Summary
DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.
Abstract
DNA-methylatie, een vorm van epigenetische genregulatie, is belangrijk voor de normale cellulaire functie. In cellen stellen eiwitten genaamd DNA-methyltransferasen (DNMT's) het DNA-methylatiepatroon vast en onderhouden het. Veranderingen in het normale DNA-methylatiepatroon zijn gekoppeld aan de ontwikkeling en progressie van kanker, waardoor DNMT's potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen zijn. Het identificeren en karakteriseren van nieuwe kleine molecuulremmers van deze enzymen is dus van groot belang. Dit artikel presenteert een protocol dat kan worden gebruikt om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers. De continue gekoppelde kinetische test maakt het mogelijk om de initiële snelheden van DNA-methylatie te bepalen in de aan- en afwezigheid van potentiële kleine molecuulremmers. De test gebruikt de methylgevoelige endonuclease Gla I om methylering van een gehemimethyleerd DNA-substraat te koppelen aan fluorescentiegeneratie.
Deze continue test maakt het mogelijk om de enzymactiviteit in realtime te volgen. Het uitvoeren van de test in kleine volumes in microtiterplaten verlaagt de kosten van reagentia. Met behulp van deze test werd een klein voorbeeldscreening uitgevoerd op remmers van DNMT1, het meest voorkomende DNMT-isozym bij mensen. Het sterk gesubstitueerde anthrachinon natuurlijke product, laccaïnezuur A, is een krachtige, DNA-competitieve remmer van DNMT1. Hier onderzoeken we drie potentiële kleine molecuulremmers - anthrachinonen of anthrachinonachtige moleculen met één tot drie substituenten - in twee concentraties om het testprotocol te beschrijven. Initiële snelheden worden gebruikt om de procentuele activiteit te berekenen die wordt waargenomen in de aanwezigheid van elk molecuul. Een van de drie onderzochte verbindingen vertoont concentratieafhankelijke remming van DNMT1-activiteit, wat aangeeft dat het een potentiële remmer van DNMT1 is.
Introduction
DNA-methylatie is een belangrijk epigenetisch merkteken dat genexpressie en chromatinestructuur reguleert. Methylering treedt voornamelijk op in CpG-dinucleotiden - cytosine gevolgd door guanosine; de methylgroep wordt toegevoegd aan de 5-positie van cytosine. Correcte DNA-methylatiepatronen, en dus de juiste genexpressie, zijn nodig voor een geschikte cellulaire ontwikkeling en functie. Veel ziektetoestanden zijn in verband gebracht met veranderingen in het normale methylatiepatroon 1,2,3. Er is bijvoorbeeld een verband tussen kankerinitiatie en progressie en veranderingen in het DNA-methylatiepatroon. Typisch, kankercellen vertonen lagere algemene niveaus van methylcytosine, die bijdraagt aan genoominstabiliteit. Tegelijkertijd is de methylcytosine die aanwezig is in het genoom geconcentreerd in de promotorregio's van tumorsuppressorgenen, wat leidt tot gen-uitschakeling van deze belangrijke eiwitten. Met name epigenetische veranderingen zijn dynamisch en omkeerbaar, in tegenstelling tot de DNA-mutaties geassocieerd met tumorigenese. Dit heeft de eiwitten die betrokken zijn bij epigenetische genregulatie interessante medicijndoelen 2,4 gemaakt.
DNA-methyltransferasen (DNT's) zijn de eiwitten die verantwoordelijk zijn voor het genereren en onderhouden van DNA-methylatiepatronen. Drie katalytisch actieve isozymen, DNMT1, DNMT3a en DNMT3b, bestaan bij mensen. Tijdens de ontwikkeling en differentiatie stellen de de novo methyltransferasen, DNMT3a en DNMT3b, methylatiepatronen vast. Beide enzymen kunnen het katalytisch inactieve DNMT3L-eiwit binden om complexen te vormen die verhoogde activiteit vertonen 1,5. Na celdeling bevatten dochtercellen hemimethylated DNA - DNA dat methylcytosine bevat in slechts één streng van de duplex - omdat het nieuw gesynthetiseerde DNA verstoken is van methylatiemarkeringen. De belangrijkste functie van DNMT1 is om dit gehemimethyleerde DNA te methyleren, waardoor het volledige methylatiepatroonwordt hersteld 1,5.
Verbanden tussen DNMT-activiteit en kanker zijn goed vastgesteld. Overexpressie van DNMT1, hetzij door transcriptionele of posttranslationele mechanismen, is een gevolg van verschillende veel voorkomende oncogene routes 6,7,8,9. Genetische benaderingen voor lagere DNMT1-activiteit met behulp van hypomorfe allelen resulteren in verminderde tumorvorming bij Apc(Min)-muizen10. Antisense oligonucleotiden die DNMT1 afstoten remmen neoplasie in celkweek en muistumormodellen 11,12. Het remmen van DNMT1-activiteit lijkt dus een veelbelovende benadering van kankertherapie. De rollen die de DNMT3-isozymen spelen, zijn echter niet zo eenvoudig. DNMT3a mutaties worden gevonden bij acute myeloïde leukemie13 en myelodysplastisch syndroom14. Van ten minste één van de geïdentificeerde mutaties is aangetoond dat het de DNA-methylatieactiviteit van het enzym15 vermindert. DNMT3b is echter overexpressie bij borstkanker16 en colorectale kanker17. Omdat de verschillende DNMT-isozymen verschillende rollen spelen in carcinogenese, zal het identificeren van isozymspecifieke remmers van cruciaal belang zijn. Niet alleen zullen deze verbindingen nuttig zijn voor de ontwikkeling van therapeutica, maar isozymspecifieke remmers zouden ook een waardevol hulpmiddel zijn om de rol van elk DNMT-isozym in de kankeretiologie te ontleden.
Verschillende DNMT-remmers zijn gemeld in de literatuur. Bekende DNMT-remmers kunnen worden onderverdeeld in twee klassen: nucleoside en niet-nucleoside. Nucleosideremmers zijn meestal cytidine-analogen. Deze verbindingen zijn opgenomen in DNA en vangen covalent DNMT's. 5-azacytidine en 5-aza-2'-deoxycytidine zijn goedgekeurd voor de behandeling van myelodysplastisch syndroom en acute myeloïde leukemie 4,18. De hoge toxiciteit, lage biologische beschikbaarheid en chemische instabiliteit van deze verbindingen leveren problemen op. Lopend onderzoek is naar de werkzaamheid van de volgende generatie nucleosideremmers; SGI-110, afgeleid van 5-aza-2'-deoxycytidine, is een voorbeeld19,20. Nucleosideremmers zijn niet isozymspecifiek en zullen elk DNMT-isozym dat wordt aangetroffen inactiveren. Daarom resulteert behandeling met een nucleoside-demethylerend middel in de uitputting van alle DNMT-isozymen 4,18. Niet-nucleosideremmers hoeven niet in het DNA te worden opgenomen om hun remmende effecten uit te oefenen. In plaats daarvan binden deze moleculen zich rechtstreeks aan DNT's, waardoor de mogelijkheid voor isozymspecifieke remming wordt geïntroduceerd. Tot op heden zijn verschillende niet-nucleosideremmers ontdekt, waaronder SGI-102721, hydralazine22, procaïnamide23, RG108 en derivaten24, en natuurlijke producten, (−)-epigallocatechine 3-gallaat (EGCG)25 en laccaïnezuur A26,27. De meeste niet-nucleosideremmers die tot nu toe zijn ontdekt, zijn niet isozymselectief of vertonen zwakke voorkeuren voor één DNMT-isozym. Bovendien moet de potentie van deze moleculen worden verbeterd, vooral in cellen 4,18. Er is dus behoefte aan het ontdekken of ontwikkelen van krachtigere, isozymselectieve DNMT-remmers.
Een hindernis voor het ontdekken van nieuwe kleine molecuulremmers van DNT's zijn de moeizame testen die traditioneel worden gebruikt om DNMT-activiteitte onderzoeken 28. Assays zijn meestal discontinu met meerdere stappen. De enzymatische activiteit van DNMT's wordt nog steeds routinematig getest met behulp van radioactief S-adenosyl methionine (SAM)29,30,31,32,33,34. Er zijn ook niet-radioactieve testen voor DNA-methylatie ontwikkeld. Bijvoorbeeld, assays die methylgevoelige restrictie-endonucleasen en elektroforese gebruiken om de spijsverteringsproducten te scheiden, zijn beschreven35,36. Dit soort discontinue, meerstapstests zijn niet gemakkelijk vatbaar voor medicijnontdekking. Sinds het midden van de jaren 2000 zijn verschillende DNA-methylatietests met een hogere doorvoer ontwikkeld28. Een scintillatie-nabijheidstest werd gebruikt om te screenen op DNMT1-remmers37. Een andere test met behulp van een methylgevoelige restrictie-endonuclease werd gebruikt om te screenen op DNMT3a-remmers25,38. Hoewel beide assays een hogere doorvoer mogelijk maakten dan traditionele DNA-methylatietests, vereisen de assays meerdere stappen en laten ze de observatie van methylatieactiviteit in realtime niet toe. Meer recent is een continue kinetische test beschreven die de vorming van S-adenosylhomocysteïne (SAH), een product van de methylatiereactie, koppelt aan de spectroscopische verandering bij 340 nm geassocieerd met NADPH-oxidatie39. Deze test maakt gebruik van drie koppelende enzymen om een spectroscopisch signaal te genereren.
We ontwikkelden een op fluorescentie gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest die gebruik maakt van een enkel commercieel beschikbaar koppelingsenzym en in realtime gegevens kan genereren (figuur 1). Een haarspeld oligonucleotide met drie methylcytosines wordt gebruikt als substraat. Het substraat-DNA bevat een fluorofoor aan het 5'-uiteinde en een quencher aan het 3'-uiteinde. Methylering van de gehemimethyleerde CpG-site genereert de splitsingsplaats voor de endonuclease Gla I - volledig gemethyleerde GCGC. Gla I splitsing van het product oligonucleotide geeft de fluorofoor vrij uit de quencher en genereert fluorescentie in real time. De test kan worden gebruikt om de activiteit van elke isovorm van DNMT te onderzoeken; er wordt echter een hogere activiteit waargenomen met DNMT1, omdat dit isozym bij voorkeur gehemimethyleerd DNA 1,5 methyleert. Nog robuustere activiteit wordt waargenomen als het RFTS-domein (Autoinhibitory Replication Foci Targeting Sequence) wordt verwijderd uit DNMT1. Dit domein, gevonden in het N-terminale regulatoire gebied, bindt aan de katalytische plaats en voorkomt DNA-binding. Verwijdering van de eerste ~ 600 aminozuren resulteert in een afgeknotte enzym dat aanzienlijk actiever is dan het enzym over de volledige lengte (~ 640-voudige toename van kcat / Km)40. Deze geactiveerde vorm van het enzym, aangeduid als RFTS-ontbrekende DNMT1 (aminozuren 621-1616), maakt de gemakkelijkere identificatie van remmers mogelijk vanwege de verhoogde katalytische kracht. Dit artikel presenteert een protocol om RFTS-ontbrekende DNMT1 te gebruiken in assays om te screenen op potentiële remmers van kleine moleculen. Met behulp van de endonuclease-gekoppelde continue assay wordt de beginsnelheid bepaald in de aan- en afwezigheid van enkele kleine moleculen. Elke potentiële remmer wordt onderzocht bij twee concentraties om te zoeken naar concentratieafhankelijke DNMT1-remming. Het percentage activiteit waargenomen in de aanwezigheid van de kleine moleculen werd in elk geval berekend.
Figuur 1: DNA-methylatietest. Een gehemimethyleerd haarspeld-DNA met een fluorofoor aan het 5'-uiteinde en een quencher aan het 3'-uiteinde wordt als substraat gebruikt. DNMT1 katalyseert de overdracht van de methylgroep van S-adenosylmethionine naar de niet-gemethyleerde CpG-site, waarbij S-adenosylhomocysteïne en volledig gemethyleerd DNA wordt gegenereerd. Het DNA-product bevat de splitsingsplaats voor het endonuclease Gla I, dat volledig gemethyleerde GCGC-sites splijt. Splitsing van het product DNA geeft de 5' fluorofoor vrij uit de 3' quencher, waardoor fluorescentie ontstaat. Afkortingen: Fl = fluorofoor; Q =quencher; DNMT1 = DNA methyltransferase 1; SAM = S-adenosylmethionine; SAH = S-adenosylhomocysteïne. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereid testoplossingen voor het scherm voor
OPMERKING: De concentraties van substraten die in deze test worden gebruikt, kunnen worden aangepast. Voor RFTS-ontbrekende DNMT1 zijn de experimenteel bepaalde Km-waarden voor het haarspeld-DNA-substraat en SAM 1-2 nM en 2 μM, respectievelijk26,40.
- Bereid 600 μL van elke testconditie die wordt getest in microcentrifugebuizen op ijs.
OPMERKING: Het totale volume van de benodigde testoplossing is afhankelijk van het aantal replicaties dat wordt uitgevoerd. Elke testvoorwaarde werd in drievoud uitgevoerd voor dit protocol.- Voeg ddH2O en 5x methylatiebuffer (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM kaliumglutamaat, 5 mM dithiothreitol (DTT), 25% glycerol) toe aan elke buis om een uiteindelijke concentratie van 1x buffer te bereiken. Voeg voor testen die 20 μM-verbinding bevatten 472 μL ddH2O en 120 μL 5x buffer toe. Voeg voor testen die 50 μM-verbinding bevatten 470 μL ddH2O en 120 μL 5x buffer toe.
- Voeg 3,15 μL 20 mg/ml runderserumalbumine (BSA) toe aan elk monster.
- Voeg 2 μL 3,15 μM haarspeld DNA-substraat en 1,33 μL 4,75 mM SAM toe aan elk monster.
OPMERKING: De concentratie van substraten in het mengsel van de testoplossing is 1,05x de gewenste eindconcentraties. - Voeg de remmer toe aan een eindconcentratie van 21 μM (1,26 μL van 10 mM) of 52,5 μM (3,15 μL van 10 mM) aan de juiste monsters. Voeg een equivalente hoeveelheid dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan een controlemonster.
OPMERKING: De concentratie van de remmer die in het scherm wordt gebruikt, kan worden gevarieerd. De maximale uiteindelijke DMSO-concentratie moet ≤5% (v/v) zijn. DMSO-concentraties tot 5% (v/v) hebben geen effect op de activiteit die in de test is waargenomen26.
- Meng de oplossingen door vortexing (3.000 rpm) gedurende 3 s. Draai de monsters gedurende enkele seconden in een minicentrifuge op tafelblad (1.200 × g) om ervoor te zorgen dat de oplossing op de bodem van de buis wordt verzameld.
- Aliquot 95 μL van elke testoplossing in 6 opeenvolgende putjes in een zwarte half-area 96-well plaat (figuur 2).
OPMERKING: Deze screeningstests werden uitgevoerd in twee batches. Eerst werden 20 μM-remmermonsters (4 totale condities) onderzocht, gevolgd door de 50 μM-remmermonsters (4 totale condities).
Figuur 2: Assay plate setup. Elke testoplossing wordt gealiquoteerd in zes putjes in de zwarte 96-well plaat: DMSO-controle (blauw), verbinding 1 (groen), verbinding 2 (rood) en verbinding 3 (geel). Zowel RFTS-ontbrekende DNMT1 als Gla I worden aan drie putten toegevoegd. Als controle zal Gla I alleen aan de andere drie putten worden toegevoegd. Afkortingen: RFTS = Replication Foci Targeting Sequence; DNMT1 = DNA methyltransferase 1; DMSO = dimethylsulfoxide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Bereid enzymoplossingen voor op het scherm
OPMERKING: RFTS-ontbrekende DNMT1 kan worden uitgedrukt in E. coli en gezuiverd tot homogeniteit. Expressie- en zuiveringsprocedures voor RFTS-ontbrekende DNMT1 zijn eerder beschreven41. Het volume van het benodigde enzym hangt af van het aantal testen dat wordt uitgevoerd. Hier worden in elke set vier verschillende testen uitgevoerd; elke test wordt in drievoud voltooid.
- Bereid 75 μL van elke enzymoplossing in microcentrifugebuizen op ijs.
OPMERKING: Er zijn twee enzymoplossingen nodig. Eén oplossing bevat DNMT1 en Gla I; de andere bevat alleen Gla I.- Voeg ddH2O en 5x methylatiebuffer (250 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 500 mM kaliumglutamaat, 5 mM DTT, 25% glycerol) toe aan elke buis om een eindconcentratie van 1x buffer te bereiken. Voeg voor de Gla I enzymoplossing 15 μL 5x buffer en 58,8 μL ddH2O toe. Voeg voor de DNMT1+Gla I enzymoplossing 15 μL 5x buffer en 58,2 μL ddH2O toe.
- Voeg 1,2 μL 10 U/μL Gla I toe aan elke oplossing voor een eindconcentratie van 0,16 U/μL.
- Voeg 0,6 μL 5 μM RFTS-ontbrekende DNMT1 voor een eindconcentratie van 40 nM toe aan de DNMT1+Gla I-oplossing.
- Tik zachtjes om de oplossingen te mengen. Draai de monsters gedurende enkele seconden in een minicentrifuge op tafel (1.200 × g) om ervoor te zorgen dat de oplossing op de bodem van de buis wordt verzameld.
- Aliquot 12 μL van elke enzymoplossing in 6 putjes in een conisch bodemplaatje met 96 putten (figuur 3).
Figuur 3: Enzymplaatopstelling. De Gla I (grijs) en DNMT1+Gla I (blauw) oplossingen zijn elk gealiquoteerd in zes putten in de 96-well plaat. Met behulp van een meerkanaals pipet kan het enzym tegelijkertijd aan een rij testoplossingen worden toegevoegd. Voor elke testconditie (zes putten) ontvangen drie putten DNMT1 + Gla I en drie putten ontvangen Gla I alleen. Afkorting: DNMT1 = DNA methyltransferase 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Voer de test uit en analyseer de gegevens.
- Verwarm de plaatlezer voor op 37 °C. Plaats de zwarte plaat met de testoplossingen. Schud de plaat (dubbel orbitaal bij 425 cpm gedurende 5 s) en lees de fluorescentie af met een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 528 nm. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 5 min.
OPMERKING: Als alternatief kunnen filters met de juiste golflengteafsnijdingen worden gebruikt voor de fluorescentiemetingen. - Verwijder de testplaat. Voeg 5 μL enzymoplossing toe aan elke put en meng door op en neer te pipetteren.
OPMERKING: Gebruik meerkanaals pipetten zodat een rij monsters tegelijkertijd kan worden gestart. - Steek de plaat in de plaatlezer. Registreer fluorescentie om de 53 s gedurende 30 minuten. Schud de plaat (dubbel orbitaal bij 425 cpm gedurende 4 s) voor elke meting.
- Gemiddelde drievoudige Gla I controle assays voor elke aandoening. Trek het gemiddelde Gla I-bevattende controlereactiespoor af van de drievoudige sporen die zijn verkregen in aanwezigheid van RFTS-ontbrekende DNMT1. Bepaal de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde voor de gecorrigeerde replicaties.
- Plot het gemiddelde gecorrigeerde reactiespoor en pas het initiële lineaire gedeelte aan op een lijn om de beginsnelheid te bepalen.
- Bepaal het percentage activiteit door de snelheid waargenomen in aanwezigheid van een verbinding te delen door de snelheid waargenomen in de DMSO-bevattende controlereactie en te vermenigvuldigen met 100.
4. Aanvullende controle op de test — sequentiële toevoeging van enzymen
- Bereid 550 μL testoplossing in een microcentrifugebuis op ijs. Voeg 110 μL 5x methylatiebuffer, 3,88 μL 3,15 μM haarspeld DNA-substraat, 6,43 μL van 47,5 mM SAM, 3,06 μL van 20 mg/ml BSA en 426,6 μL ddH2O toe.
- Meng de oplossing door vortexing (3.000 rpm) gedurende 3 s. Draai de monsters gedurende enkele seconden in een minicentrifuge op tafel (1.200 × g) om ervoor te zorgen dat de oplossing op de bodem van de buis wordt verzameld.
- Aliquot 90 μL van de testoplossing in 6 opeenvolgende putjes in een zwarte half-area 96-well plaat.
- Bereid de DNMT1-enzymoplossingen op ijs. Voeg 4 μL 5x methylatiebuffer, 0,76 μL 5 μM RFTS-ontbrekende DNMT1 en 15,24 μL ddH2O toe aan één buis. Voeg 4 μL 5x methylatiebuffer en 16 μL ddH2O toe aan een andere buis.
- Tik zachtjes om de oplossingen te mengen. Draai de monsters gedurende enkele seconden in een minicentrifuge op tafel (1.200 × g) om ervoor te zorgen dat de oplossing op de bodem van de buis wordt verzameld.
- Voeg 5 μL van de DNMT1-bevattende oplossing toe aan drie putjes in de zwarte half-area 96-well plaat. Voeg 5 μL van de bufferregeloplossing toe aan de andere drie putten.
- Plaats de microtiterplaat in de voorverwarmde plaatlezer die is voorverwarmd op 37 °C. Schud de plaat (dubbel orbitaal bij 425 cpm gedurende 3 s) en lees de fluorescentie af met een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 528 nm. Herhaal de shake en lees elke 60 s gedurende 30 min.
- Terwijl de testplaat zich in de plaatlezer bevindt, bereidt u de Gla I-oplossing op ijs. Voeg 8 μL 5x methylatiebuffer, 0,64 μL 10 U/μL Gla I en 31,4 μL ddH2O toe aan een microcentrifugebuis. Tik zachtjes om de oplossing te mengen. Draai het monster gedurende enkele seconden in een minicentrifuge op tafelblad (1.200 × g) om ervoor te zorgen dat de oplossing op de bodem van de buis wordt verzameld.
- Aliquot 6 μL van de Gla I-oplossing in 6 putten in een conisch bodemplaat met 96 putten.
- Na de eerste 30 minuten lezen, verwijdert u de zwarte plaat uit de plaatlezer. Voeg 5 μL Gla I-oplossing toe aan alle 6 putten en meng door op en neer te pipetteren.
OPMERKING: Gebruik een meerkanaals pipet zodat alle putten tegelijkertijd kunnen worden geïnitieerd. - Plaats de zwarte plaat terug in de plaatlezer. Registreer fluorescentie om de 35 s gedurende 35 minuten. Schud de plaat (dubbel orbitaal bij 425 cpm gedurende 3 s) voor elke meting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Actieve DNMT1 is een voorwaarde voor deze analyse. RFTS-ontbrekende DNMT1 werd uitgedrukt in E.coli en gezuiverd tot homogeniteit volgens eerder gepubliceerde procedures41. Om ervoor te zorgen dat het gezuiverde enzym actief was, werd een discontinue endonuclease-gekoppelde test gebruikt om DNA-methylatieactiviteit36 te onderzoeken. Deze test maakt gebruik van een duplex-DNA van 32 basenparen met een enkele gehemimethyleerde CpG op een Sau3A1-splitsingsplaats. Sau3A1 kan het gehemimethyleerde substraat-DNA splitsen; splitsing wordt echter geblokkeerd wanneer het DNA volledig gemethyleerd is. RFTS-ontbrekende DNMT1 werd toegevoegd aan assays met 1 μM DNA en 0,5 mM SAM, en aliquots werden verwijderd en flash-frozen gedurende 30 minuten. Monsters werden vervolgens verteerd met Sau3A1 en de producten werden gescheiden door gel-elektroforese. Zoals te zien is in figuur 4, wordt het DNA beschermd tegen splitsing naarmate de reactietijd toeneemt, wat aangeeft dat RFTS-ontbrekende DNMT1 het gehemimethyleerde DNA methyleert. Het grootste deel van het 1 μM substraat-DNA dat oorspronkelijk in de test aanwezig was, is in de loop van 30 minuten omgezet in product.
De endonuclease-gekoppelde test die in dit artikel wordt beschreven, maakt de observatie van DNA-methylatieactiviteit in realtime mogelijk als een toename van fluorescentie. De sleutel tot het succes van deze test is de methylgevoeligheid van het endonuclease Gla I. Gla I splijt het gehemimethyleerde substraat-DNA niet efficiënt, maar splitst het volledig gemethyleerde product-DNA (figuur 1). Splitsing van het haarspeld-DNA is nodig om de fluorofoor uit de quencher vrij te maken en een toename van fluorescentie te genereren. Om aan te tonen dat de enzymen werken zoals verwacht, werd een controlereactie uitgevoerd waarbij de enzymen, RFTS-ontbrekende DNMT1 en Gla I, sequentieel werden toegevoegd in plaats van gelijktijdig. Als de gekoppelde test correct werkt, mag de toevoeging van DNMT1 geen invloed hebben op fluorescentie, omdat methylering van het DNA-substraat naar verwachting geen invloed zal hebben op de achtergrondfluorescentie van het intern gebluste haarspeld-DNA. De daaropvolgende toevoeging van Gla I aan assays die het methyltransferase bevatten, zou echter moeten resulteren in fluorescentiegeneratie als gevolg van splitsing van het volledig gemethyleerde haarspeld-DNA. Het gehemimethyleerde haarspeld-DNA-substraat zelf heeft wel achtergrondfluorescentie (figuur 5); deze testen bevatten 20 nM haarspeld-DNA en 500 μM SAM. RFTS-ontbrekende DNMT1 of buffer werd toegevoegd aan de assays en fluorescentie werd gedurende 30 minuten gevolgd.
Zoals te zien is in figuur 5, wordt de fluorescentie niet beïnvloed door RFTS-ontbrekende DNMT1 in afwezigheid van het koppelingsenzym (blauwe tinten bevatten 10 nM RFTS-ontbrekende DNMT1, terwijl rode tinten de bufferregeling zijn). Methylering van de gehemimethyleerde CpG-site door DNMT1 verandert het fluorescentiesignaal dus niet merkbaar. Toen Gla I echter aan alle putten werd toegevoegd, werd robuuste fluorescentiegeneratie alleen waargenomen in de testen die RFTS-ontbrekende DNMT1 bevatten (figuur 5). Hieruit blijkt dat methylering van het gehemimethyleerde substraat-DNA door DNMT1 nodig is voor Gla I-splitsing en het genereren van fluorescentie. Opgemerkt moet worden dat de toename van fluorescentie waargenomen in deze controletest de activiteit van Gla I weerspiegelt, aangezien de enzymen sequentieel werden toegevoegd. Als alternatief kunnen deze reactiemengsels worden verteerd met Gla I en de resulterende oligonucleotiden kunnen worden gescheiden door elektroforese om splitsing te visualiseren en ervoor te zorgen dat de enzymen werken zoals verwacht.
Om deze gekoppelde test te gebruiken om de beginsnelheden van DNMT1 direct te bepalen, moeten beide enzymen, RFTS-ontbrekende DNMT1 en Gla I, tegelijkertijd worden toegevoegd. Zolang de snelheid van Gla I-splitsing van het product-DNA sneller is dan de snelheid van DNA-methylatie door DNMT1, zal het gegenereerde fluorescentiesignaal de DNA-methylatieactiviteit weerspiegelen. Om ervoor te zorgen dat de DNMT1-activiteit snelheidsbeperkend is, kan de concentratie van DNMT1 worden gevarieerd terwijl alle andere testomstandigheden constant blijven. De snelheid van fluorescentiegeneratie moet evenredig zijn met de concentratie DNMT1. Dit is eerder aangetoond voor RFTS-ontbrekende DNMT1 onder de omstandigheden die hier worden gebruikt40. Bij het gebruik van deze gekoppelde test om DNMT-activiteit te onderzoeken, wordt een Gla I-bevattende controlereactie uitgevoerd naast de reactie die zowel DNMT1 als Gla I bevat (figuur 6A). De Gla I-besturing heeft verschillende functies. Door het Gla I-controlereactiespoor af te trekken van het DNMT-bevattende reactiespoor, kan zowel langzame splitsing van het gehemimethyleerde DNA-substraat als de achtergrondfluorescentie worden verantwoord. De gecorrigeerde reactiesporen weerspiegelen de DNA-methylatieactiviteit van DNMT1. Door het eerste lineaire gedeelte van het gecorrigeerde reactiespoor aan te brengen, kan de beginsnelheid worden bepaald (figuur 6B). Met 10 nM haarspeld DNA substraat en 10 μM SAM werd een beginsnelheid van 113 ± 2 RFU/min verkregen.
Van gesubstitueerde anthrachinonen is eerder aangetoond dat ze de activiteit van DNMT1 remmen. Het natuurlijke product, laccaïnezuur A, een sterk gesubstitueerd anthrachinon, is een krachtige, DNA-competitieve remmer van DNMT127. Van een paar verbindingen met eenvoudigere structuren, een of twee substituenten op de anthrachinonkern, waarvan er één een omvangrijk aromatisch substituent is, is ook aangetoond dat ze DNMT1 op een DNA-competitieve manier remmen41. Hier werd het vermogen van drie gesubstitueerde anthrachinonen of anthrachinonachtige moleculen om RFTS-ontbrekende DNMT1-activiteit in de Gla I-gekoppelde test te remmen onderzocht als een voorbeeld van hoe deze screeningstests moeten worden uitgevoerd. Deze verbindingen bevatten één tot drie substituenten, allemaal aan één kant van de anthrachinonkern (tabel 1). De substraatconcentraties (10 nM DNA en 10 μM SAM) die voor deze testen worden gebruikt, zijn ~ 5x hoger dan de Km voor elk substraat. Het signaal dat in de test wordt gegenereerd, komt rechtstreeks uit het substraat-DNA. Hierdoor is het moeilijk te testen bij concentraties in de buurt van of onder Km; er is simpelweg niet genoeg signaal om te detecteren. Deze substraatconcentraties werden gekozen omdat onder deze omstandigheden robuuste activiteit wordt waargenomen in afwezigheid van remmers (figuur 6B). Andere substraatconcentraties kunnen worden gebruikt bij screeningstests. Het uitvoeren van een screening op verzadigde SAM-concentraties kan bijvoorbeeld worden gebruikt als een strategie om de zoektocht naar SAM-competitieve remmers te vertekenen.
Elke test bevatte het haarspeld-DNA-substraat, de methyldonerende co-factor SAM en een potentiële remmer of DMSO als controle voor het scherm. We genereren routinematig 10 mM-oplossingen van screeningverbindingen in DMSO voor gebruik in assays. Anthrachinonen zoals die hier worden onderzocht, vertonen een slechte oplosbaarheid in waterige oplossingen. Om geconcentreerde voorraden te genereren, wordt DMSO dus als oplosmiddel gebruikt. De toevoeging van DMSO tot 5% (v/v) eindconcentratie heeft geen invloed op de activiteit in de test26. Bij het behandelen van verbindingen met een lage oplosbaarheid in waterige oplossing moet er echter voor worden gezorgd dat de verbinding oplosbaar is bij de gekozen eindzeefconcentratie(s).
Voor elke aandoening die in het scherm wordt onderzocht, wordt een Gla I-bevattende controletest uitgevoerd. Naast het feit dat rekening wordt gehouden met achtergrondfluorescentie en langzame splitsing van het substraat haarspeld-DNA, maakt deze controle het mogelijk om te bepalen of de potentiële remmer interfereert met het spectroscopische signaal (het is bijvoorbeeld fluorescerend). Na het initiëren van de reactie door toevoeging van enzymen, werd fluorescentie gemeten gedurende 30 minuten met een tijdsinterval van 53 s in de screeningsgegevens. Dit is het snelste tijdsinterval dat beschikbaar is op de platenlezer in dit laboratorium bij het aflezen van een volledige 96-well plaat. Andere tijdsintervallen kunnen worden gebruikt om de reactiesporen te genereren. Een geschikt tijdsinterval hangt af van het instrument dat wordt gebruikt en het aantal putten dat wordt gelezen. Om de reproduceerbaarheid te garanderen, wordt elke test in drievoud uitgevoerd. Het gemiddelde Gla I-bevattende controlespoor wordt afgetrokken van de reactiesporen die zijn waargenomen in aanwezigheid van RFTS-ontbrekende DNMT1. De beginsnelheid van de reactie kan worden bepaald door het initiële lineaire deel van de gecorrigeerde reactiesporen aan te passen.
Aanvankelijk werd de impact van drie potentiële remmers op fluorescentiegeneratie onderzocht bij een eindconcentratie van 20 μM. Hogere concentraties van de potentiële remmers werden om twee redenen gekozen voor screening. Ten eerste liggen de substraatconcentraties in de test beide boven hun respectieve Km-waarden . Dit kan het moeilijker maken om remming in kinetische assays te detecteren, vooral als de remmers concurrerend zijn. Ten tweede zijn de anthrachinonachtige verbindingen die in dit scherm worden gebruikt aanzienlijk eenvoudiger van structuur dan de bekende remmer, laccaïnezuur A. Omdat deze moleculen slechts enkele substituenten rond de kernstructuur bevatten, verwachtten we zwakkere interacties. In de DMSO-bevattende controletest werd een beginsnelheid van 111 ± 5 RFU/min verkregen (figuur 7A). Merk op dat dit zeer vergelijkbaar is met het percentage dat eerder is gerapporteerd in afwezigheid van DMSO en bevestigt dat de toevoeging van lage hoeveelheden DMSO geen invloed heeft op de waargenomen activiteit. De toevoeging van twee verbindingen verminderde de waargenomen beginsnelheid, terwijl de toevoeging van de derde verbinding geen effect had op de activiteit. De beginsnelheden werden gebruikt om de procentuele activiteit te bepalen die werd waargenomen in de aanwezigheid van elke verbinding. Bij 20 μM resulteerde de toevoeging van verbindingen 1 en 2 in een procentuele activiteit van ~ 80%, terwijl 100% procent activiteit werd waargenomen in de aanwezigheid van verbinding 3, wat aangeeft dat dit molecuul het enzym niet remt (tabel 1).
Van remmers wordt verwacht dat ze concentratieafhankelijke remming vertonen. Vervolgens werden deze moleculen opnieuw onderzocht met een nog hogere concentratie van 50 μM. Voor deze reeks testen had de DMSO-bevattende controletest een beginsnelheid van 125 ± 7 RFU/min (figuur 7B). Deze snelheid is iets hoger dan de eerder bepaalde snelheden; deze snelheden liggen echter allemaal relatief dicht bij fouten. Nogmaals, verbinding 3 had weinig effect op de beginsnelheid, terwijl de toevoeging van verbindingen 1 en 2 de waargenomen beginsnelheid verminderde. Zoals verwacht had verbinding 1 bij de hogere concentratie een grotere impact op de activiteit. Bij 50 μM resulteerde de toevoeging van verbinding 1 in een procentuele activiteit van ~60% (tabel 1). De toevoeging van een hogere concentratie van verbinding 2 resulteerde echter niet in een robuustere remming. De procentuele activiteit waargenomen in de aanwezigheid van 50 μM van verbinding 2 was opnieuw in de buurt van 80%.
Zoals te zien is in de gepresenteerde gegevens, kan de endonuclease-gekoppelde fluorescentie-gebaseerde DNA-methylatietest worden gebruikt om te screenen op potentiële DNMT-remmers. De gegevens geven aan dat verbinding 1 en verbinding 2 potentiële remmers zijn, terwijl verbinding 3 dat niet is. Aanvullende studies zijn nodig om de potentiële remmers te valideren als echte DNMT1-remmers.
Figuur 4: DNMT1-activiteitscontrole. Hemimethylated duplex DNA methylatie beschermt tegen Sau3A1 splitsing. RFTS-ontbrekende DNMT1 werd toegevoegd aan testmengsels die 1 μM DNA en 500 μM SAM bevatten. Monsters werden verzameld op de aangegeven tijdstippen tijdens een incubatie van 30 minuten bij 37 °C, verteerd met Sau3A1 en opgelost door gel-elektroforese op 18% PAGE. Hier worden monsters van 5, 10, 15 en 30 minuten weergegeven. De eerste rijstrook is een besturing zonder DNMT1. Afkortingen: DNMT1 = DNA methyltransferase 1; RFTS = Replicatie Foci Targeting Sequence. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Op fluorescentie gebaseerde testcontrole. RFTS-ontbrekende DNMT1 (10 nM eindconcentratie) en Gla I (0,8 U) werden achtereenvolgens toegevoegd aan drievoudige assays met 20 nM haarspeld DNA-substraat en 500 μM SAM. Toevoeging van DNMT1 (blauwe cirkels) of buffer (rode cirkels) alleen had geen effect op de achtergrondfluorescentie. Toevoeging van Gla I aan alle assays resulteert in fluorescentiegeneratie in assays die DNMT1 bevatten, maar niet in assays die dat niet doen. Afkortingen: DNMT1 = DNA methyltransferase 1; RFTS = Replicatie Foci Targeting Sequence; RFU = relatieve fluorescentie-eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Fluorescentiereactiesporen. Triplicaat assays bevatten 10 nM haarspeld DNA substraat en 10 μM SAM. (A) RFTS-ontbrekende DNMT1 (2 nM) en Gla I (0,8 U) werden toegevoegd aan drie assays (blauw), en Gla I (0,8 U) alleen werd toegevoegd aan drie assays (rood). Robuuste fluorescentiegeneratie wordt alleen waargenomen in de testen die beide enzymen bevatten. (B) Het gemiddelde Gla I-reactiespoor werd afgetrokken van de DNMT1+Gla I-reactiesporen. De gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde van de drievoudsgegevens worden weergegeven. Het aanbrengen van het lineaire gedeelte van het spoor geeft een beginsnelheid van 113 ± 2 RFU/min. Afkortingen: DNMT1 = DNA methyltransferase 1; RFTS = Replicatie Foci Targeting Sequence; RFU = relatieve fluorescentie-eenheden; SAM = S-adenosylmethionine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: DNA-methylatieactiviteit in aanwezigheid van potentiële remmers. DNA-methylatieactiviteit van RFTS-ontbrekende DNMT1 werd onderzocht in aanwezigheid van DMSO (zwart), verbinding 1 (rood), verbinding 2 (blauw) of verbinding 3 (groen). Gecorrigeerde reactiesporen bij 20 μM verbinding (A) en 50 μM verbinding (B) waren geschikt om de beginsnelheid te bepalen. Toevoeging van verbindingen 1 en 2 verminderde de waargenomen snelheid, terwijl verbinding 3 weinig invloed had op de activiteit. Gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde voor de drievoudige assays worden getoond. Afkortingen: DNMT1 = DNA methyltransferase 1; RFTS = Replicatie Foci Targeting Sequence; RFU = relatieve fluorescentie-eenheden; DMSO = dimethylsulfoxide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Initiële snelheden en procentuele activiteiten waargenomen in aanwezigheid van potentiële kleine molecuulremmers. De beginsnelheid werd bepaald door het initiële lineaire deel van gecorrigeerde reactiesporen op een lijn aan te passen; de fout in verband met de pasvorm wordt gemeld. Procentuele activiteit werd bepaald door de snelheid bepaald in aanwezigheid van verbinding te delen door de snelheid bepaald in de DMSO-controlereactie en te vermenigvuldigen met 100; bijbehorende fout is gepropageerd. Afkortingen: Cmpd = compound; DMSO = dimethylsulfoxide; RFU = relatieve fluorescentie-eenheden. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om remmers van DNA-methyltransferasen te identificeren en te karakteriseren, moet de activiteit van het enzym worden gemeten. Er bestaan verschillende methoden voor het onderzoeken van DNA-methyltransferase-activiteit. Activiteit wordt vaak gecontroleerd met behulp van radioactiviteit; overdracht van de gelabelde methylgroep van SAM kan worden gekwantificeerd 29,30,31,32,33,34. Gel-gebaseerde assays die methylgevoelige endonucleasen gebruiken, zijn ook beschreven35,36. Deze testen zijn meestal discontinu en vereisen meerdere stappen om de activiteit te onderzoeken. Hier wordt een endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest beschreven om te screenen op potentiële DNA-methyltransferaseremmers. Deze techniek heeft verschillende voordelen. De test is relatief eenvoudig. Het vereist geen scheidingstechnieken (bijv. Elektroforese, filterbinding) om een signaal te verkrijgen. Bovendien is de test continu, waardoor gegevens in realtime kunnen worden verzameld. Een andere continue kinetische test voor methylatieactiviteit werd onlangs beschreven39. Deze test vereist echter drie koppelende enzymen om een spectroscopisch signaal te genereren. De hier beschreven test vereist een enkel koppelend enzym.
Deze DNMT-activiteitstests worden uitgevoerd door eerst een testoplossing te genereren die alle testcomponenten bevat, behalve de enzymen. De testoplossingen bevatten de substraten, haarspeld-DNA en SAM; 0,1 mg/ml BSA wordt ook routinematig opgenomen in de testen. Met de extreem lage concentraties (in het nanomolaire bereik) van DNA en DNMT1 die in de test worden gebruikt, verhoogt de BSA de algemene eiwitconcentratie om hechting aan pipetpunten, buizen en microtiterplaten en milieubeledigingen die van invloed kunnen zijn op de enzymactiviteit te helpen voorkomen. De reactie wordt vervolgens geïnitieerd door enzymen toe te voegen aan de testoplossingen. Met deze verdunningen moet rekening worden gehouden bij het bepalen van de eindconcentraties van alle testcomponenten. Reacties worden geïnitieerd door 5 μL enzymoplossing toe te voegen aan 95 μL testoplossing. Daarom zijn de concentraties VAN DNA, SAM en BSA in de testoplossingen 1,05x de gewenste eindconcentratie. Als bijvoorbeeld 10 nM DNA gewenst is, worden testoplossingen gegenereerd met 10,5 nM DNA. De concentratie van RFTS-ontbrekende DNMT1 in de enzymoplossing is 20x de gewenste eindconcentratie. Hier werd 40 nM RFTS-ontbrekende DNMT1 gebruikt in de enzymoplossing, zodat de uiteindelijke concentratie van DNMT1 in elke test 2 nM was.
Aangezien Gla I een in de handel verkrijgbaar enzym is, wordt de hoeveelheid ervan gegeven in eenheden (U) zoals verstrekt door de fabrikant. De gegenereerde enzymoplossingen bevatten 0,16 U/μL Gla I, zodat in totaal 0,8 U Gla I aan elke put wordt toegevoegd. Om te besparen op reagenskosten, worden kleine volumes van de juiste enzymoplossingen bereid en die oplossingen worden vervolgens gealiquoteerd in conisch-bottomed 96-well platen. Met behulp van meerkanaals pipetten wordt 5 μL enzymoplossingen overgebracht van de conischbodemplaat naar de testoplossingen in de zwarte 96-well half-area plaat. Dit proces maakt het mogelijk om tegelijkertijd een rij assays te starten. Als alternatief, met een andere assayplaatopstelling, kunnen enzymoplossingen in reagensreservoirs worden geplaatst en vervolgens kunnen meerkanaals pipetten worden gebruikt om enzym aan de testoplossingen toe te voegen. Deze aanpak vereist echter grotere hoeveelheden enzymoplossing als gevolg van vloeibaar terugwinningsafval in de reservoirs. We voeren de testen uit in 96-well half-area platen; de kleinere putgrootte in deze platen zorgt voor een kleiner totaal testvolume (100 μL) dan traditionele 96-well platen, wat opnieuw bespaart op reagenskosten.
De hier beschreven DNA-methylatietest vereist een gehemimethyleerd substraat-DNA vanwege de specificiteit van de koppelingsendonuclease Gla I. Dit maakt de test vooral goed voor het onderzoeken van de activiteit van DNMT1, omdat dit isozym bij voorkeur gehemimethyleerd DNA1 methyleert. De DNMT3-isozymen vertonen geen voorkeur tussen niet-gemethyleerd en gehemimethyleerd DNA1. Deze test kan dus ook worden gebruikt om de activiteit van de DNMT3-isozymen te onderzoeken. In feite is de remming van DNMT3a door kleine moleculen beoordeeld met behulp van deze test 26,27,41. De vereiste van een gehemimethyleerd substraat-DNA betekent dat deze test niet kan worden gebruikt om de specificiteit of voorkeur van het substraat tussen niet-gemethyleerde en gehemimethyleerde CpG-locaties te onderzoeken.
Deze test is gebaseerd op een spectroscopisch signaal: de toename van fluorescentie wanneer de fluorofoor en quencher worden gescheiden. Kleine moleculen die zelf fluoresceren of fluorescentie doven, kunnen dus interfereren met de test. Een reden om de Gla I-bevattende controle voor elke testconditie uit te voeren, is om op deze mogelijkheid te controleren. De spectroscopische eigenschappen van het kleine molecuul kunnen eenvoudig worden verklaard door gebruik te maken van de Gla I-controlegegevens (bijvoorbeeld als het molecuul een zwak fluorescentiesignaal heeft). Als het molecuul echter sterk fluorescerend of een sterke quencher is, kan deze test niet worden gebruikt om DNA-methylatieactiviteit te detecteren.
Het hier beschreven scherm is een eerste test om potentiële DNMT-remmers te detecteren. Verbindingen die "hits" zijn in het beginscherm moeten worden gevalideerd in secundaire testen om ervoor te zorgen dat ze echte DNMT-remmers zijn. Omdat deze test een gekoppelde kinetische test is, betekent het eenvoudigweg waarnemen van een afname van fluorescentiegeneratie in de aanwezigheid van een bepaald klein molecuul niet noodzakelijkerwijs dat de verbinding het methyltransferase remt. Een klein molecuul dat in staat is om het koppelingsenzym Gla I te remmen, zou ook resulteren in een waargenomen afname van fluorescentiegeneratie. Een eenvoudig secundair scherm omvat het bepalen van de activiteit van Gla I in de aan- en afwezigheid van de potentiële remmers. Voor deze test wordt het volledig gemethyleerde inwendig gebluste haarspeld-DNA gebruikt als substraat26,41. Aanvullende assays die zijn ontworpen om aggregatie-afhankelijke remming en DNA-intercalatie te onderzoeken, kunnen ook worden gebruikt als secundaire assays om potentiële remmers verder te valideren26,41. In de hier gepresenteerde gegevens werden verbinding 1 en verbinding 2 geïdentificeerd als potentiële DNMT1-remmers. Met behulp van een verscheidenheid aan secundaire testen is verbinding 1 gevalideerd als een directe remmer van DNMT141. Dit eerder gepubliceerde werk toonde aan dat verbindingen met omvangrijke substituenten op de C2-positie van de anthrachinonkern effectievere remmers van DNMT1 leken te zijn. Er zijn echter meer studies nodig om de structurele determinanten voor DNMT1-remming volledig te begrijpen.
De hier beschreven gekoppelde test heeft verschillende potentiële toepassingen. De test kan worden gebruikt voor steady-state kinetische experimenten. Omdat de test continu is, is het bepalen van de beginsnelheden eenvoudig. Deze test is eerder gebruikt om macroscopische kinetische parameters (d.w.z. Km, Vmax en kcat) van verschillende afgeknotte DNMT1-eiwitten40 te onderzoeken. De test is gebruikt om een kleine set moleculen te onderzoeken op DNMT1-remming41 en de isozymspecificiteit van geïdentificeerde remmers te beoordelen door hun impact op DNMT3a-activiteitte onderzoeken 26,27,41. De test is ook gebruikt om remmers te karakteriseren. Het mechanisme van remming en potentie (bijv. Ki, IC50) van zowel remmende eiwitdomeinen36,40 als nieuwe kleine moleculen27,41 zijn bepaald met behulp van deze gekoppelde kinetische assay. De test is ook aangepast voor gebruik in een HTS-campagne. In dit geval werd de test verder geminiaturiseerd tot een 384-well-formaat en gebruikt als een eindpunttest voor het eerste scherm26. De op fluorescentie gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest die hier wordt beschreven, is dus een veelzijdige test die kan worden gebruikt om de activiteit van DNA-methyltransferasen te onderzoeken en maakt de identificatie en karakterisering van kleine molecuulremmers van deze belangrijke epigenetische modifiers mogelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Bucknell University en het Department of Chemistry voor hun steun aan dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 3694 | |
| 96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates | ThermoFisher | 249570 | |
| Bovine Serum Albumin | NEB | B9000S | |
| compound 1 | ChemBridge | 5812086 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| compound 2 | ChemBridge | 6722175 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| compound 3 | ChemBridge | 5249376 | screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM |
| Dithiothreitol | Sigma | D0632 | |
| Gla I | SibEnzyme | E494 | methyl-sensitive endonuclease |
| Glycerol | RPI | G22025 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M0250 | |
| Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher) | IDT | custom synthesized | internally quenched hairpin DNA (substrate) |
| Potassium Glutamate | Sigma | G1501 | |
| S-adenosylmethionine | Sigma | A4377 | methyl-donating co-factor (substrate) |
| Tris Base | RPI | T60040 |
References
- Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).
- Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases. Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).
- Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases. Genes. 10 (5), 369 (2019).
- Foulks, J. M., et al. Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).
- Goll, M. G., Bestor, T. H.
- Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene. Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).
- Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity. Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).
- MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).
- Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen. Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).
- Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice. Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).
- MacLeod, A. R., Szyf, M. Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).
- Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).
- Ley, T. J., et al. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).
- Walter, M. J., et al. Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).
- Russler-Germain, D. A., et al. The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers. Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).
- Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines. Molecular Cancer. 7, 15 (2008).
- Nosho, K., et al. DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).
- Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. Targeting DNA methylation with small molecules: what's next. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).
- Chuang, J. C., et al. S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).
- Issa, J. J., et al. Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study. Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).
- Datta, J., et al. A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation. Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).
- Zambrano, P., et al. A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes. BMC Cancer. 5, 44 (2005).
- Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).
- Asgatay, S., et al. Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1. Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).
- Ceccaldi, A., et al. C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development. Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).
- Fagan, R. L., Wu, M., Chédin, F., Brenner, C. An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes. PLoS One. 8 (11), 78752 (2013).
- Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).
- Eglen, R. M., Reisine, T. Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview. Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).
- Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).
- Norvil, A. B., et al. Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface. Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).
- Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase. FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).
- Bashtrykov, P., et al. Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain. Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).
- Berkyurek, A. C., et al. The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA. Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).
- Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1. Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).
- Bashtrykov, P., et al. Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain. Chemistry & Biology. 19 (5), 572-578 (2012).
- Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1. Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).
- Kilgore, J. A., et al. Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay. Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).
- Ceccaldi, A., et al. Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library. ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).
- Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities. Epigenetics & Chromatin. 8, 56 (2015).
- Syeda, F., et al. The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1. Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).
- Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors. PLoS One. 14 (7), 0219830 (2019).
