Summary
Denne protokol beskriver en metode til fremstilling af tre forskellige typer sfæroider på en måde, der gør dem egnede til storstilet screening og analyse af højt indhold. Derudover præsenteres eksempler, der viser, hvordan de kan analyseres på sfæroid- og individuelle celleniveauer.
Abstract
High-content screening (HCS) og high-content analysis (HCA) er teknologier, der giver forskere mulighed for at udtrække store kvantitative fænotypiske målinger fra celler. Denne tilgang har vist sig at være stærk til at uddybe vores forståelse af en bred vifte af både grundlæggende og anvendte begivenheder inden for cellebiologi. Hidtil har de fleste applikationer til denne teknologi været afhængige af brugen af celler dyrket i monolag, selv om det i stigende grad indses, at sådanne modeller ikke rekapitulerer mange af de interaktioner og processer, der forekommer i væv. Som sådan har der været en fremkomst i udviklingen og brugen af 3-dimensionelle (3D) cellesamlinger, såsom sfæroider og organoider. Selvom disse 3D-modeller er særligt kraftfulde i forbindelse med kræftbiologi og lægemiddelleveringsundersøgelser, udgør deres produktion og analyse på en reproducerbar måde, der er egnet til HCS og HCA, en række udfordringer. Protokollen, der er beskrevet her, beskriver en metode til generering af multicellulære tumorsfæroider (MCTS) og viser, at den kan anvendes på tre forskellige cellelinjer på en måde, der er kompatibel med HCS og HCA. Metoden letter produktionen af flere hundrede sfæroider pr. brønd, hvilket giver den specifikke fordel, at når de anvendes i et screeningsregime, kan data opnås fra flere hundrede strukturer pr. Brønd, alle behandlet på samme måde. Der gives også eksempler, som beskriver, hvordan man behandler sfæroiderne til fluorescensbilleddannelse i høj opløsning, og hvordan HCA kan udtrække kvantitative træk på både sfæroidniveau såvel som fra individuelle celler inden for hver sfæroid. Denne protokol kunne let anvendes til at besvare en lang række vigtige spørgsmål inden for cellebiologi.
Introduction
Traditionelt er cellebaserede assays blevet udført i monolag, der vokser på et fast substrat, hvilket effektivt kan betragtes som et todimensionelt (2D) miljø. Det bliver dog i stigende grad anerkendt, at 2D-cellekulturmodeller mangler fysiologisk relevans i nogle sammenhænge og ikke kan replikere mange af de komplekse interaktioner, der forekommer mellem celler1. Tredimensionelle (3D) cellekulturmetoder bliver hurtigt populære blandt forskere, og 3D-cellemodeller viser et stort potentiale til bedre at efterligne de fysiologiske tilstande, som celler støder på i vævsmiljøet2. Der er flere forskellige typer af 3D-cellesamlinger, der er blevet anvendt, men de to mest almindelige typer er sfæroider og organoider. Sfæroider kan dyrkes fra mange forskellige cellelinjer, og de kan antage forskellige former og størrelser afhængigt af den anvendte celletype og deres samlemetode3. Desuden kan sfæroider også betegnes som multicellulære tumorsfæroider (MCTS), når de dyrkes fra kræftcellelinjer, og disse modeller har fundet særlig anvendelse til prækliniske in vitro-lægemiddelleverings- og toksicitetsundersøgelser4,5. Organoider sigter derimod mod bedre at efterligne væv og organer i vores krop og kan vedtage mere komplekse morfologiske arrangementer. Produktionen af organoider indebærer anvendelse af voksne stamceller eller pluripotente stamceller, som kan omprogrammeres til de relevante celler for at ligne det væv eller organ, der er af interesse. De bruges primært til at undersøge udviklingen af organer og til at modellere sygdomme og værtspatogeninteraktioner6.
Der er en række forskellige metoder, der bruges til at generere 3D-cellesamlinger. Stilladsbaserede metoder giver et substrat eller en støtte, som celler enten kan fastgøre eller vokse indenfor. Disse stilladser kan have forskellige former og kan laves af en række forskellige materialer. De mest almindelige er ekstracellulære matrixkomponenter (ECM) og hydrogeler, og de er designet til at ligne cellernes naturlige ekstracellulære miljø og derved lette fysiologiske interaktioner4,7. ECM kældermateriale er blevet ekstraheret fra Engelbreth-Holm-Swarm musesarkomtumor og vist sig at indeholde en rig blanding af ECM-komponenter, herunder laminin, type IV kollagen og perlecan8. På trods af dets fordelagtige sammensætning er der imidlertid to hovedudfordringer ved dets anvendelse, nemlig dets batch-til-batch-variabilitet, og at det har to forskellige aggregerede tilstande under og over 10 °C8,9. I modsætning hertil har hydrogeler den fordel, at de er fleksible med hensyn til deres komponenter og stivhed, og de kan tilpasses, så de passer til den specifikke ønskede 3D-cellesamling7,10. Stilladsbaserede metoder er afgørende for organoidvækst, men anvendes også i vid udstrækning til sfæroider. Stilladsfrie metoder, der virker ved at forhindre celler i at binde sig til den overflade, de vokser på, er normalt kun kompatible med sfæroidsamling. Eksempler herpå er plader med ultralav fastgørelse (ULA) med enten en flad bund eller U-bund, som tillader aggregering af cellerne i sfæroider, eller anvendelse af kontinuerlig omrøring af cellerne i spinner-/rotationskolber10.
Brugen af 3D-cellesamlinger til at studere en lang række biologiske begivenheder vinder hurtigt popularitet; Det er imidlertid afgørende, at den metode, der er valgt for deres kultur, er hensigtsmæssig og forenelig med planerne for deres downstream-analyse. For eksempel genererer brugen af ULA-plader sfæroider med høj konsistens; Denne metode er imidlertid begrænset til produktion af en enkelt sfæroid pr. Brønd og derved begrænser gennemstrømningen. Der er behov for særlig overvejelse, når fluorescensbilleddannelse af 3D-strukturen er planlagt. Underlaget eller pladen, som samlingen dyrkes på, skal være optisk kompatibel, og der skal udvises omhu for at minimere virkningerne af lysspredning forårsaget af stilladser, der måtte have været brugt11. Dette særlige problem bliver mere akut, efterhånden som den numeriske blænde på mikroskopets objektive linser øges.
Formentlig er en af hovedårsagerne til at vælge at arbejde med en 3D-cellemodel at udtrække volumetriske billeddannelsesdata om ikke kun hele samlingen, men også de enkelte celler i den. Især MCTS-modeller begynder at vise sig at være meget kraftfulde til at uddybe vores forståelse af, hvordan terapi passerer udefra til centrale celler (som de ville have brug for i en tumor)12, og derfor er det vigtigt at få viden fra individuelle celler i forskellige lag. Billeddannelsesteknologien, der udtrækker kvantitativ information fra individuelle celler, kaldes high-content analysis (HCA) og er en stærk tilgang i forbindelse med screening13. Hidtil er HCA næsten udelukkende blevet anvendt på monolagskulturer, men der er en stigende erkendelse af, at denne tilgang har magt til at blive anvendt på 3D-kulturer, hvilket gør det muligt at studere en bred vifte af cellulære funktioner og processer14. Det ville have den klare fordel, at et stort antal 3D-samlinger kunne analyseres, hvilket potentielt kunne give data på celleniveau fra hele hver struktur. Udfordringer forbundet med billeddannelse af potentielt tykke cellesamlinger såvel som de store datasæt, der genereres, skal imidlertid overvindes.
I denne artikel præsenteres en robust stilladsbaseret metode til storstilet produktion af MCTS i et 96-brønds format. Metoden letter produktionen af flere hundrede 3D-cellesamlinger i hver brønd. Eksempler er vist for tre forskellige celletyper, der repræsenterer solide tumormodeller af leveren, lungen og tyktarmen. De sfæroider, der dannes, kan være af forskellig størrelse, og derfor bruges HCA til at vælge strukturer af en bestemt størrelse og / eller morfologi. Denne funktion giver den ekstra fordel, at eventuelle fænotyper, der observeres, kan sammenlignes på tværs af sfæroider i forskellige størrelser, men alle behandles på samme måde i samme brønd. Denne tilgang er kompatibel med billeddannelse i høj opløsning, hvilket er vigtigt at give kvantitative data på både celleniveau og subcellulært niveau fra de samme cellulære samlinger. Denne metode til sfæroidproduktion har den yderligere fordel i forhold til metoder, der genererer en enkelt sfæroid pr. Brønd, at det store antal sfæroider, der produceres i hver brønd, potentielt giver tilstrækkelig biomasse til andre downstream-analyser, såsom transkriptom og proteomprofilering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- Forbered medier
- Forbered specifikke cellekulturmedier afhængigt af typen af cellelinje. Sørg for, at alle medier til cellevedligeholdelse indeholder 10% Føtal Bovine Serum (FBS).
BEMÆRK: Forskellige cellelinjer bruger forskellige medier. HT-29 tyktarmskarcinomceller (ATCC HTB-38) dyrkes i McCoys 5A + 10% FBS. HepG2 hepatocellulære carcinomceller (ATCC HB-8065) dyrkes i Minimum Essential Medium + 1% L-glutamin + 10% FBS. H358 bronchoalveolære carcinomceller (ATCC CRL-5807) dyrkes i RPMI 1640 medium + 1% L-glutamin + 10% FBS. Alle medier, der indeholder L-glutamin og FBS, betegnes som komplette medier. Ved plettering af celler til at vokse som sfæroider kræves et phenolrødfrit medium med 10% FBS for at undgå farvning af ECM-kældermaterialet, hvilket igen kan forårsage artefakter under billeddannelsesprocessen.
- Forbered specifikke cellekulturmedier afhængigt af typen af cellelinje. Sørg for, at alle medier til cellevedligeholdelse indeholder 10% Føtal Bovine Serum (FBS).
- Subkultur celler
- Når cellerne er ca. 80% sammenflydende, vaskes kort med 2 ml trypsin-EDTA (0,25% (w/v) trypsin/0,53 mM EDTA). Aspirer trypsin-EDTA, tilsæt 3 ml frisk trypsin-EDTA og inkuber i 3-5 minutter ved 37 °C.
- Når celler løsnes fra cellekulturskålen, tilsættes 7 ml frisk komplet medium.
- Pipette 1 ml cellesuspension i en ny 10 cm cellekulturskål og tilsæt 9 ml frisk komplet medium for at give en 1:10 fortynding af celler.
- Cellerne dyrkes ved 37 °C i en befugtet inkubator med 5 % CO2.
- Subkultur cellerne hver 3-5 dage, afhængigt af cellelinjen.
2. Generation af sfæroider
- Frakke 96-brønds plader med ECM kældermateriale
- Tø ECM kældermateriale op på is natten over.
- Fortynd ECM-kældermateriale i koldt phenolrødfrit serumfrit medium ved hjælp af forkølede spidser, der holdes ved -20 °C.
BEMÆRK: Den endelige koncentration af ECM-kældermateriale afhænger af den anvendte cellelinje. For HT-29- og H358-celler skal du bruge 4 mg·ml-1 ECM-kældermateriale . For HepG2-celler skal du bruge 4 mg·ml-1 af reduceret vækstfaktor ECM-kældermateriale. - Pipette 15 μL af ECM-kældermaterialet/mediumopløsningen i en billeddannelsesplade med 96 brønde.
BEMÆRK: Til storstilet sfæroidproduktion kan dette trin udføres med både en 8-kanals pipette og et 96-kanals pipetteringshoved, så længe spidserne og reservoiret, der indeholder ECM-kældermaterialet, køles. - Centrifugering af pladen i 20 minutter ved 91 x g ved 4 °C.
- Inkuber pladen i højst 30 minutter ved 37 °C.
- Subkultur og tælleceller
- I løbet af pladeinkubationsperioden inkuberes cellerne med trypsin-EDTA og resuspend dem i et komplet medium indeholdende 10% FBS.
- Pipette 10 μL af cellesuspensionen ind i et hæmocytometertællekammer. Tæl antallet af celler i 4 kvadranter i kammeret.
- Beregn antallet af celler i cellesuspensionen ved at bestemme det gennemsnitlige antal celler inden for de 4 kvadranter.
BEMÆRK: Celler kan også tælles ved hjælp af automatiserede celletællingsenheder. - Centrifugering af cellerne ved 135 x g i 4 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Når cellerne er pelleteret, aspirerer supernatanten og resuspend cellerne i et phenolrødfrit komplet medium for at opnå en koncentration på 1 x 106 celler pr. Ml.
- Frøceller i ECM-kældermaterialebelagte plader
- Fortynd cellerne i et phenolrødfrit komplet medium.
BEMÆRK: Tætheden af celler, der er podet, afhænger af den anvendte cellelinje. For HT-29- og HepG2-celler podet 3 x 104 celler pr. Brønd; for H358-celler podet 4 x 104 celler pr. Brønd. - Frø cellerne i et samlet volumen på 35 μL pr. Brønd. Sørg for at tilføje dem dråbevis i en cirkulær bevægelse.
BEMÆRK: Til storstilet sfæroidproduktion kan dette trin udføres med en 8-kanals pipette, så længe den pipetterende cirkulære bevægelse kan opnås. - Inkuber cellerne i 1 time ved 37 °C i en befugtet inkubator med 5 % CO2.
- Forbered en opløsning af ECM-kældermateriale i phenolrødfrit komplet medium, hvilket resulterer i en endelig koncentration af 2% ECM-kældermateriale i brønden. For at opnå dette tilsættes 1,2 μL ECM-kældermateriale til 23,8 μL phenolrødfrit komplet medium pr. Brønd, hvilket resulterer i et endeligt volumen på 60 μL pr. Brønd.
- Inkuber cellerne ved 37 °C i en befugtet inkubator med 5 % CO2.
- Den følgende dag udskiftes mediet med 100 μL frisk phenol rødfrit komplet medium.
- Udskift mediet hver anden dag med 100 μL frisk phenol rødfrit komplet medium.
- Fortynd cellerne i et phenolrødfrit komplet medium.
3. Immunofluorescensfarvning af sfæroider
BEMÆRK: Denne protokol er tilpasset fra Nürnberg et al., 202015. Disse tilpasninger er primært baseret på det faktum, at de sfæroider, der er beskrevet i denne protokol, er mindre end dem, der anvendes i Nürnberg et al.-arbejdet15 og som sådan letter kortere inkubationstider. For eksempel reduceres blokeringstider fra 2 timer til 1 time. Da protokollen desuden er designet til produktion af sfæroider med høj gennemstrømning, udføres alle behandlingstrin i brønden, hvor sfæroiderne dyrkes, hvilket betyder, at overførsel af individuelle sfæroider til rør ikke er påkrævet.
- Forbered alle opløsninger og buffere, der kræves til fastgørelse og farvning
- Forbered fosfatbufret saltvand (PBS) ved at tilsætte 1 PBS-tablet pr. 200 ml vand. Autoklave PBS.
- Forbered paraformaldehyd (PFA) ved at følge trin 3.1.3-3.1.4.
- Brug en opvarmet omrører til at opvarme 400 ml PBS til 60-70 °C i en stinkhætte. Tilsæt 15 g PFA under omrøring. Når PFA er opløst, tilsættes 50 μL 1 M CaCl2 og 50 μL 1 M MgCl2.
- Tilsæt 100 ml PBS for at lave et endeligt volumen på 500 ml. Brug NaOH til at udligne PFA til pH 7,4. PFA filtreres gennem sterile vakuumfiltre (porestørrelse 0,22 μm), alikvote, og opbevares ved -20 °C.
- Der fremstilles en 1 M glycinstækkeopløsning ved tilsætning af 3,75 glycin til 50 ml PBS. Opbevares ved 4 °C.
- Forbered 5 ml permeabiliseringsbuffer ved tilsætning af 100 μL Triton X-100, 1 ml dimethylsulfoxid (DMSO) og 1,5 ml 1 M glycin til 2,4 ml PBS. Opbevares ved 4 °C i højst 2 uger.
- Der forberedes 5 ml blokerende buffer ved at tilsætte 100 μL Triton X-100, 0,5 ml DMSO og 0,05 g bovin serumalbumin (BSA) til 4,9 ml PBS. Aliquot blokeringsbufferen i 1,5 ml rør og opbevar ved -20 °C.
- Forbered 5 ml antistofinkubationsbuffer ved at tilsætte 10 μL polysorbat 20, 0,05 g BSA og 250 μL DMSO til 4,74 ml PBS. Aliquot antistofinkubationsbufferen i 1,5 ml rør og opbevar den ved -20 °C.
BEMÆRK: I den protokol, der er beskrevet her, samles sfæroider kun i de indre 60 brønde på en plade med 96 brønde, selvom de kan fremstilles i alle 96 brønde på pladen. Årsagen til kun at forberede sfæroider i de indre 60 brønde er, at nogle objektive linser med høj numerisk blænde ikke er i stand til fysisk at kunne afbilde hele brønden i de ydre brønde på grund af 'nederdelen' på nogle pladetyper. Ovennævnte volumener er tilstrækkelige til fremstilling af 60 brønde indeholdende sfæroider.
- Fix og permeabilisere sfæroiderne
- Fjern forsigtigt mediet fra sfæroiderne, og sørg for, at ECM-kældermaterialelaget ikke forstyrres.
- Vask sfæroiderne to gange med 70 μL PBS i 3 minutter hver gang.
- Fastgør sfæroiderne med 70 μL 3% PFA i 1 time ved 37 °C.
- Vask sfæroiderne to gange med 70 μL PBS i 3 minutter hver gang.
- Slukning med 70 μL 0,5 M glycinopløsning i 30 minutter ved 37 °C.
- Permeabilisere sfæroiderne ved hjælp af 70 μL af permeabiliseringsbufferen i 30 minutter ved RT.
- Vask sfæroiderne to gange med 70 μL PBS i 3 minutter hver gang.
- Inkubere sfæroiderne i 70 μL blokerende buffer i 1 time ved 37 °C.
BEMÆRK: Når sfæroiderne er blevet fastgjort, kan alle efterfølgende behandlingstrin udføres ved hjælp af en 8-kanals pipette eller et pipetteringshoved med 96 brønde, hvis det er tilgængeligt. Dette øger hastigheden af sfæroidforberedelse inden billeddannelse.
- Immunostain sfæroider ved anvendelse af primære og sekundære antistoffer
- Fortynd det primære antistof til en passende fortynding i antistofinkubationsbufferen, og tilsæt 70 μL til hver brønd. Inkubere sfæroiderne med det primære antistof natten over.
BEMÆRK: Fortyndingen afhænger af det specifikke antistof, der anvendes. I eksemplet vist her immunholdes lysosomer med musens anti-LAMP1-antistoffer ved anvendelse af en fortynding på 1:500. - Den følgende dag vaskes sfæroiderne 5 gange med 70 μL PBS i 3 minutter hver gang.
- Det sekundære antistof fortyndes ved en fortynding på 1:500, fluorescerende konjugeret phalloidin ved 1:500 og Hoechst 33342 (fra en 1 mg ml-1-stamme ) ved 1:5000 i antistofinkubationsbufferen og tilsættes 70 μL til hver brønd. Inkuber natten over.
BEMÆRK: Antistoffortyndingen afhænger af det specifikke antistof, der anvendes. Meget krydsadsorberede sekundære antistoffer, der viser høj fotostabilitet og høj lysstyrke, anbefales. - Den følgende dag vaskes sfæroiderne 5 gange med 70 μL PBS i 3 minutter hver gang.
BEMÆRK: Plader kan opbevares i op til to uger ved RT før billeddannelse, så længe sfæroiderne forbliver dækket af PBS.
- Fortynd det primære antistof til en passende fortynding i antistofinkubationsbufferen, og tilsæt 70 μL til hver brønd. Inkubere sfæroiderne med det primære antistof natten over.
4. Billedoptagelse og analyse af sfæroider
- Erhvervelse af billeder
- Indsæt pladen med 96 brønde, der indeholder sfæroider, i et konfokalt screeningsmikroskop med højt indhold.
- Vælg de relevante lasere for at ophidse de anvendte fluoroforer.
- Erhverv kanalerne sekventielt for at undgå krydstale.
- Billede sfæroiderne ved hjælp af passende mål.
BEMÆRK: Brug af vandnedsænkningsmål anbefales, hvis det er tilgængeligt. For eksempel kan en 20x/1.0 NA-målsætning afbilde en hel brønd i ~77 synsfelter. Et mål på 63x/1,15 NA kan afbilde en hel brønd i ca. 826 synsfelter. - Billede ~ 30-40 skiver, afhængigt af dybden af sfæroiden, med hver skive taget med et interval på 1,5 μm fra den foregående.
- Billede analyse
- For morfologisk analyse af sfæroider skal du følge trin 4.2.2-4.2.6.
- Segmenter sfæroiderne baseret på fluorescerende konjugeret phalloidinfarvning.
- Segmenter kernerne baseret på farvningen af Hoechst 33342.
- Segmenter cytoplasmaet i hver celle med den resterende Hoechst 33342-plet, der er til stede i cellecytoplasmaet.
- Beregn forskellige morfologiske egenskaber af sfæroiderne, herunder volumen, overfladeareal, sfæricitet og antallet af kerner pr. Sfæroid.
BEMÆRK: Disse oplysninger ekstraheres ved hjælp af forskellige algoritmer, der er indbygget i den valgte billedanalysesoftware. - Behandl billeder yderligere for at fjerne sfæroider mindre end 75.000 μm3 og større end 900.000 μm3.
BEMÆRK: Disse værdier er forslag til at tillade fjernelse af meget små cellesamlinger og store samlinger, der kan være opstået som følge af fusion af flere sfæroider. Sfæroider kan også kategoriseres i forskellige størrelsesklasser på dette trin. - For at analysere enkeltceller i sfæroider skal du følge trin 4.2.8-4.2.12.
- Segmenter sfæroiderne baseret på fluorescerende konjugeret phalloidinfarvning.
- Segmenter kernerne baseret på farvningen af Hoechst 33342.
- Segmenter cytoplasmaet i hver celle med den resterende Hoechst 33342-plet, der er til stede i cellecytoplasmaet.
- Segmenter lysosomerne baseret på den sekundære antistoffarvning.
- Beregn forskellige morfologiske egenskaber af cellerne inden for hver sfæroid, herunder antallet af lysosomer pr. Celle, cellevolumen og celleoverfladeareal.
BEMÆRK: Disse oplysninger ekstraheres ved hjælp af forskellige algoritmer, der er indbygget i den valgte billedanalysesoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol er en robust metode til fremstilling af 3D-cellekultursamlinger i form af sfæroider, der bruger forskellige celletyper til at repræsentere forskellige tumorvæv, detaljeret. Denne metode gør det muligt at frembringe hundredvis af sfæroider pr. brønd, hvilket gør det muligt at udføre cellebaserede assays på en måde med højt indhold (figur 1). Denne fremgangsmåde er tidligere blevet anvendt til at studere nanopartikeloptagelse i HT-29-sfæroider16 og nanopartikelinduceret toksicitet i HepG2-sfæroider17. Metoden er afhængig af at producere en tynd og jævn fordeling af stilladsmateriale over brøndbunden på en optisk kvalitetsplade. Celler podes i hver brønd, og yderligere stilladsmateriale tilsættes i en lav koncentration som et overlay på cellerne. Dette resulterer i en base, der understøtter jævn vækst af sfæroider, hvilket betyder, at flere hundrede sfæroider kan dyrkes i hver brønd på en 96-brønds plade. Et lavt forstørrelsesmål bruges til at generere et overbliksbillede af hele befolkningen (figur 2). Underområder af brønden kan derefter vælges og afbildes ved hjælp af et mål i høj opløsning, og i hver position erhverves en komplet konfokal stak. Dette giver de nødvendige oplysninger til efterfølgende volumetrisk analyse af hver sfæroid.
De enkelte sfæroider kan derefter analyseres af HCA og derved give information om sfæroidernes morfologiske egenskaber. Typisk er det første skridt at identificere hver sfæroid som et enkelt objekt. For at gøre dette vælges en fluorescenskanal, der sandsynligvis vil give ensartet farvning eller fordeling i hele sfæroiden. I eksemplet vist her anvendes signalet i den fluorescerende konjugerede phalloidinkanal, da actin findes tæt på plasmamembranen i alle celler i de forskellige sfæroidtyper (figur 2 og figur 3A). Som et resultat af, at der genereres komplette konfokale stakke, kan alle HCA-trin udføres på en volumetrisk måde snarere end på skive for skivebasis. Dette er vigtigt, da det fjerner enhver bias forbundet med analysen af et lille antal udvalgte fly. Denne volumetriske tilgang anvendes derefter på de andre kanaler i billedet. Kernerne blev påvist og segmenteret baseret på Farvningen af Hoechst 33342, og den samme kanal kan anvendes til at detektere cellecytoplasmaet, da der er resterende Hoechst 33342 til stede ved lave niveauer (figur 3B). Hvis der er behov for downstream-analyse af individuelle celler i sfæroiden, kan de andre kanaler (for eksempel lysosomer immunholdt med anti-LAMP1-antistoffer) også behandles på en lignende måde. Den volumetriske tilgang gør det muligt at visualisere alle fluorescerende mærkede strukturer fra alle visninger (figur 3C).
Efter at have identificeret sfæroiden som et særskilt objekt, kan der foretages forskellige morfologiske målinger på sfæroidniveau. Disse målinger omfatter beregning af antallet af kerner pr. sfæroid (figur 4A) samt sfæriciteten (figur 4B), volumen (figur 4C) og overfladeareal (figur 4D) af sfæroiden. Afhængigt af den anvendte HCA-software kan andre morfologiske egenskaber såsom tværsnitsareal, indre diskradius og indre kugleradius også beregnes. I eksemplerne vist her blev sfæroider under 75.000 μm3 og over 900.000 μm3 kasseret fra målingerne, men disse parametre kan indstilles af brugeren afhængigt af de ønskede sfæroidegenskaber til analyse. Regneark blev genereret af billedanalysesoftwaren og importeret til RStudio til analyse. Boxplot-grafer blev produceret for at vise de morfologiske egenskaber ved de forskellige typer sfæroider (figur 4). Disse boxplots afslører niveauet af sfæroid heterogenitet i befolkningen, hvorfor det er vigtigt at kvantificere et stort antal sfæroider i et enkelt eksperiment. Dette er en vigtig fordel i forhold til metoder, der genererer en enkelt sfæroid pr. Brønd. De tre sfæroidtyper, der er vist her, viser et højt niveau af lighed med hensyn til deres volumen og overfladeareal, selvom det er bemærkelsesværdigt, at sfæriciteten af HepG2-sfæroider er noget lavere end for de andre typer, der er vist her (figur 4B).
Billeddannelse af sfæroider med et mål med høj opløsning, såsom 63x vandnedsænkningsmålet, der anvendes her, gør det muligt at opnå subcellulær opløsning af individuelle celler i sfæroiden. De forskellige organeller kan segmenteres afhængigt af de anvendte antistoffer. I eksemplet vist her blev lysosomer identificeret baseret på immunstaining ved anvendelse af anti-LAMP1-antistoffer efterfulgt af sekundær antistoftilsætning (figur 3C). Segmenteringen af hver organel i hver celle tillader derefter kvantificering af målinger på celleniveau. Det typiske volumen af hver celle i de tre sfæroidtyper (figur 5A) samt antallet af lysosomer pr. Celle (figur 5B) vises. Behovet for sådanne subcellulære detaljer bestemmes af det assay, hvori sfæroiderne vil blive brugt.
Optimering af den indledende cellesåningstæthed i starten af sfæroidgenerering er et kritisk skridt. Tilføjelse af for mange celler tillader stadig sfæroiddannelse; Dette kan dog resultere i fusion af sfæroider (figur 6). Dette fører til generering af uregelmæssigt formede samlinger, hvilket igen kan være yderst problematisk for nedstrøms identifikation af sfæroiderne. Når sfæroider fejlagtigt identificeres som forskellige strukturer, kan der også være problemer med analysen af de enkelte celler. Som sådan er omhyggelig optimering af hver cellelinje, der anvendes til sfæroidgenereringen, herunder cellesåningstætheden og længden af væksttiden, kritiske parametre at etablere.
Figur 1: Skematisk beskrivelse af den protokol, der bruges til at generere sfæroider til HCS og HCA. 96-brøndplader er belagt med et lag ECM-kældermateriale efterfulgt af såning af celler, som derefter initierer sfæroiddannelse. Medium udskiftes den følgende dag og derefter hver anden dag. Som forberedelse til billeddannelse fastgøres sfæroider, permeabiliseres og immunholdes med specifikke antistoffer. Sfæroider afbildes derefter ved hjælp af et konfokalt HCS-mikroskop. Grafik oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempler på billeder af H358, HepG2 og HT-29 sfæroider. Fuldautomatisk HCS-konfokal billeddannelse af (A) H358, (B) HepG2 og (C) HT-29 sfæroider. Paneler viser en enkelt brøndoversigt samt tre eksempler på konfokale skiver og den volumetriske rekonstruktion af en sfæroid fra hver cellelinje. Kerner farvet med Hoechst 33342 er vist i blåt, actin farvet med fluorescerende konjugeret phalloidin i rødt og lysosomer immunfarvet til LAMP1 i grønt. Billeder af brøndoversigten blev erhvervet med et 20x vandnedsænkningsmål (NA 1.0). Billeder af individuelle sfæroider blev erhvervet med et 63x vandnedsænkningsmål (NA 1.15). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Eksempel på vigtige trin i billedanalyse. (A) Hver sfæroid identificeres først i volumetrisk tilstand ved påvisning af fluorescerende konjugeret phalloidinfarvning. (B) Ved hjælp af disse oplysninger som en maske segmenteres cytoplasmaet i hver celle med den resterende Hoechst 33342-plet, der er til stede i cellecytoplasmaet. Kernerne er segmenteret af Hoechst 33342 pletten. Lysosomerne segmenteres under anvendelse af antistoffet (anti-LAMP1) immunstaining. Volumetriske visninger vises. C) 3-plan visning af den samme sfæroid. Det viste eksempel er af en H358-cellesfæroid. Billeder blev erhvervet med et 63x vandnedsænkningsmål (NA 1.15) Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Eksempler på målinger på sfæroidniveau. Alle målinger blev foretaget ved hjælp af en automatiseret billedanalysepipeline og for tre typer sfæroider, nemlig H358, HepG2 og HT-29, afbildet med et 20x mål. Vist er (A) gennemsnitligt antal kerner pr. sfæroid, (B) sfæroid sfæricitet, (C) sfæroidvolumen og (D) sfæroidoverfladeareal. Alle boxplots viser medianværdien og kvartilerne for hver sfæroidtype. Data er fra 3 replikatbrønde; det samlede antal analyserede sfæroider var 1259 (H358), 1522 (HepG2) og 1326 (HT-29). Billeder blev erhvervet med et 20x vandnedsænkningsmål (NA 1.0). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Eksempler på målinger på celleniveau fra sfæroider. Alle målinger blev foretaget ved hjælp af en automatiseret billedanalysepipeline og for tre typer sfæroider, nemlig H358, HepG2 og HT-29, afbildet med et 63x mål. Vist er (A) volumener af individuelle celler og (B) gennemsnitlige antal lysosomer pr. Celle. Det samlede antal analyserede celler var 1410 (H358), 1625 (HepG2) og 1401 (HT-29) fra 20 sfæroider af hver cellelinje. Billeder blev erhvervet med et 63x vandnedsænkningsmål (NA 1.15) Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Eksempler på billeder, der viser effekter af overbelægning af celler på sfæroiddannelse. Eksempler på billeder vises for H358-, HepG2- og HT-29-sfæroider. Pile angiver steder, hvor sfæroider sandsynligvis er smeltet sammen. Billeder blev erhvervet med et 20x vandnedsænkningsmål (NA 1.0). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den tilgang, der er beskrevet her, beskriver en platform til generering af flere hundrede sfæroider pr. Brønd på en måde, der er egnet til HCS og HCA. I sammenligning med andre populære metoder, såsom brugen af fladbundede og rundbundede ULA-plader, som kun tillader dannelse af en sfæroid pr. Brønd18,19, giver denne metode mulighed for, at information i høj opløsning kan ekstraheres fra et stort antal sfæroider i et screeningsformat. Især er denne metode blevet demonstreret i 3 forskellige cellelinjer, der repræsenterer forskellige tumortyper, hvilket fremhæver dens brede egnethed til at studere en række cellulære processer i forskellige modeller. Selvom de sfæroider, der genereres ved hjælp af denne metode, viser en vis variation i størrelse og form, kan HCA let klassificere dem efter størrelse (eller andre parametre af interesse). Vores laboratorium har med succes brugt denne tilgang til at studere nanopartikelinduceret toksicitet som en funktion af sfæroidstørrelse. Det er vigtigt, at alle de forskellige størrelsesklasser af sfæroider kan studeres i samme brønd, hvilket betyder, at alle blev udsat for identiske behandlinger, hvilket gav meget robuste output fra en stor sfæroidpopulation17. Den metode, der er beskrevet her, kunne let tilpasses til brug med andre celletyper, der repræsenterer forskellige væv. Desuden kan sådanne sfæroider anvendes til at vurdere forskellige biologiske processer14. Hvis sfæroiderne genereres med celler, der stabilt udtrykker fluorescerende mærkede proteiner, er levende cellebilleddannelse også mulig.
Et kritisk trin i denne protokol er produktionen af ECM-kældermaterialelaget, hvorpå cellerne er belagt. Når laget er for tykt, kan det danne en menisk20 , der fremmer væksten af monolag i midten af brønden og sfæroider kun ved brøndens ydre fælge. Derfor er det vigtigt, at den korrekte koncentration og volumen af ECM-kældermaterialet vælges for at muliggøre ensartet sfæroiddannelse i hele brønden; dette er altid cellelinjeafhængigt. Det er også værd at bemærke, at overskydende ECM-kældermateriale kan forårsage problemer under immunfarvningsprocessen, da det ikke let opløses. Dette kan igen føre til komplikationer under billedoptagelse, når du bruger et HCS-konfokalmikroskopsystem. En anden overvejelse er, at forskellige cellelinjer kan kræve forskellige ECM-formuleringer. For eksempel kræver HepG2-sfæroider ECM-kældermateriale med en reduceret koncentration af vækstfaktorer sammenlignet med den, der anvendes af H358- og HT-29-sfæroider. Metoden til cellebelægning er også vigtig, da dette bestemmer, hvordan cellerne fordeles i brønden. Når enten for mange celler er podet, eller når de er dårligt fordelt, kan dette føre til sfæroidfusion (figur 6). En anden udfordring ved at bruge ECM-stilladser er, at de skal håndteres ved lave temperaturer (under 10 °C), hvilket er særligt problematisk, når man bruger automatisering til HCS. Dette problem blev imidlertid for nylig løst af Eismann og kolleger (2020), der anvendte mikroarray-teknologi til at få øje på 0,2 μL dråber ECM-kældermateriale og celler i kammerdias. Dette var tilstrækkeligt materiale til at lette væksten af små sfæroider21. Hvorvidt en sådan fremgangsmåde også vil fungere til plettering af større mængder ECM-kældermateriale i brønde med plader med flere brønde, er endnu ikke påvist.
Et problem forbundet med analysen af 3D-cellemodeller ved hjælp af mikroskopi er evnen til at udtrække information fra de centrale planer i disse samlinger. I denne henseende kan permeabilisering og antistofadgang under immunstaineringsprocessen være problematisk. Protokollen udgivet af Nürnberg og kolleger15 muliggør imidlertid meget konsekvent immunsåbning af hele sfæroiden. Ved hjælp af små ændringer af denne protokol kan denne teknik immunstain selv små subcellulære strukturer (for eksempel lysosomer) med en høj grad af konsistens, uanset om cellerne er centrale eller perifere med hensyn til den samlede sfæroidstruktur. Det er vigtigt, at dette trin optimeres omhyggeligt, når du bruger nye antistoffer.
Et andet kritisk skridt er det valgte billeddannelsesregime. Billeddannelse af det passende antal z-skiver gennem sfæroiden er vigtig, da dette bestemmer mængden af data, der skal analyseres og opbevares. For eksempel kan billeddannelse af et begrænset antal z-planer med for stort interval resultere i en undervurdering af den samlede sfæroidstørrelse og volumen. På den anden side kan optagelse af for mange z-planer resultere i dataanalyse og lagringsproblemer. Meget store datasæt kræver også mere intensiv beregningskraft til deres analyse, især i volumetrisk tilstand. Det optimale samplingsinterval i z-planet dikteres i høj grad af objektivlinsens egenskaber, men for de eksempler, der er vist her, kræves ca. 40 konfokale skiver med et interval på 1,5 μm for at lette billeddannelse gennem hele sfæroidens dybde.
Som nævnt anbefales det kraftigt at anvende en volumetrisk baseret billedanalysemetode for at reducere bias fra analyse af udvalgte planer. Dette gør det muligt ikke kun at udtrække information på sfæroidniveau, men også data på celleniveau fra hver enkelt sfæroid. I sidste ende skal HCA-rørledningerne udformes på en sådan måde, at de tager fat på det specifikke biologiske spørgsmål, der stilles. Multiparametriske output gør det muligt at beskrive komplekse fænotyper kvantitativt. Dette har vist sig at fungere til 3D-cellesamlinger ved hjælp af kommerciel HCA-software16,17 samt frit tilgængelig software som CellProfiler22,23. Volumetriske analysemetoder har potentiale til at blive anvendt på andre 3D-cellemodeltyper, såsom organoider og ex vivo-patientafledte eksplantationer (PDE'er), som endnu bedre replikerer in vivo-betingelser. For nylig er der beskrevet en pipeline med høj gennemstrømning til fremstilling af hjerneorganoider24. Dette indebærer generering af organoider i en plade med 96 brønde og efterfølgende billeddannelse af dem ved hjælp af et screeningsmikroskop med højt indhold24. PDE'er er yderst fordelagtige, fordi de udviser den oprindelige histologi fra tumoren, hvilket giver en cellemodel, der rekapitulerer in vivo-betingelser, herunder funktioner som tumormikromiljø25. Disse modeller kan også i princippet immunfarves, afbildes og analyseres ved hjælp af den her beskrevne fremgangsmåde26,27.
Sammenfattende beskriver denne protokol en tilgængelig og robust metode til storstilet produktion af sfæroider til HCS- og HCA-applikationer. Dens anvendelighed er vist med tre forskellige cellelinjer, der producerer sfæroider, der kan afbildes i høj opløsning. Denne protokol viser også, at volumetrisk analyse kan give kvantitativ information om sfæroidpopulationen såvel som på enkeltcelle- og subcellulære niveauer, hvilket gør den nyttig til en lang række assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen konkurrerende interesser forbundet med dette arbejde.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender støtten fra en infrastrukturforskningsbevilling fra Science Foundation Ireland (SFI) (16 / RI / 3745) til JCS. Arbejdet i UCD Cell Screening Laboratory støttes af UCD College of Science. ASC finansieres af et irsk forskningsråd (IRC) Irlands regering Postgraduate Scholarship (GOIPG / 2019/68). Forfatterne takker også alle medlemmer af laboratoriet for deres input og nyttige diskussioner. Kunstværket i figur 1 blev genereret i BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784 (2020).
- Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
- Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C.
- Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
- Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033 (2019).
- Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
- Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).
- Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
- Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904 (2020).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
- Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).
