Summary
该协议详细介绍了生产三种不同类型的球体的方法，使其适用于大规模高内涵筛选和分析。此外，还提供了示例，展示了如何在球体和单个细胞水平上分析它们。
Abstract
高内涵筛选（HCS）和高内涵分析（HCA）是使研究人员能够从细胞中提取大规模定量表型测量的技术。这种方法已被证明对于加深我们对细胞生物学中广泛的基本和应用事件的理解是强大的。迄今为止，该技术的大多数应用都依赖于使用单层生长的细胞，尽管人们越来越意识到这些模型并不能概括组织中发生的许多相互作用和过程。因此，在开发和使用3维（3D）细胞组件（例如球体和类器官）方面出现了。尽管这些3D模型在癌症生物学和药物递送研究的背景下特别强大，但它们以适用于HCS和HCA的可重复方式进行生产和分析，带来了许多挑战。这里详述的方案描述了一种产生多细胞肿瘤球体（MCTS）的方法，并证明它可以以与HCS和HCA兼容的方式应用于三种不同的细胞系。该方法有助于每孔产生数百个球体，提供了特定的优点，即当用于筛选制度时，可以从每孔数百个结构中获得数据，所有这些都以相同的方式处理。还提供了示例，其中详细介绍了如何处理球体以进行高分辨率荧光成像，以及HCA如何在球体水平以及从每个球体内的单个细胞中提取定量特征。该协议可以很容易地应用于回答细胞生物学中的各种重要问题。
Introduction
传统上，基于细胞的测定是在固体底物上生长的单层中进行的，这实际上可以被认为是二维（2D）环境。然而，人们越来越认识到，2D细胞培养模型在某些情况下缺乏生理相关性，无法复制细胞之间发生的许多复杂相互作用1。三维（3D）细胞培养方法在研究人员中迅速流行，3D细胞模型显示出更好地模拟细胞在组织环境中遇到的生理条件的巨大潜力2。已经使用了几种不同类型的3D细胞组件，但最常见的两种类型是球体和类器官。球状体可以从许多不同的细胞系中生长，它们可以根据所使用的细胞类型及其组装方法采用各种形状和大小3。此外，当球状体从癌细胞系生长时，它们也可以被称为多细胞肿瘤球体（MCTS），这些模型已经发现特别适用于临床前 体外 药物递送和毒性研究4，5。另一方面，类器官旨在更好地模仿我们体内的组织和器官，并且可以采用更复杂的形态安排。类器官的产生涉及使用成体干细胞或多能干细胞，它们可以重新编程到适当的细胞中以类似于感兴趣的组织或器官。它们主要用于研究器官的发育，并对疾病和宿主-病原体相互作用进行建模6。
有一系列不同的方法可用于生成 3D 单元组件。基于支架的方法提供了一种底物或支撑物，细胞可以附着或生长在其内。这些脚手架可以有各种形状，可以由各种不同的材料制成。最常见的是细胞外基质（ECM）成分和水凝胶，它们被设计成类似于细胞的天然细胞外环境，从而促进生理相互作用4，7。ECM基底材料已从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤肿瘤中提取，并显示含有丰富的ECM成分混合物，包括层粘连蛋白，IV型胶原蛋白和perlecan8。然而，尽管其成分有利，但其使用存在两个主要挑战，即其批次间变异性，以及它在10°C8，9以下和上方具有两种不同的聚集状态。相比之下，水凝胶在组件和刚度方面具有柔韧性的优势，并且可以定制以适应所需的特定3D细胞组件7，10。基于支架的方法对于类器官生长至关重要，但也广泛用于球体。无支架方法通过防止细胞附着在它们生长的表面上起作用，通常只与球体组装兼容。例子包括超低附着（ULA）板，具有平底或U形底，允许细胞聚集成球状体，或使用旋转瓶中细胞的连续搅拌10。
使用3D细胞组件来研究各种生物事件正在迅速普及;然而，为他们的养殖选择的方法必须适当，并且与下游分析计划兼容。例如，使用ULA板可产生高稠度的球体;然而，这种方法仅限于生产每孔的单个球体，从而限制了通量。在计划对3D结构进行荧光成像时，需要特别考虑。生长组件的基板或板需要具有光学相容性，并且必须注意将可能使用的任何支架引起的光散射的影响降至最低11。随着显微镜物镜的数值孔径增加，这一特殊问题变得更加尖锐。
可以说，选择使用3D细胞模型的主要原因之一是提取不仅关于整个组件的体积成像数据，还提取其中单个细胞的体积成像数据。特别是MCTS模型，对于加深我们对治疗药物如何从外部传递到中心细胞（就像它们在肿瘤中需要的那样）的理解方面开始变得非常强大12，因此从不同层的单个细胞中获得知识至关重要。从单个细胞中提取定量信息的成像技术被称为高内涵分析（HCA），是筛选环境中的一种强大方法13。迄今为止，HCA几乎只应用于单层培养物，但人们越来越意识到这种方法具有应用于3D培养物的能力，从而能够研究广泛的细胞功能和过程14。它具有明显的优势，可以分析大量的3D组件，从而可能从每个结构中提供单元级数据。然而，需要克服与潜在厚细胞组件的成像以及生成的大型数据集相关的挑战。
本文介绍了一种基于支架的稳健方法，用于大规模生产96孔格式的MCTS。该方法有助于在每个孔中生产数百个3D单元组件。显示了三种不同细胞类型的示例，代表肝脏，肺和结肠的实体瘤模型。形成的球体可以是各种大小，因此HCA用于选择特定大小和/或形态的结构。这一特征提供了额外的优势，即观察到的任何表型都可以在不同大小的球体之间进行比较，但在同一孔中以相同的方式处理。这种方法与高分辨率成像兼容，重要的是提供来自相同细胞组件的细胞水平和亚细胞水平的定量数据。与每孔产生单个球体的方法相比，这种球体生产方法具有额外的优势，即每个孔中产生的大量球体可能为其他下游分析（如转录组和蛋白质组分析）提供足够的生物量。
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Protocol
1. 细胞培养
- 准备介质
- 根据细胞系的类型制备特定的细胞培养基。确保所有用于细胞维护的培养基都含有10%的胎儿牛血清（FBS）。
注意：不同的细胞系使用不同的培养基。HT-29结肠癌细胞（ATCC HTB-38）在McCoys 5A + 10%FBS中生长。HepG2肝细胞癌细胞（ATCC HB-8065）在最低必需培养基+ 1%L-谷氨酰胺+ 10%FBS中生长。H358支气管肺泡癌细胞（ATCC CRL-5807）在RPMI 1640培养基+ 1%L-谷氨酰胺+ 10%FBS中生长。所有含有 L-谷氨酰胺和 FBS 的介质均称为完整培养基。当电镀细胞作为球体生长时，需要具有10%FBS的无酚红培养基以避免ECM基底材料的着色，这反过来又会在成像过程中引起伪影。
- 根据细胞系的类型制备特定的细胞培养基。确保所有用于细胞维护的培养基都含有10%的胎儿牛血清（FBS）。
- 传代培养细胞
- 当细胞汇合约80%时，用2mL胰蛋白酶-EDTA（0.25%（w / v）胰蛋白酶/ 0.53mM EDTA）短暂洗涤。吸出胰蛋白酶-EDTA，加入3mL新鲜胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育3-5分钟。
- 当细胞从细胞培养皿中分离时，加入7mL新鲜完全培养基。
- 将1mL细胞悬浮液移入新的10cm细胞培养皿中，并加入9mL新鲜完整培养基，得到1：10稀释的细胞。
- 在37°C下用5%CO 2的加湿培养箱培养细胞。
- 每3-5天传代培养细胞，具体取决于细胞系。
2. 旋转椭球体的生成
- 用 ECM 基底材料涂覆 96 孔板
- 在冰上解冻ECM基底材料过夜。
- 使用保持-20°C的预冷尖端在冷酚无血清培养基中稀释ECM基底材料。
注意：ECM基底材料的最终浓度取决于所使用的细胞系。对于HT-29和H358细胞，使用4mg·mL-1 的ECM基底材料。对于HepG2细胞，使用4mg·mL-1 的还原生长因子ECM基底材料。 - 将15μL ECM基底材料/培养基溶液移液到96孔成像板中。
注意：对于大规模球体生产，只要冷却含有ECM基底材料的吸头和储液槽，就可以使用8通道移液器和96通道移液头执行此步骤。 - 在4°C下以91× g 离心板20分钟。
- 将板在37°C下孵育不超过30分钟。
- 细胞传代和计数
- 在平板孵育期间，用胰蛋白酶-EDTA孵育细胞，并将它们重悬于含有10%FBS的完整培养基中。
- 将10μL细胞悬浮液移入血细胞计数器计数室。计算腔室4个象限中的细胞数量。
- 通过确定4个象限内的平均细胞数来计算细胞悬浮液中的细胞数。
注意：细胞也可以使用自动细胞计数设备进行计数。 - 在室温（RT）下以135× g 离心细胞4分钟。
- 一旦细胞沉淀，吸出上清液并将细胞重悬于无酚红的完整培养基中，以获得每mL1×10 6 个细胞的浓度。
- 将细胞种子到ECM基底材料包被板中
- 在无酚红的完全培养基中稀释细胞。
注意：接种细胞的密度取决于所使用的细胞系。对于HT-29和HepG2细胞，每孔接种3 x 10 4 个细胞;对于H358细胞，每孔接种4 x 10 4 个细胞。 - 将细胞接种到每孔35μL的总体积中。确保以圆周运动的方式逐滴添加它们。
注意：对于大规模球体生产，只要可以实现移液圆周运动，就可以使用8通道移液器执行此步骤。 - 将细胞在37°C下在具有5%CO 2的加湿培养箱中孵育1小时。
- 在无酚红完全培养基中制备ECM基底材料的溶液，从而在井中产生最终浓度为2%的ECM基底材料。为此，将1.2μL ECM基底材料加入每孔23.8μL无酚红完整培养基中，最终体积为每孔60μL。
- 将细胞在37°C下孵育在具有5%CO 2的加湿培养箱中。
- 第二天，用100μL新鲜苯酚无红完整培养基代替培养基。
- 每隔一天用100μL新鲜无酚红完全培养基替换培养基。
- 在无酚红的完全培养基中稀释细胞。
3. 球体的免疫荧光染色
注：本议定书改编自纽伦堡等人，202015年。这些适应性主要基于这样一个事实，即该协议中描述的球体比纽伦堡等人工作中使用的球体小15 ，因此有助于缩短孵育时间。例如，阻断时间从 2 小时减少到 1 小时。此外，由于该协议是为高通量生产球体而设计的，因此所有加工步骤都在培养球体的孔中进行，这意味着不需要将单个球体转移到管中。
- 准备固定和染色所需的所有溶液和缓冲液
- 通过每200毫升水加入1 PBS片剂来制备磷酸盐缓冲盐水（PBS）。高压灭菌PBS。
- 制备多聚甲醛（PFA）的步骤3.1.3-3.1.4。
- 使用加热的搅拌器在通风橱中将400 mL PBS加热至60-70°C。搅拌时加入15克PFA。一旦PFA溶解，加入50μL1M CaCl2 和50μL1M MgCl2。
- 加入 100 mL PBS，制成最终体积为 500 mL。使用NaOH将PFA平衡至pH值7.4。通过无菌真空过滤器（孔径0.22μm）过滤PFA，等分试样，并储存在-20°C。
- 通过将3.75g甘氨酸加入50mL PBS来制备1M甘氨酸储备溶液。储存在4°C。
- 通过加入100μLTriton X-100，1mL二甲基亚砜（DMSO）和1.5mL1M甘氨酸至2.4mLPBS来制备5 mL渗透缓冲液。在4°C下储存不超过2周。
- 通过向4.9 mL PBS中加入100μLTriton X-100，0.5mLDMSO和0.05g牛血清白蛋白（BSA）来制备5 mL封闭缓冲液。将封闭缓冲液等分到1.5mL管中并储存在-20°C。
- 通过加入10μL聚山梨醇酯20，0.05g BSA和250μLDMSO至4.74mLPBS来制备5mL抗体孵育缓冲液。将抗体孵育缓冲液等分到1.5mL管中，并将其储存在-20°C。
注意：在这里描述的协议中，球体仅组装在96孔板的内部60孔中，尽管它们可以在板的所有96孔中制备。仅在内部60孔中制备旋转椭球体的原因是，由于某些板型上的“裙边”，一些高数值孔径物镜无法对外孔的整个孔进行物理成像。上述体积足以制备60个含有球体的孔。
- 固定和透化球体
- 小心地从球体中取出介质，确保ECM基底材料层不受干扰。
- 用70μLPBS洗涤球体两次，每次3分钟。
- 在37°C下用70μL3%PFA固定球体1小时。
- 用70μLPBS洗涤球体两次，每次3分钟。
- 在37°C下用70μL0.5M甘氨酸溶液淬灭30分钟。
- 在室温下使用70μL通透性缓冲液使球体通透30分钟。
- 用70μLPBS洗涤球体两次，每次3分钟。
- 将球体在70μL封闭缓冲液中孵育37°C下1小时。
注：一旦球体固定，所有后续处理步骤都可以使用8通道移液器或96孔移液头（如果可用）进行。这提高了成像前球体制备的速度。
- 使用一抗和二抗对球体进行免疫染色
- 将一抗稀释至抗体培养液中的适当稀释液，并向每个孔中加入70μL。将球体与一抗孵育过夜。
注意：稀释度取决于所使用的特异性抗体。在这里显示的示例中，使用1：500的稀释液用小鼠抗LAMP1抗体对溶酶体进行免疫染色。 - 第二天，用70μLPBS洗涤球体5次，每次3分钟。
- 在抗体孵育缓冲液中以1：500稀释二抗，在1：500下稀释荧光偶联的鬼臼素，以1：5000稀释Hoechst 33342（来自1mg mL-1 储备液），并向每个孔中加入70μL。孵育过夜。
注意：抗体稀释度取决于所使用的特异性抗体。建议使用具有高光稳定性和高亮度的高度交叉吸附二抗。 - 第二天，用70μLPBS洗涤球体5次，每次3分钟。
注意：在成像之前，只要球体保持PBS覆盖，板可以在RT下储存长达两周。
- 将一抗稀释至抗体培养液中的适当稀释液，并向每个孔中加入70μL。将球体与一抗孵育过夜。
4. 椭球体的图像采集和分析
- 图像采集
- 将含有球体的96孔板插入共聚焦高内涵筛选显微镜中。
- 选择合适的激光器来激发所使用的荧光团。
- 按顺序获取通道以避免串扰。
- 使用适当的物镜对旋转椭球体进行成像。
注：如果有的话，建议使用水浸式物镜。例如，20x/1.0 NA物镜可以在约77个视场中对整个井进行成像。63x/1.15 NA物镜可以在大约826个视场中对整个井进行成像。 - 图像~30-40个切片，取决于球体的深度，每个切片以1.5μm的间隔拍摄。
- 图像分析
- 对于旋转椭球体的形态学分析，请遵循步骤 4.2.2-4.2.6。
- 根据荧光共轭的染色对球体进行分割。
- 根据Hoechst 33342染色对细胞核进行分段。
- 通过细胞质中存在的残留Hoechst 33342染色剂分割每个细胞的细胞质。
- 计算球体的不同形态特性，包括体积、表面积、球形度和每个球体的原子核数。
注意：此信息是使用所选图像分析软件中内置的各种算法提取的。 - 进一步处理图像以去除小于 75，000 μm3 且大于 900，000 μm3 的球体。
注意：这些值是允许移除非常小的细胞组件和可能由于多个球体融合而产生的大型组件的建议。在此步骤中，旋转椭球体也可以分为不同的大小类别。 - 要分析球体中的单个细胞，请按照步骤4.2.8-4.2.12进行操作。
- 根据荧光共轭的染色对球体进行分割。
- 根据Hoechst 33342染色对细胞核进行分段。
- 通过细胞质中存在的残留Hoechst 33342染色剂分割每个细胞的细胞质。
- 根据二抗染色对溶酶体进行分段。
- 计算每个球体内细胞的不同形态学性质，包括每个细胞的溶酶体数量，细胞体积和细胞表面积。
注意：此信息是使用所选图像分析软件中内置的各种算法提取的。
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Representative Results
在该协议中，详细介绍了一种以球体形式产生3D细胞培养组件的可靠方法，使用不同的细胞类型来表示各种肿瘤组织。该方法允许每孔产生数百个球体，这使得基于细胞的测定能够以高内涵的方式进行（图1）。这种方法以前已被用于研究HT-29球体16 中的纳米颗粒摄取和HepG2球体中纳米颗粒诱导的毒性17。该方法依赖于在光学质量板的孔底部产生薄而均匀的支架材料分布。将细胞接种到每个孔中，并以低浓度添加进一步的支架材料作为细胞上的覆盖层。这导致一个支持球体均匀生长的碱基，这意味着可以在96孔板的每个孔中培养数百个球体。低倍率物镜用于生成整个总体的概览图像（图2）。然后可以使用高分辨率物镜选择和成像孔的子区域，并在每个位置获得完整的共聚焦堆栈。这为随后对每个球体进行体积分析提供了必要的信息。
然后可以通过HCA分析单个球体，从而提供有关球体形态特性的信息。通常，第一步是将每个旋转椭球体标识为单个对象。为此，选择可能在整个球体中提供一致染色或分布的荧光通道。在这里显示的示例中，使用荧光偶联的素通道中的信号，因为在不同球体类型中的所有细胞中都发现肌动蛋白靠近质膜（ 图 2 和 图 3A ）。由于生成了完整的共聚焦堆栈，所有HCA步骤都可以以体积方式执行，而不是逐片执行。这很重要，因为它消除了与分析少量选定平面相关的任何偏差。然后，将此体积方法应用于图像中的其他通道。基于Hoechst 33342染色检测和分割细胞核，并且该相同的通道可用于检测细胞质，因为存在低水平的残留Hoechst 33342（图3B）。如果需要对球体内的单个细胞进行下游分析，也可以以类似的方式处理其他通道（例如，用抗LAMP1抗体染色的溶酶体）。体积法允许从所有视图可视化所有荧光标记的结构（图3C）。
将旋转椭球体识别为一个独特的物体后，可以在旋转椭球体水平上进行各种形态学测量。这些测量包括计算每个球体的原子核数量（图4A），以及球体的球形度（图4B），体积（图4C）和表面积（图4D）。根据所使用的HCA软件，还可以计算其他形态特征，例如横截面积，内盘半径和内球半径。在此处显示的示例中，从测量中丢弃了低于75，000 μm3 和高于900，000 μm3 的球体，但这些参数可以由用户设置，具体取决于所需的球体属性进行分析。电子表格由图像分析软件生成并导入到RStudio中进行分析。制作了箱线图以显示不同类型球体的形态特性（图4）。这些箱形图揭示了种群中球体异质性的水平，这就是为什么在任何一个实验中量化大量球体很重要的原因。与每孔生成单个旋转椭球体的方法相比，这是一个关键优势。这里显示的三种旋转椭球体类型在体积和表面积方面显示出高度的相似性，尽管值得注意的是HepG2旋转椭球体的球面度略低于此处显示的其他类型的球形（图4B）。
使用高分辨率物镜对球体进行成像，例如此处使用的63x水浸物镜，可以实现球体内单个细胞的亚细胞分辨率。不同的细胞器可以根据所使用的抗体进行分割。在这里显示的示例中，基于使用抗LAMP1抗体的免疫染色鉴定溶酶体，然后添加二抗（图3C）。然后，每个细胞内每个细胞器的分割允许对细胞水平测量进行定量。图中显示了三种球体类型中每个细胞的典型体积（图5A），以及每个细胞的溶酶体数量（图5B）。对这种亚细胞细节的需求取决于将使用球体的测定。
在球体生成开始时优化初始细胞接种密度是关键步骤。添加过多的细胞仍然允许球体形成;然而，这可能导致球体的融合（图6）。这导致产生形状不规则的组件，这反过来又对球体的下游识别造成很大问题。当球体被错误地识别为不同的结构时，单个细胞的分析也可能存在问题。因此，仔细优化用于球体生成的每个细胞系，包括细胞接种密度和生长时间长度，是要建立的关键参数。
图1：用于生成HCS和HCA的球体的方案的示意图. 96孔板涂有一层ECM基底材料，然后接种细胞，然后启动球体形成。介质在第二天更换，此后每隔一天更换一次。在准备成像时，球体被固定，透化并用特异性抗体免疫染色。然后使用共聚焦HCS显微镜对球体进行成像。使用 BioRender.com 创建的图形。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：H358、HepG2 和 HT-29 旋转椭球体的示例图像。 （A） H358、（B） HepG2 和 （C） HT-29 球体的全自动 HCS 共聚焦成像。面板显示了单个孔概述，以及三个示例共聚焦切片和每个细胞系中一个球体的体积重建。用 Hoechst 33342 染色的细胞核以蓝色显示，肌动蛋白用荧光偶联的膜素染成红色，溶酶体以绿色显示为 LAMP1 免疫染色。使用20倍水浸物镜（NA 1.0）获取油井概览的图像。使用63x水浸物镜（NA 1.15）获取单个球体的图像。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：图像分析中的关键步骤示例。 （A）首先通过检测荧光偶联的鬼臼染色在体积模式下鉴定每个球体。（B）使用此信息作为掩码，每个细胞的细胞质由细胞质中存在的残留Hoechst 33342染色剂分割。细胞核由Hoechst 33342染色分段。溶酶体使用抗体（抗LAMP1）免疫染色进行分段。显示体积视图。（C） 同一旋转椭球体的 3 平面视图。所示示例是 H358 细胞球体。使用63x水浸物镜（NA 1.15）获取的图像 请单击此处查看此图的大图。
图 4：旋转椭球体水平测量示例。 所有测量均使用自动图像分析管道进行，并使用20倍物镜对三种类型的球体（即H358，HepG2和HT-29）进行成像。显示的是（A）每个球体的平均原子核数，（B）球体球形度，（C）球体体积和（D）球体表面积。所有箱线图都显示每种旋转椭球体类型的中位数值和四分位数。数据来自3个复制井;分析的椭球体总数为1259（H358），1522（HepG2）和1326（HT-29）。使用20倍水浸物镜（NA 1.0）获取图像。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：来自椭球体的细胞水平测量示例。 所有测量均使用自动图像分析管道进行，并使用63x物镜对三种类型的旋转椭球体（即H358，HepG2和HT-29）进行成像。显示的是（A）单个细胞的体积，和（B）每个细胞的平均溶酶体数。分析的细胞总数为1410（H358），1625（HepG2）和1401（HT-29），来自每个细胞系的20个球体。使用63x水浸物镜（NA 1.15）获取的图像 请单击此处查看此图的大图。
图6：显示细胞过度接种对球体形成的影响的示例图像。 显示了 H358、HepG2 和 HT-29 旋转椭球体的示例图像。箭头表示球体可能融合的地方。使用20倍水浸物镜（NA 1.0）获取图像。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
这里描述的方法详细介绍了一个平台，该平台以适合HCS和HCA的方式每孔产生数百个球体。与其他流行的方法相比，例如使用平底和圆底ULA板，这些板允许每个孔仅形成一个旋转椭球体18，19，这种方法为以筛选格式从大量球体中提取高分辨率信息提供了机会。值得注意的是，这种方法已经在3种不同的细胞系中得到证明，代表了各种肿瘤类型，突出了它对研究不同模型中的一系列细胞过程的广泛适用性。尽管使用此方法生成的球体在大小和形状上显示出一些可变性，但HCA可以很容易地按大小（或任何其他感兴趣的参数）对它们进行分类。我们的实验室已经成功地使用这种方法来研究纳米颗粒诱导的毒性作为球体大小的函数。重要的是，所有不同大小的球体类别都可以在同一口井中进行研究，这意味着所有球体都暴露于相同的处理中，从而从大型球体群体中提供高度稳健的输出17。这里描述的方法可以很容易地适应用于代表不同组织的其他细胞类型。此外，这种球体可用于评估不同的生物过程14。如果球状体是由稳定表达荧光标记蛋白的细胞产生的，则也可以进行活细胞成像。
该协议中的一个关键步骤是生产电镀细胞的ECM基底材料层。当层太厚时，它可以形成半月板20 ，促进井中心单层的生长，并且仅在井的外缘形成球体。因此，必须选择ECM基底材料的正确浓度和体积，以允许在整个井中均匀地形成球体;这始终依赖于细胞系。同样值得注意的是，过量的ECM基底材料在免疫染色过程中会引起问题，因为它不易溶解。反过来，当使用HCS共聚焦显微镜系统时，这可能导致图像采集过程中的并发症。另一个考虑因素是，不同的细胞系可能需要不同的ECM配方。例如，与H358和HT-29球体使用的材料相比，HepG2球体需要生长因子浓度降低的ECM基底材料。细胞电镀方法也很重要，因为这决定了细胞在孔中的分布方式。当接种的细胞过多或分布不均时，这可能导致球体融合（图6）。使用 ECM 脚手架的另一个挑战是，它们需要在低温（低于 10 °C）下处理，这在使用自动化 HCS 时尤其成问题。然而，Eismann及其同事（2020）最近解决了这个问题，他们利用微阵列技术将0.2μL的ECM基底材料和细胞液滴发现到腔室载玻片中。这足以促进小球体的生长21。这种方法是否也适用于将大量ECM基底材料电镀到多孔板的孔中，还有待证明。
与使用显微镜分析3D细胞模型相关的一个问题是从这些组件的中心平面中提取信息的能力。在这方面，免疫染色过程中的通透性和抗体获取可能会有问题。然而，纽伦堡及其同事发表的方案15 能够对整个球体进行高度一致的免疫染色。使用对该协议的轻微修改，该技术甚至可以免疫染色甚至小的亚细胞结构（例如溶酶体），具有高度的一致性，无论细胞相对于整体球体结构是中心还是外周。使用新抗体时，仔细优化此步骤非常重要。
另一个关键步骤是选择的成像方案。通过旋转椭球体对适当数量的z切片进行成像非常重要，因为这决定了需要分析和存储的数据量。例如，以过长的间隔对有限数量的 z 平面进行成像可能会导致低估整体球体大小和体积。另一方面，捕获过多的 z 平面可能会导致数据分析和存储问题。非常大的数据集还需要更密集的计算能力进行分析，特别是在体积模式下。z平面中的最佳采样间隔很大程度上取决于物镜的特性，但对于此处显示的示例，需要以1.5μm的间隔进行约40个共聚焦切片，以便于通过整个球体深度进行成像。
如前所述，为了减少所选平面分析的偏差，强烈建议使用基于体积的图像分析方法。这不仅可以提取球体水平的信息，还可以从每个单独的旋转椭球体中提取细胞水平数据。最终，HCA管道的设计方式需要解决所提出的特定生物学问题。多参数输出能够定量描述复杂的表型。这已被证明适用于使用商业HCA软件16，17以及可自由访问的软件（如CellProfiler22，23）的3D单元组装。体积分析方法有可能应用于其他3D细胞模型类型，例如类器官和离体患者来源的外植体（PDE），它们甚至可以更好地复制体内条件。最近，已经描述了一种用于生产脑类器官的高通量管道24。这涉及在96孔板中生成类器官，然后使用高内涵筛选显微镜对其进行成像24。偏微分方程具有很高的优势，因为它们表现出来自肿瘤的原始组织学，从而提供了一种细胞模型，可以概括体内条件，包括肿瘤微环境等特征25。原则上，这些模型也可以使用此处描述的方法进行免疫染色，成像和分析26，27。
总之，该协议描述了一种可访问且可靠的方法，用于HCS和HCA应用的大规模生产球体。它的适用性显示在三种不同的细胞系中，产生可以高分辨率成像的球体。该协议还表明，体积分析可以提供有关球体群体以及单细胞和亚细胞水平的定量信息，从而使其可用于各种测定。
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Disclosures
作者声明，与这项工作没有竞争利益。
Acknowledgments
作者承认爱尔兰科学基金会（SFI）（16 / RI / 3745）对JCS的基础设施研究资助的支持。ucd细胞筛选实验室的工作由ucd科学学院支持。ASC由爱尔兰研究委员会（IRC）爱尔兰政府研究生奖学金（GOIPG / 2019 / 68）资助。作者还感谢实验室所有成员的投入和有益的讨论。图 1 中的图稿是在 BioRender 中生成的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
References
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