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Immunology and Infection

एक सरल, लागत प्रभावी डीएनए अलगाव विधि का उपयोग करके ल्यूपस-प्रवण चूहों में फेकल माइक्रोबायोटा गतिशीलता का विश्लेषण

Published: May 2, 2022 doi: 10.3791/63623
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

यह प्रोटोकॉल ऑटोइम्यून बीमारी के विकास के दौरान मुराइन आंत माइक्रोबायोटा परिवर्तन के विश्लेषण के लिए एक सरल, लागत प्रभावी डीएनए अलगाव विधि प्रदान करता है।

Abstract

प्रतिरक्षा प्रणाली को शिक्षित करने में आंत माइक्रोबायोटा की महत्वपूर्ण भूमिका है। यह संबंध ऑटोइम्यून बीमारियों को समझने के लिए बेहद महत्वपूर्ण है जो न केवल आनुवंशिक कारकों से प्रेरित होते हैं, बल्कि पर्यावरणीय कारक भी होते हैं जो रोग पाठ्यक्रम की शुरुआत और / या खराब कर सकते हैं। ल्यूपस-प्रवण एमआरएल / एलपीआर मादा चूहों में आंत माइक्रोबायोटा की गतिशीलता पर पहले प्रकाशित एक अध्ययन से पता चला है कि आंत माइक्रोबायोटा के परिवर्तन रोग की प्रगति को कैसे बदल सकते हैं। यहां, ऑटोइम्यूनिटी के अध्ययन के लिए आंत माइक्रोबायोटा से प्रतिनिधि नमूने निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। माइक्रोबायोटा के नमूने गुदा से एकत्र किए जाते हैं और संसाधित किए जाते हैं, जिसमें से डीएनए को फिनोल-क्लोरोफॉर्म विधि का उपयोग करके निकाला जाता है और अल्कोहल वर्षा द्वारा शुद्ध किया जाता है। पीसीआर किए जाने के बाद, आर्गोन नेशनल लेबोरेटरी में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच का उपयोग करके शुद्ध एम्प्लिकॉन को अनुक्रमित किया जाता है। अंत में, 16 एस राइबोसोमल आरएनए जीन अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण किया जाता है। एक उदाहरण के रूप में, सीएक्स3सीआर 1 के साथ या बिना एमआरएल / एलपीआर चूहों की आंत माइक्रोबायोटा तुलना से प्राप्त डेटा दिखाया गया है। परिणामों ने रोगजनक बैक्टीरिया वाले जेनेरा में महत्वपूर्ण अंतर दिखाया जैसे कि फाइलम प्रोटियोबैक्टीरिया, साथ ही जीनस बिफीडोबैक्टीरियम, जिसे स्वस्थ कॉमेंसल माइक्रोबायोटा का हिस्सा माना जाता है। सारांश में, यह सरल, लागत प्रभावी डीएनए अलगाव विधि विश्वसनीय है और ऑटोइम्यून बीमारियों से जुड़े आंत माइक्रोबायोटा परिवर्तनों की जांच में मदद कर सकती है।

Introduction

मनुष्य और बैक्टीरिया लंबे समय से सह-अस्तित्व में हैं। उन्होंने पारस्परिक लाभकारी प्रभावों के साथ एक सह-निर्भर संबंध स्थापित किया है जो मात्रात्मक और गुणात्मक तरीकों से मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करताहै। हाल के अध्ययनों से आंत माइक्रोबायोटा संरचना और ऑटोइम्यून बीमारियों के रोगजनन के बीच एक संबंध का सुझाव मिलता है जिसमें मल्टीपल स्केलेरोसिस2, रूमेटोइड गठिया3, टाइप 2 मधुमेह4, सूजन आंत्र रोग5, और प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस (एसएलई) 6 शामिल हैं। हालांकि, क्या आंत माइक्रोबायोटा इन ऑटोइम्यून बीमारियों का मुख्य कारण या द्वितीयक प्रभाव है, यह अभीभी स्पष्ट नहीं है। संभावित रूप से, आंत माइक्रोबायोटा ऑटोइम्यून विकारों के प्रभावक चरण के दौरान बीमारी को बढ़ा सकता है या इन बीमारियों के प्रेरण को विनियमित करने में भूमिका निभासकता है।

महिला ल्यूपस-प्रवण एमआरएल / एमपी-फेस्पर (एमआरएल / एलपीआर) चूहों में आंतों के डिस्बिओसिस की सूचना दी गई है, और लैक्टोबैसिली की महत्वपूर्ण कमी के साथ आंत माइक्रोबायोटापरिवर्तन देखा गया था। जब पांच लैक्टोबैसिलस उपभेदों के मिश्रण को मौखिक रूप से प्रशासित किया गया था, तो ल्यूपस जैसे लक्षण इन चूहों में काफी हद तक क्षीण हो गए थे, जो एसएलई रोगजनन को विनियमित करने में माइक्रोबायोटा की एक आवश्यक भूमिका का सुझाव देते थे।

डीएनए निष्कर्षण की निम्नलिखित तकनीक माइक्रोबायोटा के उतार-चढ़ाव का पालन करने और ल्यूपस-प्रवण चूहों में मुराइन एसएलई जैसी बीमारी के दौरान गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से उनका विश्लेषण करने की अनुमति देती है। चाहे स्वस्थ आंत माइक्रोबायोटा की जांच करें या डिस्बिओसिस को परिभाषित करें, यह गंभीर रूप से जांचना महत्वपूर्ण है कि डेटा कैसे एकत्र किया जाता है और क्या यह सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यहै। इस प्रक्रिया में हर कदम महत्वपूर्ण है। माइक्रोबियल डीएनए निकालने के लिए एक उपयुक्त पद्धति का उपयोग किया जाना चाहिए क्योंकि डीएनए निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान पूर्वाग्रहों को पेश करने वाली किसी भी संभावित समस्या के परिणामस्वरूप गलत माइक्रोबियल प्रतिनिधित्व हो सकता है। जबकि फिनोल-क्लोरोफॉर्म विधि यहां वर्णित है, बैक्टीरिया से डीएनए निकालने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट हैं जोविशेष मामलों में अच्छी तरह से काम करते हैं। हालांकि, उनकी प्रयोज्यता लागत और आवश्यक नमूना मात्रा से सीमित है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल लागत प्रभावी है और केवल थोड़ी मात्रा में नमूने की आवश्यकता होती है। यह किसी भी प्रकार के मल के नमूने के साथ ठीक काम करता है और समय के साथ-साथ समूहों के बीच तुलना के साथ आंत माइक्रोबायोटा की गतिशीलता का अध्ययन करने में उपयोगी है। डीएनए को अल्कोहल शुद्धिकरण की एक विधि के साथ अलग किया जाता है, जो फिनोल, क्लोरोफॉर्म और आइसोएमिल अल्कोहल का उपयोग करता है। अल्कोहल आधारित निष्कर्षण प्रोटीन और लिपिड के नमूने को साफ करने और हटाने में मदद करता है, जहां डीएनए अंतिम चरण में अवक्षेपित होता है। प्रस्तावित विधि में काफी उच्च दक्षता और गुणवत्ता है और बैक्टीरिया की आबादी की पहचान करने में सटीक साबित हुई है। प्रक्रिया के दौरान एक महत्वपूर्ण नोट यह है कि डीएनए संदूषण हो सकता है, और इस प्रकार उचित नमूना हैंडलिंगकी आवश्यकता होती है।

डीएनए का विश्लेषण तब 16 एस आरआरएनए जीन के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्लेटफार्मों द्वारा किया जाता है, जैसे कि इलुमिना मिसेक। विशेष रूप से, वी 4 हाइपर-वैरिएबल क्षेत्र का विश्लेषण उच्च रैंक टैक्सा13 के लिए बेहतर परिमाणीकरण प्रदान करने के लिए किया जाता है। बाद के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण को आउटसोर्स किया जाता है, इसके बाद मानक सांख्यिकीय विधियों का उपयोग करके इन-हाउस विश्लेषण किया जाता है। डाउनस्ट्रीम अनुक्रमण के लिए कई ओपन-सोर्स जैव सूचना विज्ञान सॉफ्टवेयर प्रोग्राम उपलब्ध हैं, और किए गए विश्लेषणों का प्रकार रुचि के विशिष्ट जैविक प्रश्न पर बहुत अधिक निर्भर करताहै। यह प्रोटोकॉल अनुक्रमण से पहले प्रयोगात्मक चरणों पर विशेष रूप से केंद्रित है और फेकल नमूनों से डीएनए प्राप्त करने के लिए एक अधिक बहुमुखी, लागत प्रभावी, तुलनीय और कुशल विधि प्रदान करता है।

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Protocol

B6.129P2 (Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J चूहों के Cx3cr1 gfp/gfp को MRL/Lpr-CX 3CR1gfp/gfp चूहों को उत्पन्न करने के लिए 10 पीढ़ियों के लिए MRL/MPJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) में वापस भेजा गया था। एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) पैनलों का उपयोग करके जीनोम स्क्रीनिंग ने पुष्टि की कि नए उत्पन्न चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि एमआरएल / एलपीआर के समान 97% से अधिक थी। उसके बाद, वर्जीनिया टेक में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) की विशिष्ट आवश्यकताओं के बाद चूहों को एक विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त वातावरण में पाला और बनाए रखा गया था।

1. चूहों से माइक्रोबायोटा नमूनों का संग्रह

  1. प्रत्येक माउस को व्यक्तिगत रूप से अपने पिंजरे से बाहर निकालें। गुदा से सीधे एक फेकल गोली एकत्र करें और इसे संसाधित होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। बाँझ और साफ बल, ट्यूब और दस्ताने के साथ नमूने को संसाधित करें।
    नोट: फेकल नमूने की प्रतीक्षा करते समय माउस रखने के लिए एक कंटेनर (जैसे, एक बीकर) का उपयोग किया जा सकता है। प्रत्येक माउस से पहले और बाद में इथेनॉल के साथ कंटेनर को साफ करें।
  2. एक पूर्व-वजन वाले 2 एमएल स्क्रू-कैप ट्यूब में एक जमे हुए गोली जोड़ें। ग्राम में फेकल वजन रिकॉर्ड करें, जो 0.02-0.05 ग्राम प्रति फेकल पेलेट के बीच होना चाहिए।
  3. गोली में 0.1 मिमी ग्लास बीड्स की एक पतली परत जोड़ें, लाइसिस बफर के 500 μL (50 mM NaCl, 5 mM Tris, और 50 mM EDTA), और 20% SDS के 200 μL।
  4. एक होमोजेनाइज़र (अधिकतम शक्ति पर) में 4 मिनट के लिए ट्यूब को पीटें, इसके बाद 3-5 मिनट का भंवर।
  5. बुलबुले और फोम को खत्म करने के लिए थोड़े समय के लिए स्पिन करें (सेंट्रीफ्यूज पर बटन दबाएं जब तक कि यह 1,000-1,200 एक्स जी तक न पहुंच जाए, और फिर रिलीज हो)।

2. डीएनए निष्कर्षण

  1. चरण 1.5 में प्राप्त सुपरनैटेंट के 350 μL को एक नई 1.5 एमएल स्नैप कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें (किसी भी मलबे को न ले जाना सुनिश्चित करें)। 1 मिनट के लिए फिनोल-क्लोरोफॉर्म-आइसोएमिल अल्कोहल (पीसीआई; 25: 24: 1, वी / वी) मिश्रण और भंवर के 500 μL जोड़ें।
    नोट: अब से, नमूनों को रासायनिक हुड के अंदर संभालने की आवश्यकता है। पीसीआई विषाक्त है।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 6,000 x g पर स्पिन करें। जलीय चरण (शीर्ष परत) के 180 μL को एक नए 1.5 एमएल स्नैप कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें। क्लोरोफॉर्म, इनवर्ट, और मिक्स का 180 μL (1:1) जोड़ें।
    नोट: शीर्ष परत को स्थानांतरित करते समय नीचे की परत से संदूषण को कम करें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 18,400 x g पर स्पिन करें। जलीय चरण के 180 μL को एक नए स्नैप कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: पीसीआई और क्लोरोफॉर्म को त्यागने के बाद, जैविक सुरक्षा कैबिनेट में निम्नलिखित चरण किए जा सकते हैं।
  4. 180 μL ठंडा आइसोप्रोपेनॉल और 36 μL 5M NH4Ac जोड़ें। मिश्रण करने के लिए कुछ बार इनवर्ट करें, और ट्यूब को 20 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 18,400 x g पर स्पिन करें। सतह पर तैरने वाले को त्यागने के लिए डालें। पेलेट को 500 μL ठंडे 70% इथेनॉल के साथ कई बार धोएं।
    नोट: इथेनॉल को डबल विआयनीकृत बाँझ पानी के साथ पतला किया जाना चाहिए।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 18,400 x g पर स्पिन करें। अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने के लिए सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
  7. ट्यूब को टिशू पेपर पर 20 मिनट के लिए उल्टा सुखाएं, जब तक कि गोली स्पष्ट न हो जाए। आणविक ग्रेड पानी के 50 μL में गोली को निलंबित करें। बड़े डीएनए छर्रों को पूरी तरह से भंग करने के लिए 10 मिनट के लिए तरल को 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
  8. ढक्कन पर संघनन की बूंदों को पुनर्प्राप्त करने के लिए गर्म करने के बाद ट्यूबों को स्पिन करें (1 मिनट के लिए 3,400 x g )।
  9. एकाग्रता को मापें और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 260/280 अनुपात प्राप्त करें। रिक्त स्थान के रूप में आणविक-ग्रेड पानी का उपयोग करें। अच्छी गुणवत्ता वाले डीएनए में 1.8 और 2 के बीच 260/280 अनुपात होना चाहिए।
    नोट: अपेक्षित डीएनए उपज कम से कम 0.03 ग्राम प्रति फेकल गोली है।

3. 16 एस आरआरएनए जीन अनुक्रमण के लिए नमूना तैयारी

  1. डीएनए नमूने आर्गोन नेशनल लेबोरेटरी में भेजें, जहां वे पुस्तकालय की तैयारी से गुजरते हैं और इलुमिना मिसेक पर अनुक्रमित होते हैं।
    1. नमूने को पूरी तरह से स्कर्ट वाली 96-अच्छी प्लेटों में भेजें, जिसमें नमूने पंक्तियों (ए 1-ए 12, बी 1-बी 12, आदि) में व्यवस्थित हों, और पन्नी प्लेट सील के साथ सील किए गए हों।
    2. प्रति कुएं प्रति नमूना 20 μL की अंतिम मात्रा भेजें, जो 1-50 ng / μL से एकाग्रता में हो।
      नोट: आणविक-ग्रेड पानी के साथ कमजोर पड़ना चाहिए।
    3. नमूने तैयार करने के बाद, 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को फ्रीज करने से पहले कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 600 x g पर स्पिन करें।
    4. सूखी बर्फ पर रात भर भेजें।

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Representative Results

आर्गोन नेशनल लेबोरेटरी के परिणामों का विश्लेषण एक योग्य जैव सूचना विज्ञानी द्वारा किया जाता है, इसके बाद मानक सांख्यिकीय विधियों का उपयोग करके डेटा का इन-हाउस विश्लेषण किया जाता है। विशिष्ट माइक्रोबायोम विश्लेषण में एक नमूने में विभिन्न सूक्ष्मजीवों के लिए प्रॉक्सी के रूप में परिचालन टैक्सोनोमिक इकाइयों (ओटीयू) या एम्प्लिकॉन अनुक्रम वेरिएंट (एएसवी) में समान अनुक्रमों का क्लस्टरिंग शामिल है। नमूनों में ओटीयू या एएसवी की गणना का उपयोग तब नमूना (अल्फा) विविधता और नमूना (बीटा) विविधता के बीच परिवर्तन के लिए परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। उनका उपयोग टैक्सा के परीक्षण के लिए भी किया जा सकता है जो ब्याज की मेटाडेटा श्रेणियों में अलग-अलग प्रचुर मात्रा में हैं।

जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है, रिसेप्टर सीएक्स3सीआर 1 की कमी वाले माउस तनाव में एक अलग आंत माइक्रोबायोटा संरचना है। वाइल्डटाइप एमआरएल / एलपीआर की तुलना में, एमआरएल / एलपीआर-सीएक्स3सीआर 1जीएफपी / जीएफपी चूहों (सीएक्स3सीआर 1 के बजाय हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करना) संभावित रोगजनक बैक्टीरिया के लिए प्रासंगिक कुछ जेनेरा में महत्वपूर्ण अंतर दिखाते हैं जैसे कि फाइलम प्रोटियोबैक्टीरिया में। इसके अलावा, "स्वस्थ" कॉमेंसल बैक्टीरिया जैसे बिफीडोबैक्टीरियम के लिए कुछ अंतर नोट किए गए थे, लेकिन लैक्टोबैसिलस नहीं।

Figure 1
चित्रा 1: एमआरएल / एलपीआर और एमआरएल / एलपीआर-सीएक्स3सीआर 1 चूहों के लिए जीनस स्तर पर आंत माइक्रोबायोटा की तुलना। 13, 14 और 15 सप्ताह की उम्र में विभिन्न जेनेरा की बहुतायत (एन = 5 महिला चूहे प्रति समूह)। दो-तरफा एनोवा का प्रदर्शन किया गया था। कोई महत्व नहीं ('एनएस'), * पी < 0.05, ** पी < 0.01। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

संतुलित आंत माइक्रोबायोटा मानव शरीर को बीमारियों से बचा सकता है। एक बार जब यह संतुलन बाहरी या आंतरिक ट्रिगर्स द्वारा बाधित हो जाता है, तो परिणाम विनाशकारी हो सकते हैं। यह विधि मुराइन मॉडल में आंत माइक्रोबायोटा की गतिशीलता का विश्लेषण करने का एक तरीका प्रस्तुत करती है। विधि न केवल समूहों के बीच तुलना के लिए उपयुक्त है, बल्कि समय के साथ आंत माइक्रोबायोटा को ट्रैक करने के लिए भी उपयुक्त है ताकि आंत माइक्रोबायोटा को बाधित करने वाले समय-निर्भर कारकों की बेहतर पहचान की जा सके।

प्रयोग में सभी चूहों को एक ही वातावरण में संभाला जाना चाहिए। फेकल नमूने एकत्र करते समय विचार करने के लिए एक आवश्यक मामला समय, दिन और स्थान के अनुरूप होना है। चूहे कोप्रोफैजिक होते हैं। इसका मतलब है कि वे आवश्यक पोषक तत्व प्राप्त करने के लिए अपने मल या अपने आसपास के लोगों को खाते हैं। इसलिए, पिंजरे से मल एकत्र नहीं किया जा सकता है। नमूने ताजा और सीधे गुदा से एकत्र करने की आवश्यकता है। सबसे अच्छा तरीका यह है कि माउस को पकड़ते समय मालिश करें या माउस को कंटेनर में रखें। इसके अलावा, यह सिफारिश की जाती है कि नमूने एक ही समय में संसाधित किए जाते हैं और सभी नमूनों के तैयार होने की प्रतीक्षा करते हुए -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए हैं।

डीएनए निष्कर्षण पाइपिंग और हैंडलिंग के प्रति बेहद संवेदनशील है, इसलिए सभी नमूनों को एक ही समय में संसाधित किया जाना चाहिए। एक और विचार पर्यावरणीय संदूषण से बचने के लिए है; इसलिए, विषाक्त अभिकर्मकों के कारण रासायनिक हुड में किए जाने वाले हर एक कदम को जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए। भले ही पर्यावरणीय संदूषण की संभावना कम है और बैक्टीरिया को बढ़ने की अनुमति देने के लिए कोई कदम नहीं है, यह विधि बेहद संवेदनशील है, और किसी भी संभावित संदूषण से बचना बिल्कुल अनुशंसित है। इसके अतिरिक्त, छर्रों का वजन करने से नमूनों के बीच स्थिरता बढ़ाने में मदद मिलेगी। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट पर एक लाभ के रूप में, यह विधि डीएनए की उच्च सांद्रता प्राप्त करने के लिए विशेष रूप से अच्छी है। इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त डीएनए उपज फेकल गोली के वजन के आधार पर 0.03 ग्राम और 0.07 ग्राम के बीच होती है। इसकी तुलना में, वाणिज्यिक किट 0.005 ग्राम से 0.05 ग्राम के बीच उपज दे सकते हैं, लेकिन कॉलम प्रतिधारण चरण द्वारा सीमित संतृप्ति की उच्च संभावना के साथ।

फीकल गोली को छोटे टुकड़ों में तोड़ने में मोती-धड़कन चरण महत्वपूर्ण है ताकि लाइसिस एजेंट सभी बैक्टीरिया तक पहुंच सके। यदि यह चरण अच्छी तरह से प्रदर्शन नहीं किया जाता है, तो छर्रों को आंशिक रूप से विघटित किया जा सकता है, और कम प्रतिनिधि बैक्टीरिया तक पहुंचा जा सकता है। इसके अलावा, सुपरनैटेंट को स्थानांतरित करते समय, सही पाइपिंग महत्वपूर्ण है, क्योंकि पिछले चरण से अवशिष्ट बफर का हिस्सा ले जाने से अंत में डीएनए की उपज और गुणवत्ता में बदलाव आएगा।

16 एस राइबोसोमल आरएनए जीन अनुक्रमण के लिए नमूनों को पतला करते समय, नमूनों को फ्रीजर में डालने से पहले जल्दी से कार्य करना महत्वपूर्ण है। कमजोर पड़ने से पहले नमूनों को अच्छी तरह से मिश्रण करना भी महत्वपूर्ण है। लंबे समय तक कमरे के तापमान पर नमूने छोड़ने से बचें। चूंकि वॉल्यूम छोटे हैं, इसलिए शिपिंग से पहले प्लेट में नमूने फ्रीज करने से नुकसान को कम करने में मदद मिलेगी।

आर्गोन नेशनल लेबोरेटरी 16 एस आरआरएनए जीन के वी 4 क्षेत्र का विश्लेषण करती है। वी 4 क्षेत्र अन्य क्षेत्रों की तुलना में बेहतर संरक्षित है और उच्च रैंक टैक्सा13 के लिए बेहतर अनुमान है। जबकि अन्य क्षेत्र तेजी से विकसित प्रजातियों के विश्लेषण के लिए बेहतर हैं और जीनस या प्रजातियों की पहचान करने और बेहतर भेदभाव करने में मदद कर सकते हैं, वे क्षेत्र वी 4 की तुलना में तेजी से उत्परिवर्तन जमा करते हैं।

एक बार जब परिणाम वापस आ जाते हैं और एक योग्य जैव सूचना विज्ञानी द्वारा विश्लेषण किया जाता है, तो परिणामों को प्लॉट करने और समूहों की तुलना करने के लिए सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है। इस तकनीक की सीमाओं और जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के बाद के परिणामों को समझना महत्वपूर्ण है। टैक्सोनोमिक स्तर जितना कम होगा, सटीकता उतनी ही कम होगी या भिन्नताएं अधिक होंगी। फाइलम से परिवार तक, और यहां तक कि जीनस स्तर का विश्वसनीयता के साथ विश्लेषण किया जा सकता है। हालांकि, प्रजातियों के स्तर पर एनोटेशन इस विधि के साथ सटीक नहीं हैं। दूसरी ओर, शॉटगन अनुक्रमण, प्रजातियों के स्तर तक पहुंच सकता है; हालांकि, जबकि यह एक समुदाय के जैविक कार्यों में अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है, 16 एस आरआरएनए जीन अनुक्रमण अभी भी एक माइक्रोबियल समुदायके वर्गीकरण वितरण को निर्धारित करने के लिए एक सटीक और लागत कुशल विधि है।

सारांश में, आंत माइक्रोबायोटा का विश्लेषण करने और अधिकतम सटीकता के साथ इसकी गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक लागत-कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो समय के साथ अनुदैर्ध्य परिवर्तनों के साथ-साथ समूहों के बीच मतभेदों को प्रकट करने में मदद कर सकता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम आर्गोन नेशनल लेबोरेटरी और हमारे सहयोगी जैव सूचना विज्ञानियों की मदद की सराहना करते हैं। यह काम विभिन्न एनआईएच और आंतरिक अनुदानों द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 mm glass beads BioSpec Products 11079101
2 mL screw cap tubes Thermo Fisher Scientific 3488
20% SDS FisherScientific BP1311-1 SDS 20%
96% Ethanol, Molecular Biology Grade Thermo Fisher Scientific T032021000CS
Ammonium Acetate (5 M) Thermo Fisher Scientific AM9071 NH4AC 5M
B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J Jackson Laboratory 005582
Bullet Blender storm 24 Next Advance 4116-BBY24M Homogenizer
Chloroform FisherScientific C298-500
DEPC-Treated Water Thermo Fisher Scientific AM9916
Ethylenediamine Tetraacetic Acid FisherScientific BP118-500 EDTA
Foil plate seal FisherScientific NC0302491
Kimwipes-Kimtech 34256 FisherScientific 06-666C
MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice Jackson Laboratory 000485
Nanodrop 2000 spectrophotomer Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) FisherScientific BP1752I-400 PCI
Scale with 4 decimals Mettler Toledo MS205DU
Skirted 96-well plates Thermo Fisher Scientific AB-0800
Sodium chloride FisherScientific 15528154 NaCl
Tris Hydrochloride FisherScientific BP1757-100
Vortex Scientific Industries SI-0236

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References

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Cabana Puig, X., Reilly, C. M., Luo, … More

Cabana Puig, X., Reilly, C. M., Luo, X. M. Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method. J. Vis. Exp. (183), e63623, doi:10.3791/63623 (2022).

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