养物
- 在初始分散酶处理后 28 天(EB 电镀后 21 天)使用无菌手术刀将 1-2 mm2 网格切割成电镀的 EB。这会将视网膜祖细胞菌落分成小块,这样在发育后期,它们就不会因为中心营养交换不足而变得太大和坏死。
- 拆下电镀的EB。
- 为此,首先向每个孔中额外添加 2 mL RDM。然后使用 p1000 移液器从孔中吸出 ~1000 μL 培养基。现在用力将介质直接弹出到电镀的EB上,尖端完全浸没。
- 重复此操作,直到所有细胞都从平板中取出。在弹出介质期间保持吸头浸没,不要将移液器柱塞推过第一挡块以避免气泡。
- 将新生分离的EB块重悬于无菌塑料125 mL锥形瓶中,并用~40 mL RDM培养基填充烧瓶。将烧瓶放在放置在标准培养箱中的轨道振荡器上。将振动台速度设置为 130-140 RPM(速度设置 3)。
注意:在摇床上培养类器官可防止它们在以较高浓度的类器官培养时粘在一起。生物反应器也可以达到相同的目的,但振动台更便宜。 - 通过部分更换培养基来喂养类器官,每周更换约 12 mL 的 RDM 2-3 次,具体取决于培养基的变黄程度。早期类器官不需要太多的喂养,但随着它们的生长,它们将需要更频繁的培养基更换和更多的培养基。
- 每两周修剪一次类器官,以去除非视网膜、杂草丛生和垂死的类器官。这可以防止浪费培养基并改善剩余视网膜类器官的健康。
- 使用 5 mL 移液管将细胞从烧瓶转移到 6 孔板或 10 cm 培养皿上。保留显示分层神经上皮的类器官(图1A,星号)。这些类器官是透明的白色。
- 用 5 mL 移液器分拣并去除畸形或过度生长的视网膜类器官和非视网膜类器官。这些通常是不透明和淡黄色的(图1A)。还要去除任何看起来不像分层神经上皮的东西。最初的几次修剪将是劳动密集型的,但随着类器官变得更大、更均匀,每次修剪都会变得容易得多(图1B)。
5. 维持成熟的类器官并将其分化为有丝分裂后的视网膜组织
- 在EB形成的初始分散酶处理后第56天(第8周)(在烧瓶中培养移位的EB后28天),将类器官培养基更换为RDM+。这将为完全成熟的类器官提供额外的营养,如视网膜组织。
- 在PBS中准备100 mM牛磺酸。将等分试样储存在-20°C直至使用。
- 通过补充 RDM 10% FBS、100 μM 牛磺酸和 2 mM 商业谷氨酰胺补充剂来制备 RDM+。使用0.20μm过滤器进行过滤灭菌。
- 继续每周更换 RDM+ 培养基 2-3 次。
- 在第 17-18 周(分散酶处理后),使用 5 mL 移液器将类器官从锥形瓶转移到超低附着 6 孔板中。在第一周继续每天修剪和分离类器官,直到类器官不再粘在一起。最佳密度为每孔10-15个类器官。每周更换媒体2-3次。
注意:如果类器官经常相互粘附,或者培养基在更换培养基之间变黄,请减少每孔的类器官数量。 - 预计类器官在第 185 周时完全在有丝分裂后变得完全,此时神经视网膜细胞始终存在。到第24周,检查类器官外部的基本外段的形成。到第26-28周,确保类器官外部的外段较厚(图1C)。在第 26 周后进行毒性测定,此时类器官具有表示成熟分化状态的外部片段。
注意:仅使用分化的视网膜类器官进行毒性测定。对具有明确定义的外段的类器官进行毒性测定将允许对其进行鉴定。
6.脱氧鞘氨酸(脱氧SA)与药物治疗
注意:这里介绍的是非诺贝特的单一治疗,以在4天内挽救脱氧SA毒性(图2)。然而,添加到类器官中的脱氧SA的浓度,类器官上的脱氧SA处理的持续时间以及用于挽救毒性的药物类型14 可以根据实验需要进行修改,以测定毒性和毒性挽救。
- 在乙醇中制备1mM脱氧SA储备溶液。在-20°C下储存1个月。或者,可以在DMSO中制备脱氧SA的储备溶液。
- 进行脱氧SA的连续稀释,以确定用于药物抢救的脱氧SA的适当毒性浓度。
注意:首先确定脱氧SA的浓度,这将导致足够的细胞死亡以测量救援效果。如果浓度过高,毒性反应将导致类器官解体,并且不会观察到救援。如果毒性反应太低,将很难观察到显着的救援效果。脱氧SA毒性反应可能因实验室和批次的脱氧SA而异。- 在 3 mL RDM+ 中将 1 mM 脱氧 SA 储备溶液稀释至 0.5 μM、1 μM 和 2 μM 的浓度。向RDM+中加入3μL乙醇以制备对照处理。
- 在解剖显微镜下,使用无菌探针选择 4 组类器官,每组至少 5 个类器官。将这些组分成超低附着6孔板的单独孔。选择具有大致相同大小和形状的类器官。
- 从类器官中吸出尽可能多的RDM+。向每个类器官孔中,在RDM+中加入一种浓度的脱氧SA。将载体控制添加到类器官的第四孔中。
- 在脱氧SA或载体中培养两天后,用RDM +中新鲜制备的相应脱氧SA稀释液替换培养基。
- 在治疗的第四天,进行步骤7以处理和测定细胞死亡的类器官。一旦选择了脱氧SA浓度,继续步骤6.3以用非诺贝特处理。
注意:所选脱氧SA处理组中的靶细胞死亡为每10,000μm 5 - 20 TUNEL阳性细胞2。在治疗过程中,类器官不应因探针的触摸而分解。
- 用选定的毒性剂量的脱氧SA和非诺贝特处理类器官。
- 在DMSO中制备40mM非诺贝特储备溶液。在-20°C下储存长达1年。
- 制备药物治疗培养基:在 3 mL RDM+ 中,将 1 mM 脱氧 SA 储备溶液稀释至 1 μM 脱氧 SA,并将 40 mM 非诺贝特储备溶液稀释至 20 μM。
- 制备脱氧SA处理培养基:在3 mL RDM+中,将1 mM脱氧SA储备溶液稀释至1 μM脱氧SA,然后加入1.5 μLDMSO。
- 准备对照培养基:在 3 mL RDM+ 中,加入 3 μL 乙醇和 1.5 μL DMSO。
- 在使用无菌探针的解剖显微镜下,选择三组类器官,每组至少五个类器官。将这些组分成超低附着6孔板的单独孔。
- 将制备的处理(脱氧SA,脱氧SA +非诺贝特或对照)添加到类器官中。两天后,用补充有相应脱氧SA /非诺贝特/对照溶液的新鲜制备的RDM +更换孔中的培养基。
- 在治疗的第四天,进行步骤7以处理和测定细胞死亡的类器官(图2)。
7. 类器官的包埋和冷冻切片
- 通过将 1 mL 16% PFA 安瓿加入 3 mL PBS 中来准备新鲜的 4% PFA。
- 从类器官中取出RDM+培养基,并用PBS冲洗一次。从类器官中去除尽可能多的PBS。向类器官中加入 2 mL 新鲜制备的 4% PFA(PBS)并在室温下孵育 15 分钟。
- 孵育15分钟后,用2mL PBS冲洗类器官两次,然后在PBS中洗涤10分钟。
注意:在化学通风橱中进行固定,并将PFA溶液和两个后续PBS冲洗到储存在通风橱中的适当标记的PFA废物容器中。 - 吸出所有PBS,然后将20%蔗糖添加到固定的类器官中。确保类器官混合到蔗糖溶液中,并且不会残留在顶部的PBS气泡中。将类器官保持在蔗糖溶液中,直到它们沉入蔗糖溶液的底部,即在室温下~1小时。固定的类器官可以在4°C的蔗糖溶液中储存过夜。
- 将类器官嵌入冷冻切片模具中的OCT溶液中。每个条件可以将多个类器官嵌入到一个模具中。定向类器官,确保它们的最佳视网膜区域将在低温恒温器上横截面,并且类器官的中间都大致在同一平面上。将嵌入的类器官冷冻在-20°C。 嵌入的类器官可以在-80°C下储存多年。
注意:在冷冻OCT中很难看到类器官;将 RPE 簇朝向模具面向刀片的一侧,以方便类器官识别。 - 将类器官冷冻切片成 10-14 μm 厚的切片,并将切片粘附在聚 L 赖氨酸处理的载玻片上。冷冻切片时,在显微镜下反复检查载玻片,以确定包含类器官中间的部分。仅收集类器官的中间切片,其中所有层都均匀表示(图2A-C,图3)。切片后,载玻片可以在-80°C的载玻片盒中储存多年。
注意:在类器官末端拍摄的切片会对最外层的光感受器进行过度采样,不适合定量。平均大小的类器官将提供10-15个类器官中间的切片,代表分层视网膜层的横截面。
8. 凋亡细胞的TUNEL染色
- 在37°C下解冻冷冻载玻片30分钟。 立即将载玻片置于37°C可防止冷凝。浸泡在纯水中的组织样本会使组织变形。37°C孵育还可以改善组织与载玻片的粘附。
- 使用疏水笔在组织切片周围的载玻片上创建连续边框。这将提供一个边界,并确保使用少量溶液进行充分的固定和抗体孵育。加入约 100-200 μL(体积将填充疏水边界区域而不会溢出)新鲜制备的 4% PFA 20 分钟。在化学通风橱中进行固定,并将PFA溶液丢弃到储存在通风橱中的适当标记的PFA废物容器中。
- 在PBS中冲洗载玻片一次,然后在室温下在PBS中洗涤25分钟。
- 准备TUNEL混合物。从原位细胞死亡检测试剂盒中解冻紫色和蓝色小瓶。取出 100 μL 紫色小瓶溶液(可用于阴性对照),并将紫色小瓶中剩余的 450 μL 溶液与蓝色小瓶中的 50 μL 溶液混合。充分混合并保持在黑暗中。每组样品瓶(共 500 μL)可染色 5-10 张载玻片。
- 透化组织切片。
- 制备透化溶液:含有0.1%TritonX-100和0.1%柠檬酸钠的PBS
- 从样品载玻片中取出PBS,然后将透化溶液添加到样品中。在冰块上或在4°C下孵育2分钟。 之后,在PBS中冲洗一次,然后在PBS中洗涤10分钟。
- 取出PBS并使用折叠组织的一角尽可能多地擦干溶液。向样品中加入 50-100 μL 制备的 TUNEL 混合物,具体取决于疏水笔绘制的区域大小。用玻璃盖玻片盖盖,并在37°C下在黑暗中孵育1小时。
注意:以下步骤的所有孵育和洗涤均应在黑暗中进行,以防止荧光团漂白。使用暗盒或用铝箔覆盖载玻片以阻挡光线。 - 标记光感受器。用PBS冲洗一次,然后在PBS中洗涤20分钟。取出PBS,然后加入在PBS中用0.1%吐温和5%驴血清1:500稀释的一级恢复蛋白抗体(兔抗恢复蛋白)。在4°C孵育过夜。
- 去除一抗后,在PBS中冲洗一次,然后在PBS中洗涤20分钟。加入二抗,用橙色或红色荧光团的驴抗兔,在PBS中用0.1%吐温和5%驴血清1:1,000稀释,并在室温下孵育2小时。用PBS冲洗一次,然后在PBS中洗涤20分钟。在PBS中以1:1000加入DAPI,在室温下孵育10分钟。
- 用PBS冲洗一次,然后在PBS中洗涤20分钟。取出 PBS 并添加封片剂。加入盖玻片,用指甲油密封,在黑暗中晾干。载玻片可以在4°C的黑暗容器中储存长达1周。
注意:为了获得最佳图像质量,请在第二天拍摄图像。
9. 对类器官切片进行成像并量化死亡。
注意:成像需要能够区分三个荧光基团通道的共聚焦显微镜。该实验使用绿色(Alexa Fluor 488),橙色(Alexa Fluor 555)和UV(DAPI)通道。可以使用荧光团的任何组合,确保发射物不会渗入其他通道。
- 定位视网膜切片以进行成像和定量。在显微镜的低放大倍率(5x或10x)下,使用Recoverin染色(标记光感受器的细胞质)和DAPI染色(标记所有细胞的细胞核)来定位切片类器官的完整性,形状良好的区域,并且在对类器官的代表性横截面进行采样的平面中(图2 和 图3).找到一个具有至少几个细胞厚的光感受器明显外核层的部分,以及一个没有 Recoverin 染色的独立且独特的细胞核层(图 2 和 图 3)。
- 构图。将显微镜的放大倍率增加到20倍物镜,并框住载玻片,以尽可能多地填充感光层(图3)。
- 设置 Z 平面。如果使用对Z层进行成像的显微镜,则设置Z范围的上限和下限,以对切片的整个深度进行成像。对实验集中的所有图像使用相同的Z-stack厚度,以便在所有样品中测定相同数量的组织。如果不使用对Z轴堆栈进行成像的显微镜,请将图像聚焦到切片的中间。
- 对Z-stack采集中的所有三个荧光团通道进行成像。所有三个通道都需要阳性识别垂死的细胞。对每个类器官一个区域进行成像。
- 将图像集保存为保留每像素面积比例的文件格式。
10. 量化垂死细胞
- 在斐济(图像J)软件中打开图像堆栈。在 “生物格式导入选项 ”窗口中,确保未选中“拆分为单独窗口”部分下的框。在对齐的图像通道之间滚动对于正确识别单元格至关重要。
- 通过单击图像 > 堆栈展平 Z 堆栈图像集,然后从下拉菜单中选择“Z 项目”。这将创建一个用于量化的新图像。如果类器官未在 Z 系列中成像,请跳过此步骤。
- 选择显示 Recoverin 染色的图像通道(在本例中为红色)。单击工具栏中的 多边形选择工具 ,并在图像中勾勒出光感受器的连续区域(图3A)。单击分析 >设置测量值。在“ 设置 测量”弹出窗口中,选中“ 区域”旁边的框,单击 “分析 ”并选择“测量”以测量光感受器的面积(或按 “ m”作为快捷方式)以计数垂死细胞。面积测量将出现在弹出的测量窗口中。
- 计数先前选择的感光器区域中的TUNEL阳性细胞核(图3B,C)。右键单击工具栏中的点工具,然后选择多点工具。 仅在 TUNEL 通道中,单击与 DAPI 阳性细胞核重叠的 TUNEL 阳性染色和恢复蛋白染色。在通道之间切换以验证阳性细胞。
- 将TUNEL阳性细胞的数量除以面积,以获得每个类器官光感受器中细胞死亡的标准化值(图2D,E)。
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Representative Results
视网膜类器官由非MacTel对照iPSC系产生。类器官在培养中达到26周后,将它们选中并分成实验组。用不同浓度的脱氧SA处理类器官,以确定脱氧SA是否对光感受器有毒。测试四种浓度的脱氧SA,从0到1μM(图2),类器官处理8天,每隔一天更换一次培养基。响应脱氧SA的细胞死亡是浓度依赖性的,可在低至50nM脱氧SA中检测到(图2D)。测试的最高浓度1μM脱氧SA在保持视网膜类器官完整性的同时产生了强大的效果(图2B,D)。较高浓度的5μM脱氧SA在几天内导致类器官崩解(数据未显示)。脱氧SA剂量反应的结果为未来的毒性实验确定了脱氧SA的最佳浓度。1μM脱氧SA剂量导致大量细胞死亡而没有过饱和毒性,如在5μM观察到的那样。
为了测试非诺贝特拯救脱氧SA诱导的细胞死亡的能力,用1μM脱氧SA,1μM脱氧SA加20μM非诺贝特或无治疗载体对照处理视网膜类器官(图2A-C,E)。20μM非诺贝特处理防止了脱氧SA诱导的视网膜类器官光感受器毒性,在治疗4天后显着降低了约80%的细胞死亡(图2A-C,E)16。使用相同的方案测试了其他脂质改变药物,包括fumonosin-B1,其显示完全挽救了脱氧SA毒性。还测试了相关的脂质种类,以确定导致感光细胞死亡的特定下游鞘脂代谢物14。
图1:倒置光学显微镜下类器官的代表性明场图像 。 (A)分离后2天4周大的类器官显示适当的视网膜分层(白色*)或非视网膜类器官发育。(B)在第13周开发类器官。(C)第28周的视网膜类器官,具有清晰的视网膜分层和从外感光层(白条)突出的形成良好的外段。 请点击此处查看此图的大图。
图2:细胞死亡的代表性共聚焦图像。 用对照培养基 (A)、1 μM 脱氧 SA (B) 或 1 μM 脱氧 SA 与 20 μM 非诺贝特 (C) 处理 4 天后,视网膜类器官感光层(恢复蛋白,红色)内细胞死亡(TUNEL,绿色)的代表性共聚焦图像。(D)用不同浓度的脱氧SA处理视网膜类器官组织后人类光感受器细胞死亡的定量。(E)用对照培养基(n = 6),1μM脱氧SA(n = 22),1μM脱氧SA + 20μM非诺贝特(n = 21)处理视网膜类器官组织后人类光感受器细胞死亡的定量。*p<0.05, ***p<0.001,单因素方差分析和事后Tukey检验。数据来自New England Journal of Medicine,Gantner,M.,Eade,K.和Wallace。M.等人。黄斑疾病和周围神经病变中的丝氨酸和脂质代谢,381(15),1422-1433,版权所有©(2019)马萨诸塞州医学会。经许可转载。14请按此查看此图的大图。
图 3:屏幕截图显示了使用 FIJI 软件查看的用 1 μM 脱氧 SA 处理的切片和染色类器官的共聚焦图像。 荧光通道已分为α-Recoverin(A,红色),TUNEL(B,绿色)和DAPI(C,蓝色)。(A) 已使用工具栏(左上角)中选择的多边形工具勾勒出感光器区域的轮廓。(乙,丙)使用在工具栏中选择的多点工具对感光器层内的 TUNEL 阳性(B,绿色)和 DAPI 阳性(C,蓝色)细胞进行细胞计数。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
鉴别方案差异
自从Yoshiki Sasai的20组发明自形成光学杯以来,许多实验室已经开发了产生视网膜类器官的方案,这些类器官几乎可以在每一步5,18,19,21中变化。详尽的协议列表可以在Capowski等人22中找到。我们在这里提供的分化方案是一种简单、低干预的方案,为任何试图分化成熟视网膜类器官的实验室提供了一个良好的起点。鼓励用户探索和采用此协议的变体。方案变异的常见步骤是EB的产生和早期分化,以及使用BMP4,DKK-1或视黄酸等分化因子来提高效率5,19,23。
在大部分后期开发过程中,在摇床上培养类器官是提高分化效率和减少处理类器官所花费时间的有效步骤。生物反应器达到相同的目的24,然而,使用带有一次性锥形烧瓶的摇床更具成本效益,并且可以使用普通的实验室设备来完成。将类器官保持在移动悬浮液中的主要优点是,它消除了分离在生长时粘在平板上的类器官的需要。悬浮培养物还有助于更大的营养交换,因此类器官比标准蒸馏板上的类器官有生长更大的趋势。因此,最好在步骤4.1中尽可能小地对电镀EB进行碎片切割。
由于获得成熟的视网膜类器官需要对单一培养物进行近 6 个月的分化,因此与使用 2-D 单一培养相比,对视网膜类器官进行毒性测定似乎非常耗时。然而,毒性测定是在单一对照线上进行的,并且可以常规设置鉴别。在最初的6个月投资之后,将立即定期供应类器官以进行额外的实验和方案修改。每 1-2 个月启动 2-3 轮视网膜类器官分化,为复杂而彻底的实验组提供充足的组织。
类器官为靶向药物检测提供了通用模型。
该协议描述了光感受器毒性测定,以测试脂质改变药物拯救脱氧SL诱导的细胞死亡的功效。虽然这是一个特定的应用程序,显示了MacTel中致病因子的药理学拯救,但该协议可用于测试任何数量的侮辱(例如,营养缺乏,缺氧条件,光毒性)和药理学挽救。因此,它可以适应于模拟其他视网膜疾病。在我们自己的工作中,我们已经表明,通过使用相同的方案并替换直接阻断鞘脂代谢的各种相关鞘脂种类和药物,我们还能够通过确定导致感光细胞死亡的特定毒性下游鞘脂代谢物来提供对MacTel疾病机制的见解14.与需要建立变异型iPSC系的基因突变水平的疾病建模不同,使用类器官来模拟毒性代谢条件和环境应激源允许使用共同的对照iPSC系作为具有丰富且易于获得的组织来源的动态模型。
在研究视网膜代谢疾病时,人类类器官模型特别有利,其中不同的细胞类型具有独特的共生代谢相互作用,无法在光感受器样细胞的单一培养中复制4。这种复杂的代谢模型使我们能够发现药物非诺贝特直接在人类中预防脱氧SLs毒性作用的有效性。在脱氧SLs升高的小鼠模型中14 (未发表的数据)和脱氧SL代谢的小鼠胚胎成纤维细胞培养模型中,非诺贝特被证明是无效的16。在复杂的人体组织模型背景下测试药物将使我们能够确定有效的治疗方法,并忽略无效的治疗方法,否则如果我们只依靠小鼠或简单的单一栽培,就会错过这些治疗方法。
药物筛选的未来发展
在该协议中,我们量化光感受器(最丰富的细胞类型)中的细胞凋亡。然而,通过利用任何经过验证的抗体来特异性标记其他视网膜细胞类型,该协议可以修改以测定任何视网膜细胞类型或细胞亚型(例如,锥细胞与视杆细胞)的细胞死亡。在组织切片中使用TUNEL染色量化细胞凋亡的缺点是它是一种量化细胞死亡的低通量技术,限制了该测定在筛选少量候选药物上的应用。使用IHC方法进行更大的非靶向药物库筛选是不可行的。该协议的未来发展以促进更大的药物筛选将需要整合更容易量化的细胞死亡标志物。虽然这些是可用的,但视网膜类器官的大小不规则性、非视网膜组织附属物的存在与否以及感光层质量的可变性使得很难对类器官的结果进行标准化。我们预计,未来增加人类类器官疾病模型筛选大型药物库的通量的发展将大大提高我们发现、修改和验证药物的能力,这些药物将从临床前试验发展到批准的治疗方法。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
由洛伊医学研究所支持。我们要感谢Lowy家族对MacTel项目的支持。我们要感谢Mari Gantner,Mike Dorrell和Lea Scheppke的智力投入和协助准备手稿。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
125mL Erlenmeyer Flasks | VWR | 89095-258 | |
1-deoxysphinganine | Avanti | 860493 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
D-(+)-Sucrose | VWR | 97061-432 | |
DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
Dispase II, powder | Gibco | 17105041 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 11995073 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
FBS, Heat Inactivated | Corning | 45001-108 | |
Fenofibrate | Sigma | F6020 | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | |
Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Pierce 16% Formaldehyde | Thermo-fisher | 28906 | |
Rabbit anti-Recoverin antibody | Millipore | AB5585 | |
Sodium Citrate | Sigma | W302600 | |
Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
Taurine | Sigma | T0625 | |
Tissue Plus- O.C.T. compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Tween-20 | Sigma | P1379 | |
Ultra-Low Attachment 6 well Plates | Corning | 29443-030 | |
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
Vacuum Filtration System | VWR | 10040-436 | |
Vectashield-mounting medium | vector Labs | H-1000 | |
wax pen-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) | Sigma | Y0503 |
References
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