Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Anvendelse af CRISPR-interferens (CRISPRi) til genhæmning i patogene arter af Leptospira

Published: August 14, 2021 doi: 10.3791/62631
Automatic Translation
1,2, 1, *2, *1
1Infectious Bacterial Diseases Research Unit, National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Laboratório de Desenvolvimento de Vacinas, Instituto Butantan
* These authors contributed equally

Summary

Her beskrives anvendelsen af CRISPR-interferens (CRISPRi) til specifik genhæmning i Leptospira-arter. Leptospira celler omdannes ved bøjning med plasmider udtrykke dCas9 (katalytisk "døde" Cas9) og en enkelt-guide RNA (sgRNA), der er ansvarlig for base parring til det ønskede genomiske mål. Metoder til validering af genhæmning præsenteres.

Abstract

Leptospirose er en global forsømt zoonose, der er ansvarlig for mindst 1 million tilfælde om året og næsten 60 tusind dødsfald. Sygdommen er forårsaget af patogene og virulente bakterier af slægten Leptospira, enten ved direkte kontakt med bakterierne eller indirekte ved udsættelse for forurenet vand eller jord. Husdyr og vilde dyr fungerer som reservoirværter for infektion og kaster leptospirer fra koloniserede nyrerør i nyrerne via urin i miljøet. Generering af mutantstammer af Leptospira er afgørende for at evaluere og forstå patogene infektionsmekanismer. CRISPR interferens (CRISPRi) har vist sig at være et ligetil, overkommeligt og specifikt værktøj til genhæmning i patogen Leptospira. Derfor vil de metodologiske detaljer for opnåelse af plasmidkonstruktioner, der indeholder både dCas9 og guide RNA, levering af plasmider til Leptospira ved bøjning med E. coli-stammen β2163 og transkonjugant genopretning og evaluering, blive beskrevet. Derudover giver de nyligt beskrevne Hornsby-Alt-Nally (HAN) medier mulighed for relativt hurtig isolation og udvælgelse af mutantkolonier på agarplader.

Introduction

Leptospirose er en forsømt verdensomspændende zoonose forårsaget af patogene og virulente arter af slægten Leptospira. Hos mennesker tegner sygdommen sig for mere end en million tilfælde og 60.000 dødsfald om året på verdensplan1,2. Indtil videre er der ingen langsigtet og effektiv vaccine mod sygdommen. Identifikationen af virulensfaktorer og patogene mekanismer er afgørende for udviklingen af bedre terapeutiske og profylaktiske strategier. Derfor er evnen til at generere genetiske mutationer og vurdere den resulterende fænotype afgørende for funktionel genomisk analyse3.

Opførelsen af mutanter i patogen Leptospira blev indtil nu betragtet som i sagens natur ineffektiv, besværlig, dyr og vanskelig at gennemføre. Dette scenarie ændrede sig drastisk med anvendelsen af crispr-interferensen (CRISPRi) for nylig på saprofytiske4 og patogene5 leptospirer.

Genhæmning opnås ved at udtrykke to komponenter: en variant af CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated) enzyme Cas9 fra Streptococcus pyogenes, kaldet katalytisk døde Cas9 (dCas9) og en single-guide RNA (sgRNA), der kan redigeres i henhold til det ønskede mål6,7,8. dCas9-protein, når det er bundet til sgRNA, dirigeres til specifikke DNA-mål af Watson og Crick-baseparring, hvilket forårsager en sterisk blokering til RNA polymeraseforlængelse, hvilket resulterer i genhæmning på grund af den blokerede gentransskription7 (Figur 1).

Dette manuskript har til formål at beskrive opførelsen af plasmid for at udtrykke både dCas9 og sgRNA, bøjning mellem donor E. coli β2163 og modtager Leptospira celler, transkonjugant opsving, og endelig validering af udvalgte mutant kolonier.

Protocol

1. Protospacer definition og plasmid konstruktion

BEMÆRK: I dette afsnit beskrives det første trin i udvælgelsen af passende protospacers til konstruktion af sgRNA og yderligere ligation i pMaOri.dCas9 (Figur 1). Denne protospacer sekvens består af en 20 nukleotider sekvens mod det ønskede mål.

  1. Få nukleotidsekvensen af det gen, der er af interesse for lyddæmpning i GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Indsend den til CHOPCHOP webserveren (http://chopchop.cbu.uib.no/), med parametre defineret for Streptococcus pyogenes Cas9 og protospacer tilstødende motiv NGG efter valg af "Fasta Target". Definer parametrene til "CRISPR/Cas9" og PAM (protospacer tilstødende motiv) NGG.
  2. Baseret på de opnåede resultater skal du vælge protospacere med den bedst mulige score (grøn pil), der er placeret så tæt som muligt på kodningsområdets 5'er og vigtigst af alt er indeholdt i skabelonstrengen (minus), da sgRNA skal parres til kodningsstrengen af genet for fuldstændig genhæmning.
    BEMÆRK: NGG-motivet er ikke inkluderet i den endelige sgRNA-sekvens.
  3. Brug lipL32-promotoren til at udtrykke det enkelte styre RNA, der indeholder en variabel 20 nukleotidsekvens i 5'erens ende og en bevaret dCas9 stilladssekvens. Fletning af 20-nt-sekvensen, 20-nt-sekvensen, 20-2, til lipL32-promotoren (i slutningen af 5' ende) og sgRNA-stilladset (3'end)(figur 1B).
    BEMÆRK: For en veldefineret lipL32 promotor, udnytte initiativtageren region bestående af -334 til TSS (Transskribering Start Site, baseret på Zhukova et al.9). Kontroller den supplerende fil for den endelige sgRNA-kassette.
  4. Generer sgRNA-kassetten ved sekventiel PCR5, eller få den syntetiseret af en kommerciel udbyder.
  5. Efter at have fået kassetten, ligate det i pMaOri.dCas9 plasmid på XmaI begrænsning site i begge ender (cccggg)4.
    1. Både sgRNA-kassetten og pMaOri.dCas9 plasmid med XmaI-restriktionsenzym fordøjes og fortsættes med ligation (figur 1B).
    2. Udfør kloningstrinnene i dT auxotrophic E. coli stamme π110, på grund af pMaOri11 (og i forlængelse heraf pMaOri.dCas9) oprindelsen af replikation, R6K-gamma.
      BEMÆRK: For en detaljeret protokol for ligation og klon udvælgelse, henvises til tidligere publikationer af Fernandes og Nascimento12. sgRNA-styrede dCas9 binder sig til kodningsstrengen i det valgte gen af interesse og vil derfor hindre RNA polymerase-forlængelse (figur 1C), hvilket resulterer i genhæmning.

2. Leptospira transformation ved bøjning

BEMÆRK: Et grafisk skema af dette trin er præsenteret i figur 2. For at gøre HAN medier og HAN plader, henvises til Hornsby et al.13 og Fernandes et al.5.

  1. Der dyrkes patogene Leptospira-celler ved 29 eller 37 °C i HAN-medier13 under omrøring ved at fortynde en mættet dyrkning i frisk HAN kl. typisk tager L. interrogans serovar Copenhageni stamme Fiocruz L1-130 4-6 dage at nå den rette celletæthed.
    1. Sørg for, at kulturer når en O.D. på 0,2-0,4 ved 420 nm (2 til 5 x 108 celler/mL), før de bruges til bøjning.
      BEMÆRK: Da HAN medier skifter farve som celletætheder stigning (på grund af phenol rød indeholdt i DMEM medier), centrifuge (4.000 x g, 15 min, stuetemperatur) 1 mL af kulturen medier til at fjerne leptospires og anvende supernatant som en blank til måling af O.D.
  2. Den konjugative E. coli-stamme β2163, auxotrofisk for Diaminopimelic acid (DAP), omdannes med plasmid pMaOri.dCas9, der indeholder sgRNA-kassetten. For E. coli-transformation, skal du enten bruge varmechokprotokoller eller elektroporation. Medtag transformation med plasmid pMaOri.dCas9 uden sgRNA-kassette som kontrol.
    1. Til varmechoktransformation blandes plasmid-DNA 'et (100 ng) med kemisk kompetente E. coli-celler og inkuberes på is i 30 min. Udfør varmechok ved 42 °C i 90 s, og placer det igen på is i 5 min. Cellerne genvindes ved at tilsætte 1 mL LB-medier, inkuberes ved 37 °C i 1 time, og platingen fortsættes.
    2. Til elektroporation skal du bruge elektrokompetente celler blandet med 100 ng plasmid DNA. Brug følgende parametre for puls: 1,8 kV, 100 Ω og 25 μF. Gendan cellerne som forklaret ovenfor.
    3. Plade den omdannede donor E. coli celler i LB agar medium suppleret med Diaminopimelic syre (DAP) (0,3 mM) og spectinomycin (40 μg/mL) for at vælge efter plasmider.
  3. Til bøjning skal du vælge en koloni fra hver plade en dag før dagen for bøjning (som bestemmes ved at overvåge O.D. af kulturer af leptospires).
    1. Vælg en koloni af E. coli β2163 fra den tomme pMaOri.dCas9, og en fra pMaOri.dCas9sgRNA plader. Lad dem vokse natten over i 10 ml LB plus DAP og spectinomycin ved 37 °C.
    2. Den næste dag fortyndes de mættede kulturer 1:100 i 10 mL frisk LB plus DAP (omfatter ikke antibiotika her) indtil OD420nm af 0,2-0,4. Normalt tager det 2-3 timer for E. coli at nå disse tætheder.
  4. Inde i en BSL2 biosikkerhedshætte samles et filtreringsapparat ved at placere en diameter på 25 mm, 0,1 μm porestørrelse, blandede celluloseestere membranfilter på toppen af glasbasen. Placer en 15 mL glastragt på toppen og hold begge stykker med fjederklemmer. Tilslut glasset til en vakuumpumpe og tilsæt kulturerne til tragten til filtrering.
  5. Tilsæt 5 mL Leptospira-kultur til tragten. Tilføj et volumen af E. coli for at udgøre 1:1-andelen baseret på OD420nm-værdierne i begge kulturer. Tænd vakuumpumpen og koncentrer cellerne ved filtrering. Efter cellekoncentration i membranfilteret skal du forsigtigt hente det. Sørg for, at mediet filtreres gennem membranen.
    BEMÆRK: Filtrering tager 5 til 10 min.
  6. Filteret anbringes på en emjh-plade (se materialetabel)suppleret med DAP (0,3 mM). Sørg for, at bakterier side er op. Pladerne inkuberes ved 29 °C i 24 timer.
    BEMÆRK: Hvis der anvendes HAN eller supplerede interne EMJH14 plader, kan E. coli formere sig og overvinde den tilsigtede 1:1-andel, hvilket igen kan reducere bøjningseffektiviteten5.
  7. Efter 24 timer genvindes filtrene fra pladerne og placeres hvert enkelt filter i et 50 mL konisk rør.
  8. Brug 1 mL flydende HAN-medium til at frigøre cellerne fra filteroverfladen ved omfattende pipetter og hvirvler.
  9. Visualiser de genvundne blandede bakterielle opløsninger ved mørk feltmikroskopi for at kontrollere, om cellens levedygtighed og bevægelighed er, og Leptospira:E. coli-proportioner.
    BEMÆRK: På nuværende tidspunkt kan der ses tilsvarende antal E. coli og Leptospira.
  10. 100-200 μL af denne dyrkning spredes på HAN-plader med et inaktiveret kaninserum på 0,4% og 40 μg/mL spectinomycin. Plader med 37 °C inkuberes i en 3% CO2-atmosfære.
    BEMÆRK: Normalt danner L. interrogans serovar Copenhageni stamme Fiocruz L1-130 celler kolonier i 5-7 dage på kontrolplader og i 8-10 dage på spectinomycin plader. På nuværende tidspunkt vil E. coli ikke vokse, da de er auxotrofiske for DAP.
  11. Som kontrol fortyndes kulturer ved 104 leptospires/mL og tilsættes 100 μL på plader uden antibiotika til overvågning af leptospiralvækst.

3. Koloni udvælgelse og transkonjugant vækst og validering

BEMÆRK: Kolonier skal være synlige ved dag 10. De er dog ikke for lette at visualisere. Normalt på dette tidspunkt, HAN plader er en smule uigennemsigtig på grund af de tørrede celler, der blev spredt og Leptospira kolonier kan fremstå som en gennemsigtig glorie mod den hvide baggrund. Det anbefales at se pladerne i forskellige vinkler for at opnå forskellige lysforekomster, hvilket gør kolonierne mere synlige. Ved længere inkubationstider kan kolonier erhverve et tættere udseende, og i dette tilfælde præsenterer de mælkefarvede glorier mod en mørk baggrund.

  1. Der tilsættes 100 μL flydende HAN-medier til hvert 1,5 mL mikrorør for at genvinde mutanter. Tag mindst 3 kolonier fra hver plade.
    1. Ved hjælp af en micropipette tip, "grave" agaren for at hente kolonierne fra pladerne, da leptospirale kolonier kan være undergrunden.
      BEMÆRK: Agar forventes at blive taget med på dette tidspunkt. Kolonier skal tages fra kontrolplader, der indeholder tomme pMaOri.dCas9 plasmid, og plader med leptospires indeholdende plasmider, der udtrykker både dCas9 og enkelt guide RNA, designet til målgenet.
    2. Dispenser den indsamlede koloni i 100 μL HAN medier i en 1,5 mL mikrorør og kraftigt homogenisere. På dette tidspunkt skal du sikre maksimal pause af agarens integritet for at frigive celler. Vortex suspensionen i 10 s.
  2. De genvundne celler visualiseres ved hjælp af mørk feltmikroskopi ved en forstørrelse på 200-400x ved at lægge et fald på 5 μL på en glasrutsjebane og straks dække prøverne med en coverlip.
    1. Bekræft tilstedeværelsen af levende og levedygtige leptospirer genvundet fra kolonierne.
    2. Efter visualisering og bekræftelse af levedygtige leptospirer overføres 100 μL celler til flydende HAN-medier, der indeholder 40 μg/mL spectinomycin.
  3. Efter vækst i flydende HAN medier, evaluere kulturer for tilstedeværelsen af plasmid med primer pMaOri2 F (ACGCAATGTATCGATACCGAC) og R (ATAGGTGAAGTAGGCCCACCC), som anerkender den region, der flankerer sgRNA kassette.
    1. 200 μL kultur, centrifuge (4.000 x g, 15 min), udsmid supernatanten, og genbrug den resulterende pellet i 20 μL vand.
    2. Brug denne affjedring som skabelon til yderligere PCR uden behov forDNA-ekstraktion 12.
      BEMÆRK: Celler med pMaOri.dCas9 vil gøre en amplicon på 281 bp, sammenlignet med dem, der indeholder plasmider med sgRNA kassette, som vil gøre en amplicon på 723 bp.
  4. For bekræftelse af genhæmning skal du udføre en immunoblot ved hjælp af celleekstrakter fra transkonjuganter, der kun indeholder pMaOri.dCas9 (negativ kontrol) og pMaOri.dCas9sgRNA.
    1. Det svarer til 5 x 107 celler pr. bane af natriumdodecylsulfatgelen (SDS).
    2. Electrotransfer proteiner til en membran til inkubation med passende antistoffer. Ud over antistoffet mod målgenet til lyddæmpning skal du bruge et andet til lastningskontrol.
  5. Hold mutantkulturerne i HAN-medier plus spectinomycin for at opretholde plasmidet. Hvis der ikke påføres antibiotika på medierne, kan fuldstændig genhæmning observeres i mindst tre passager5.

Representative Results

Selv om CG indhold i Leptospira spp. genomer er typisk omkring 35%; stort set alle gener vil sandsynligvis indeholde PAM 5'NGG 3'; dette motiv skal tages i betragtning i skabelonstrengen. Når kodningssekvensen for et gen (fra start til stop-kodoner) er baseret på CHOPCHOP-resultaterne, skal protospacers vælges ved minus (-, skabelon) strengen. Det er vigtigt ikke at medtage NGG-motivet i 20-nt sgRNA protospacer.

Hvis der udføres bøjning med en 1:1 donor:recipient celle proportion, i 24 timer på overfladen af EMJH agar plader plus DAP, og 200 μL af den genvundne bakteriel suspension spredes på HAN plus spectinomycin agar plader, transkonjugants kolonier bør være synlige på ca 8-10 dage. Spredning af dette volumen resulterer normalt i 20-40 kolonier pr. plade (Figur 3A). For at kontrollere celle levedygtighed efter bøjning, celler kan spredes på HAN plader uden antibiotika udvælgelse. I dette tilfælde kan kolonier observeres så snart 7 dage. HAN plader bliver lysegule i en 3% CO2 atmosfære.

Efter koloniplukning og vækst i flydende medier plus spectinomycin kan PCR, der bruger hele celler og pMaOri2 primere, bruges til en indledende kvalitetskontrol af transkonjuganterne (Figur 3B). Leptospirale celler, der indeholder kontrol pMaOri.dCas9 plasmid bør resultere i en amplicon på 281 bp, mens de celler, der indeholder plasmid til lyddæmpning, det vil sige, der indeholder både dCas9 og sgRNA, bør resultere i en 723 bp amplicon. pMaOri2 F og R primere blev designet til at flankere XmaI begrænsning site, som er det sted, der anvendes under sgRNA kassette ligation.

Med bekræftelse af plasmid tilstedeværelse, celler kan høstes fra medierne, vaskes to gange med PBS, og derefter bruges til at forberede en hel-celle ekstrakt til immunoblotting. Hvis lyddæmpningen fandt sted, skal målproteinerne, i dette tilfælde enten LipL32 eller både LigA og LigB, kun observeres i de vilde typeceller og i dem, der indeholder pMaOri.dCas9; selv med højere eksponeringstider bør der ikke være synlige tilsvarende proteiner i de celler, der indeholder pMaOri.dCas9sgRNA (Figur 3C).

Hvis der planlægges forsøg med at vurdere leptospiral virulens efter genhæmning, bør de kulturer, der anvendes til bøjning, være lav passage virulent Leptospira. Efter genhæmning er bekræftet, kan flere aliquots fryses som en backup. Hvis det tavse gen har en målbar fænotype, f.eks. baseret på tidligere arbejde med rekombinante proteiner, kan kulturer bruges til validering, og i dette tilfælde kan celler, der kun indeholder pMaOri.dCas9, medtages som en negativ kontrol.

Figure 1
Figur 1: Udvikling af dCas9 og sgRNA, der udtrykker plasmid. (A) Der vælges en 20-nt lang protospacer efterfulgt af S. pyogenes dCas9 PAM 5'-NGG-3', inden for målgenets skabelonstreng, så det efterfølgende sgRNA kan udføre Watson- og Crick-basisparring til den tilsvarende kodningsstreng, hvilket resulterer i fuldstændig genhæmning. (B) SgRNA-kassetten består af lipL32-promotoren, 20-nt protospacer og dCas9-stilladset. pMaOri.dCas9 plasmid bruges som rygrad til sgRNA kassette ligation på XmaI begrænsning site. Den resulterende plasmid, hed pMaOri.dCas9sgRNA leveres til leptospires, og udtrykket af både dCas9 og sgRNA er ansvarlig for genhæmning. (C) sgRNA-rettet dCas9 fungerer som en fysisk barriere for RNA polymerase forlængelse, derfor hæmmer transskribering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2:Skematisk repræsentation af bøjningsprotokollen. Den ønskede Leptospira arter dyrkes i HAN medier, under agitation, indtil O.D. på 0,2-0,4 (mid-log fase) på 420 nm. En dag før bøjningen plukkes en koloni af rekombinant donor E. coli β2163 indeholdende plasmid af interesse fra LB +DAP+Spc agar plader, da celler dyrkes natten over i flydende LB med samme tilskud. Den næste dag, mættet E. coli kulturer fortyndes i LB plus DAP og dyrkes indtil O.D. på 0,2-0,4 ved 420 nm. Både donor E. coli og modtager Leptospira blandes ved 1:1 celle proportion på overfladen af et 0,1 μm filter af et filtreringsapparat under undertryk. Derefter placeres filtrene oven på EMJH agarpladerne suppleret med DAP, og inkubationsprovenuet fortsætter i 24 timer ved 29 °C. Brugen af EMJH begrænser E. coli-spredning, og den tilsigtede 1:1-andel opretholdes. Bakterier genvindes fra filtre ved pipetter med 1 mL HAN medier, og suspensioner visualiseres under darkfield mikroskopi. Endelig er 100-200 μL af hver suspension seedet på HAN agar plader indeholdende 0,4% kanin serum og inkuberes ved 37 °C i 3% CO2. På nuværende tidspunkt udelades DAP, og som følge heraf vil auxotrophic E. coli ikke vokse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative resultater for mutanternes vurdering. Rekombinant celler kan valideres af PCR med primere flankerende XmaI site inden pMaOri.dCas9. (B) I dette tilfælde resulterede celler, der indeholder pMaOri.dCas9, kun i en amplicon på 281 bp, mens de celler, der indeholdt plasmidet til lyddæmpning, indeholdende både dCas9 og sgRNA, viste en 723 bp amplicon. Efter bekræftelse af tilstedeværelsen af plasmiderne blev genhæmning valideret ved immunoblotanalyse. (C) Inkubation med antistoffer mod både målprotein og et belastningskontrolprotein anbefales i den repræsentative immunoblot vises hele celleekstrakter fra transkonjuganter, der indeholder pMaOri.dCas9 alene eller med sgRNA-kassetter rettet mod lipL32 (pMaOri.dCas9sgRNAlipL32), og både LigA og LigB (pMaOri.dCas9sgRNAligAB) gener vises. Co-inkubation med anti-LipL32, anti-LigAB og anti-LipL41 (ikke-mål, lastning kontrol) bekræfter, at udtrykket af LipL32 protein er afskaffet i celler, der indeholder pMaOri.dCas9sgRNAlipL32 og både LigA og LigB i celler, der indeholder pMaOri.dCas9sgRNAligAB. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil: Enkelt guide RNA (sgRNA) kassette sekvens. Den sgRNA transskription er instrueret af den konstituerende lipL32 promotor (fed nukleotider). sgRNA består af 20 nukleotider, der henviser til protospaceren, der er ansvarlig for basisparring til målgenets kodningsstreng, og dCas9 stilladssekvens (understregede nukleotider). Xma I begrænsning steder (cccggg) er inkluderet i begge ender for ligation på pMaOri.dCas9 plasmid. Klik her for at hente denne fil.

Discussion

Efter den tidlige sekventering af patogene15,16,17,18 og saprofytiske19 Leptospira arter, data mining af genomet kaste lys over flere aspekter af leptospiral patogenese. I de fleste tilfælde blev proteinfunktionen udforsket ved hjælp af den rekombinante modstykke til formodede leptospirale overfladeeksponerede proteiner og efterfølgende spekulation i den oprindelige proteinfunktion20,21,22,23,24,25,26.

Generering af mutanter og evaluering af deres respektive fænotype er nøglekomponenter i funktionel genomanalyse. De første forsøg på at generere mutanter i Leptospira spp. blev opnået ved tilfældig transposon mutagenesis27,28,29,30; men efter omfattende og besværlig analyse for at udlede identiteten af forstyrrede gener blev det bemærket, at kun 15% af alle gener i L. interrogans serovar Manilae blev forstyrret27. Målrettet gen knockout blev yderligere opnået ved homolog rekombination udnytte selvmord plasmider til at levere en antibiotikaresistens kassette flankeret af homologe arme inden for det ønskede mål31,32.

Ved at anvende disse teknologier blev flere aspekter af leptospiral grundlæggende biologi og virulens udforsket31,33,34,35,36,37. Udviklingen af E. coli-Leptospira konjugativ shuttle vektor, pMaOri 11, tillod levering af komponenter til episomal genhæmning.

Det blev tidligere påvist, at Cas9-induceret dobbeltstrengsbrud er dødelig for Leptospira spp., og som et alternativ kan den katalytisk inaktive variant af enzymet dCas9 bruges til at opnå genhæmning hos både saprofytiske og patogene arter4,5. Ved at bruge plasmid pMaOri.dCas9 som rygrad for sgRNA kassette ligation, specifikke og stabile genhæmning kan opnås på grund af udtryk for både dCas9 og sgRNA; dCas9-bundet sgRNA vil føre proteinet til det ønskede mål ved Watson-Crick base parring.

For fuldstændig genhæmning skal protospaceren designes på basis af skabelonstrengen i det ønskede gen, så baseparring af sgRNA sker med kodningsstrengen. Baseret på et gennemsnitligt C +G-indhold på 35% i Leptospira spp., vil PAM 5'-NGG-3' forekomme mindst 3 gange hver 100 bp. Derfor vil stort set ethvert gen inden for Leptospiras genom indeholde mindst én PAM. Men hvis motivet NGG ikke findes, kan det alternative NAG-motiv evalueres.

Tidligere genhæmningsteknikker, såsom zinkfingre og TALE (transskriptionsaktivatorlignende effektorer), stolede på opførelsen af et andet protein til hvert mål, hvilket gjorde disse teknikker besværlige og dyre38. I CRISPRi's tilfælde er den variable komponent sgRNA, hvilket gør det nødvendigt kun at ændre de 20 bp ved 5's ende. Komplet, stabil, og målrettet genhæmning er blevet observeret ikke kun i Leptospira spp.4,5, men også i andre bakterier8,39,40,41.

Udviklingen af HAN medier13 begunstiget inddrivelse af mutanter ved drastisk at reducere inkubation tid til koloni dannelse og giver Leptospira til at vokse på 37 oC. Under bøjningstrinnet anbefales det imidlertid ikke at anvende det, da E. coli kraftigt kan formere sig i dette medie og overvinde den tilsigtede 1:1-andel mellem donor- og recipientceller. På nuværende tidspunkt er EMJH plus DAP det bedste valg, da E. coli replikerer dårligt i disse medier. Det er værd at nævne, at nogle laboratorier gør in-house suppleret EMJH, som kan indeholde yderligere komponenter, der også kan understøtte væksten af E. coli celler.

Bøjningsprotokollen, der blev præsenteret her, blev optimeret til L. interrogans serovar Copenhageni stamme Fiocruz L1-130, og det blev også vist sig at være effektivt i omdannelsen af en nyligt isoleret patogen stamme fra jordprøver5. Indledende forsøg med forskellige serovars af L. borgpetersenii arter indikerer lavere bøjningseffektivitet med den beskrevne protokol. Når der arbejdes med forskellige arter/serovarer af Leptospira, bør optimale betingelser for bøjning således bestemmes empirisk under hensyntagen til donor-/modtagercelleproportioner, indledende celletætheder, bøjningsmedier og tid (24 og 48 timer). Det er rimeligt at antage, at forskellige Leptospira arter og serovars vil opføre sig anderledes med forskellige bøjning protokoller.

Selvom saprofytiske Leptospira kolonier er relativt nemme at visualisere på plader, kan patogene kolonier være vanskeligere at observere. Normalt, ved hjælp af HAN medier suppleret med 0,4% kanin serum og spectinomycin, transkonjugant kolonier kan observeres på dag 10. Det er vores erfaring, kolonier oprindeligt til stede som en gennemsigtig glorie på medieoverfladen. I videoprotokollen vises tættere kolonier efter 14 dages vækst, da de gennemsigtige var vanskelige at filme. På dette stadium kan rotation af pladen for at opnå forskellig lysforekomst og skift mellem hvide og mørke baggrunde hjælpe med at identificere kolonier.

For mutant validering, immunoblotting tilbyder en enkel tilgang; Da antistoffer imidlertid ikke altid er tilgængelige mod målproteiner, kan der forfølges alternative strategier til validering af genhæmning. Kvantitativ reverse-transcriptase PCR (qRT-PCR) ved hjælp af primere til målgenet og en konstituerende kontrol er effektiv til at validere genhæmning, da sgRNA-guidede dCas9 er ansvarlig for blokering af gentransskription. Hvis målgenet koder et klart defineret proteinbånd i proteingeler, kan SDS-PAGE demonstrere lyddæmpning, og i henhold til lipL32-genhæmningen5. Hvis LPS biosyntesegener bringes til tavshed, kan LPS-farvning anvendes; i tilfælde af lyddæmpning af gener, der kodning for enzymer med veldefinerede substrater, er kinetiske assays med kromogene substrater gyldige strategier β-galactosidase silencing i L. biflexa blev valideret ved brug af X-gal og ONPG (ortho-Nitrophenyl-β-galactoside) substrater4.

Efter bekræftelse af genhæmning kan eksperimenter udformes med henblik på yderligere at evaluere fænotype. Bindende assays kan udføres i tilfælde af lyddæmpning af bakterielle klæbemidler; serum-udfordringsanalyser bekræftede LigA's og LigB's rolle i serumoverlevelse, der vises af patogene Leptospira5. Mutanter kan også bruges til at vaccinere dyr for at vurdere afdæmpning af virulens; i dette tilfælde bør dyr, der er podet med mutanten, kun sammenlignes med dyr, der er inficeret med celler, der indeholder pMaOri.dCas9.

Afslutningsvis beskriver den nuværende protokol anvendelsen af CRISPRi til genhæmning hos patogene Leptospira-arter ved hjælp af HAN-medier for at lette mutantgenvinding inden for 10 dage. Genhæmning kombineret med funktionel genomisk analyse vil forbedre vores forståelse af patogene mekanismer i Leptospira, og i sidste ende føre til udvikling af bedre profylaktiske strategier for sygdomsbekæmpelse.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

USDA er en lige muligheder udbyder og arbejdsgiver. Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne publikation er udelukkende med det formål at give specifikke oplysninger, og indebærer ikke anbefaling eller godkendelse af det amerikanske landbrugsministerium. Det brasilianske agentur FAPESP (tilskud 2014/50981-0) støttede dette arbejde økonomisk; LGVF er finansieret med et stipendium fra FAPESP (2017/06731-8 og 2019/20302-8). Finansieringskilderne havde ingen rolle i udformningen af undersøgelser, dataindsamling og -analyse, beslutningen om at offentliggøre eller manuskriptforberedelse. Forfatterne takker også Hannah Hill og Alexander Grimes fra USDA Visual Services for at filme og redigere videoprotokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 µm pore size mixed cellulose esters membrane Millipore VCWP02500 Filtration for bacterial conjugation
2,6-Diaminopimelic acid (DAP) Sigma D1377 Growth of auxotrophic E. coli β2163
Agar Noble BD & Company 214230 Used for preparation of solid EMJH and HAN plates
Bacto Agar BD & Company 214010 Used for preparation of solid LB plates
Clarity Western ECL substrate Biorad 170-5060 Chemiluminescent substrate
dNTP set Thermo Fisher 10297-018 dNTPs for PCR reaction
Glass Microanalysis Filter Holder Millipore XX1012530 Filtration for bacterial conjugation
Imaging System Biorad ChemiDoc MP Chemiluminescence detection
LB broth, Miller BD & Company 244620 Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
Leptospira Enrichment EMJH BD & Company 279510 Supplementation of EMJH media
Leptospira Medium Base EMJH BD & Company 279410 EMJH medium for Leptospira
Mini-PROTEAN TGX Gels 12% Biorad 4568043 Used for polyacrylamide gel eletrophoresis
Optical density reader Molecular Devices SpectraMax M2 For optical density measurements of bacterial cultures
Phosphate Buffered Saline 7.4 Sigma 806552 Saline solution for washing bacterial pellets
Spectinomycin Sigma S0692 Selection of pMaOri backbone plasmids
Taq DNA Polymerase Thermo Fisher EP0402 Enyme, buffer and MgCl2 for PCR reaction
Thermocycler Applied Biosystem GeneAmp PCR System 9700 Used for PCR reaction cycling
Thymidine (dT) Sigma T9250 Growth of auxotrophic E. coli π1
XmaI restriction enzyme New Englan BioLabs R0180L Digestion of plasmids and inserts

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bharti, A. R., et al. Leptospirosis: A zoonotic disease of global importance. Lancet Infectious Disease. 3 (12), 757-771 (2003).
  2. Costa, F., et al. Global morbidity and mortality of Leptospirosis: A systematic review. PLoS Neglected Tropical Disease. 9 (9), 0003898 (2015).
  3. Shapiro, R. S., et al. A CRISPR-Cas9-based gene drive platform for genetic interaction analysis in Candida albicans. Nature Microbiology. 3 (1), 73-82 (2018).
  4. Fernandes, L. G. V., et al. Gene silencing based on RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9): a new tool for genetic engineering in Leptospira. Science Reports. 9 (1), 1839 (2019).
  5. Fernandes, L. G. V., Hornsby, R. L., Nascimento, A. L. T. O., Nally, J. E. Genetic manipulation of pathogenic Leptospira: CRISPR interference (CRISPRi)-mediated gene silencing and rapid mutant recovery at 37 C. Science Reports. 11 (1), 1768 (2021).
  6. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  7. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  8. Choudhary, E., Thakur, P., Pareek, M., Agarwal, N. Gene silencing by CRISPR interference in mycobacteria. Nature Communication. 6, 6267 (2015).
  9. Zhukova, A., et al. Genome-wide transcriptional start site mapping and sRNA identification in the pathogen. Frontiers in Cell and Infectious Microbiology. 7, 10 (2017).
  10. Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPalpha) conjugative machineries, and their cognate Escherichia coli host strains. Research in Microbiology. 156 (2), 245-255 (2005).
  11. Pappas, C. J., Benaroudj, N., Picardeau, M. A replicative plasmid vector allows efficient complementation of pathogenic Leptospira strains. Applied Environmental Microbiology. 81 (9), 3176-3181 (2015).
  12. Fernandes, L. G. V., Nascimento, A. L. T. O. Specific gene silencing in Leptospira biflexa by RNA-guided catalytically inactive Cas9 (dCas9). Methods in Molecular Biology. 2134, 109-122 (2020).
  13. Hornsby, R. L., Alt, D. P., Nally, J. E. Isolation and propagation of leptospires at 37 °C directly from the mammalian host. Science Reports. 10 (1), 9620 (2020).
  14. Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 12, Unit 12E.12 (2006).
  15. Nascimento, A. L., et al. Comparative genomics of two Leptospira interrogans serovars reveals novel insights into physiology and pathogenesis. Journal of Bacteriology. 186 (7), 2164-2172 (2004).
  16. Nascimento, A. L., et al. Genome features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Brazillian Journal of Medical Biology Research. 37 (4), 459-477 (2004).
  17. Ren, S. X., et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature. 422 (6934), 888-893 (2003).
  18. Bulach, D. M., et al. Genome reduction in Leptospira borgpetersenii reflects limited transmission potential. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (39), 14560-14565 (2006).
  19. Picardeau, M., et al. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis. PLoS One. 3 (2), 1607 (2008).
  20. Fernandes, L. G., et al. OmpL1 is an extracellular matrix- and plasminogen-interacting protein of Leptospira spp. Infections and Immunity. 80 (10), 3679-3692 (2012).
  21. Fernandes, L. G., et al. Leptospira spp.: Novel insights into host-pathogen interactions. Veterinary Immunology and Immunopathology. 176, 50-57 (2016).
  22. Castiblanco-Valencia, M. M., et al. Leptospiral immunoglobulin-like proteins interact with human complement regulators factor H, FHL-1, FHR-1, and C4BP. Journal of Infectious Diseases. 205 (6), 995-1004 (2012).
  23. Choy, H. A., et al. The multifunctional LigB adhesin binds homeostatic proteins with potential roles in cutaneous infection by pathogenic Leptospira interrogans. PLoS One. 6 (2), 16879 (2011).
  24. Siqueira, G. H., et al. The recombinant LIC10508 is a plasma fibronectin, plasminogen, fibrinogen and C4BP-binding protein of Leptospira interrogans. Pathogen and Diseases. 74 (2), (2016).
  25. Teixeira, A. F., et al. Features of two new proteins with OmpA-like domains identified in the genome sequences of Leptospira interrogans. PLoS One. 10 (4), 0122762 (2015).
  26. Kochi, L. T., et al. The interaction of two novel putative proteins of Leptospira interrogans with E-cadherin, plasminogen and complement components with potential role in bacterial infection. Virulence. 10 (1), 734-753 (2019).
  27. Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infections and Immunity. 77 (2), 810-816 (2009).
  28. Bourhy, P., Louvel, H., Saint Girons, I., Picardeau, M. Random insertional mutagenesis of Leptospira interrogans, the agent of leptospirosis, using a mariner transposon. Journal of Bacteriology. 187 (9), 3255-3258 (2005).
  29. Pětrošová, H., Picardeau, M. Screening of a Leptospira biflexa mutant library to identify genes involved in ethidium bromide tolerance. Applied Environmental Microbiology. 80 (19), 6091-6103 (2014).
  30. Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods in Molecular Biology. 859, 169-176 (2012).
  31. Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: Disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infections and Immunity. 76 (12), 5826-5833 (2008).
  32. Picardeau, M., Brenot, A., Saint Girons, I. First evidence for gene replacement in Leptospira spp. Inactivation of L. biflexa flaB results in non-motile mutants deficient in endoflagella. Molecular Microbiology. 40 (1), 189-199 (2001).
  33. King, A. M., et al. High-temperature protein G is an essential virulence factor of Leptospira interrogans. Infections and Immunity. 82 (3), 1123-1131 (2014).
  34. Lambert, A., et al. FlaA proteins in Leptospira interrogans are essential for motility and virulence but are not required for formation of the flagellum sheath. Infections and Immunity. 80 (6), 2019-2025 (2012).
  35. Murray, G. L., et al. Leptospira interrogans requires heme oxygenase for disease pathogenesis. Microbes and Infections. 11 (2), 311-314 (2009).
  36. Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathogens. 3 (7), 97 (2007).
  37. Sasaki, Y., et al. Leptospiral flagellar sheath protein FcpA interacts with FlaA2 and FlaB1 in Leptospira biflexa. PLoS One. 13 (4), 0194923 (2018).
  38. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  39. Cress, B. F., et al. Rapid generation of CRISPR/dCas9-regulated, orthogonally repressible hybrid T7-lac promoters for modular, tuneable control of metabolic pathway fluxes in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (9), 4472-4485 (2016).
  40. Zhao, C., Shu, X., Sun, B. Construction of a gene knockdown system based on catalytically inactive ("dead") Cas9 (dCas9) in Staphylococcus aureus. Applied Environmental Microbiology. 83 (12), (2017).
  41. Zhao, Y., et al. CRISPR/dCas9-mediated multiplex gene repression in Streptomyces. Biotechnology Journal. , 1800121 (2018).

Tags

Genetik Leptospira leptospirose mutagenesis CRISPR interferens genhæmning bøjning
Anvendelse af CRISPR-interferens (CRISPRi) til genhæmning i patogene arter af <em>Leptospira</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandes, L. G. V., Hornsby, R. L., … More

Fernandes, L. G. V., Hornsby, R. L., Nascimento, A. L. T. O., Nally, J. E. Application of CRISPR Interference (CRISPRi) for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira. J. Vis. Exp. (174), e62631, doi:10.3791/62631 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter