Summary
Detta protokoll ger en enkel, kostnadseffektiv DNA-isoleringsmetod för analys av murina tarmmikrobiotaförändringar under utvecklingen av autoimmun sjukdom.
Abstract
Tarmmikrobiota har en viktig roll för att utbilda immunsystemet. Detta förhållande är oerhört viktigt för att förstå autoimmuna sjukdomar som inte bara drivs av genetiska faktorer utan också miljöfaktorer som kan utlösa uppkomsten och / eller förvärra sjukdomsförloppet. En tidigare publicerad studie om tarmmikrobiotans dynamik hos lupusbenägna MRL/lpr-honmöss visade hur förändringar i tarmmikrobiotan kan förändra sjukdomsförloppet. Här beskrivs ett protokoll för att extrahera representativa prover från tarmmikrobiotan för studier av autoimmunitet. Mikrobiotaprover samlas in från anus och bearbetas, från vilka DNA extraheras med användning av en fenol-kloroformmetod och renas genom alkoholutfällning. Efter att PCR har utförts sekvenseras renade amplikoner med hjälp av en nästa generations sekvenseringsplattform vid Argonne National Laboratory. Slutligen analyseras 16S ribosomala RNA-gensekvenseringsdata. Som ett exempel visas data som erhållits från tarmmikrobiotajämförelser av MRL/lpr-möss med eller utan CX3CR1. Resultaten visade signifikanta skillnader i släkten som innehåller patogena bakterier såsom de i fylumet Proteobacteria, liksom släktet Bifidobacterium, som anses vara en del av den friska kommensala mikrobiotan. Sammanfattningsvis är denna enkla, kostnadseffektiva DNA-isoleringsmetod tillförlitlig och kan hjälpa till att undersöka tarmmikrobiotaförändringar i samband med autoimmuna sjukdomar.
Introduction
Människor och bakterier har samexisterat under lång tid. De har etablerat ett medberoende förhållande med ömsesidiga fördelaktiga effekter som påverkar värdens immunsvar på kvantitativa och kvalitativa sätt1. Nya studier tyder på ett samband mellan tarmmikrobiotakompositionen och patogenesen av autoimmuna sjukdomar som inkluderar multipel skleros 2, reumatoid artrit3, typ2-diabetes 4, inflammatorisk tarmsjukdom5 och systemisk lupus erythematosus (SLE)6. Huruvida tarmmikrobiotan är huvudorsaken eller en sekundär effekt av dessa autoimmuna sjukdomar är dock fortfarande oklart7. Potentiellt kan tarmmikrobiota förvärra sjukdomen under effektorfasen av autoimmuna störningar eller spela en roll för att reglera induktionen av dessa sjukdomar8.
Tarmdysbios har rapporterats hos kvinnliga lupusbenägna MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) möss, och tarmmikrobiotaförändringar med en signifikant utarmning av laktobaciller observerades9. När en blandning av fem Lactobacillus stammar administrerades oralt, lupus-liknande symtom dämpades till stor del i dessa möss, vilket tyder på en viktig roll av mikrobiota i regleringen av SLE patogenes.
Följande teknik för DNA-extraktion gör det möjligt att följa mikrobiotafluktuationer och analysera dem kvalitativt och kvantitativt under loppet av murin SLE-liknande sjukdom hos lupusbenägna möss. Oavsett om man ska undersöka den friska tarmmikrobiotan eller definiera dysbios är det viktigt att kritiskt undersöka hur data samlas in och om den är korrekt och reproducerbar10. Varje steg är avgörande i denna process. En lämplig metod måste användas för att extrahera mikrobiellt DNA eftersom eventuella problem med att införa fördomar under DNA-extraktionsprocessen kan leda till felaktig mikrobiell representation. Medan fenol-kloroformmetoden beskrivs här finns det kommersiellt tillgängliga kit för att extrahera DNA från bakterier som fungerar bra i vissa fall11. Deras användbarhet begränsas emellertid av kostnaden och den erforderliga provkvantiteten.
Protokollet som presenteras här är kostnadseffektivt och kräver endast en liten mängd prov. Det fungerar bra med alla typer av avföringsprover och är användbart för att studera dynamiken i tarmmikrobiotan över tid samt jämförelser mellan grupper. DNA isoleras med en metod för alkoholrening, som använder fenol, kloroform och isoamylalkohol. Alkoholbaserad extraktion hjälper till att rengöra och ta bort provet av proteiner och lipider, där DNA fälls ut i det sista steget. Den föreslagna metoden har signifikant hög effektivitet och kvalitet och har visat sig vara korrekt vid identifiering av bakteriepopulationer. En kritisk anmärkning under proceduren är att DNA-kontaminering kan uppstå, och därmed krävs lämplig provhantering12.
DNA:t analyseras sedan av nästa generations sekvenseringsplattformar för 16S rRNA-genen, såsom Illumina MiSeq. I synnerhet analyseras V4 hypervariabelregionen för att ge en bättre kvantifiering för högt rankade taxa13. Den efterföljande bioinformatikanalysen outsourcas, följt av intern analys med hjälp av vanliga statistiska metoder. Det finns många bioinformatikprogram med öppen källkod tillgängliga för nedströms sekvensering, och vilken typ av analyser som utförs beror starkt på den specifika biologiska frågan av intresse14. Detta protokoll fokuserar specifikt på de experimentella stegen före sekvensering och ger en mer mångsidig, kostnadseffektiv, jämförbar och effektiv metod för att erhålla DNA från fekala prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cx3cr1 gfp/gfp-locus för B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J-mössen backades tillbaka till MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) i 10 generationer för att generera MRL/lpr-CX 3CR1 gfp/gfp-möss. Genomscreening med hjälp av SNP-paneler (single nucleotide polymorphism) bekräftade att den genetiska bakgrunden hos nygenererade möss var mer än 97% identisk med den för MRL/lpr. Därefter föddes möss och underhålls i en specifik patogenfri miljö enligt de specifika kraven från Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Virginia Tech.
1. Insamling av mikrobiotaprover från möss
- Ta varje mus individuellt ur buren. Samla upp en fekal pellet direkt från anus och förvara den vid -80 °C tills den bearbetas. Bearbeta proverna med sterila och rena pincett, rör och handskar.
OBS: En behållare (t.ex. en bägare) kan användas för att placera musen medan du väntar på fekalprovet. Rengör behållaren med etanol före och efter varje mus. - Tillsätt en frusen pellet i ett förvägd 2 ml skruvlockrör. Registrera fekalvikten i gram, som bör vara mellan 0,02-0,05 g per fekal pellet.
- Lägg till pelleten ett tunt lager av 0,1 mm glaspärlor, 500 μL lysbuffert (50 mM NaCl, 5 mM Tris och 50 mM EDTA) och 200 μL 20% SDS.
- Slå röret i 4 minuter i en homogenisator (vid maximal effekt), följt av 3-5 min virvel.
- Snurra en kort stund för att eliminera bubblorna och skummet (tryck på knappen på centrifugen tills den når 1 000-1 200 x g och släpp sedan).
2. DNA-extraktion
- Överför 350 μL supernatant som erhållits i steg 1.5 (se till att det inte bär på skräp) till ett nytt 1,5 ml snäpplockrör. Tillsätt 500 μl fenol-kloroform-isoamylalkohol (PCI; 25:24:1, v/v) blandning och virvel i 1 min.
OBS: Från och med nu måste prover hanteras inuti en kemisk huva. PCI är giftigt. - Snurra vid 6 000 x g i 3 minuter vid 4 °C. Överför 180 μL av vattenfasen (toppskiktet) till ett nytt 1,5 ml snäpplockrör. Tillsätt 180 μl (1:1) kloroform, invertera och blanda.
OBS: Minimera förorening från bottenskiktet vid överföring av toppskiktet. - Snurra på 18 400 x g i 3 min vid 4 °C. Överför 180 μL av vattenfasen till ett nytt snäpplockrör.
OBS: Efter kassering av PCI och kloroform kan följande steg utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp. - Tillsätt 180 μl kall isopropanol och 36 μl 5MNH4Ac. Invertera några gånger för att blanda och lägg röret på is i 20 minuter.
- Snurra vid 18 400 x g i 20 minuter vid 4 °C. Häll för att kasta supernatanten. Tvätta pelleten flera gånger med 500 μl kall 70% etanol medan du inverterar.
OBS: Etanol ska spädas med dubbelt avjoniserat sterilt vatten. - Snurra på 18 400 x g i 3 min vid 4 °C. Kassera supernatanten för att ta bort kvarvarande etanol.
- Lufttorka röret upp och ner på silkespapper i 20 minuter tills pelleten blir klar. Suspendera pelleten i 50 μl vatten av molekylär kvalitet. Värm vätskan vid 37 °C i 10 minuter för att helt lösa upp stora DNA-pellets.
- Snurra rör efter uppvärmning för att återvinna kondensdroppar på locket (3 400 x g i 1 min).
- Mät koncentrationen och få förhållandet 260/280 med hjälp av en spektrofotometer. Använd molekylärt vatten som ett ämne. DNA av god kvalitet bör ha 260/280-förhållanden mellan 1,8 och 2.
OBS: Förväntad DNA-utbyte är minst 0,03 g per fekal pellet.
3. Provberedning för 16S rRNA-gensekvensering
- Skicka DNA-proverna till Argonne National Laboratory, där de genomgår biblioteksförberedelser och sekvenseras på Illumina Miseq.
- Skicka prover i helt sockrade 96-brunnsplattor, med prover ordnade i rader (A1-A12, B1-B12, etc.) och förseglade med folieplåtstätningar.
- Skicka en slutlig volym på 20 μL per prov per brunn, i koncentration från 1-50 ng/μl.
OBS: Utspädningar bör göras med vatten av molekylär kvalitet. - Efter att ha förberett proverna, snurra vid 600 x g i 1 min vid rumstemperatur innan proverna fryses vid -80 °C i 24 timmar.
- Skicka över natten på torris.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten från Argonne National Laboratory analyseras av en kvalificerad bioinformatiker, följt av en intern analys av data med hjälp av statistiska standardmetoder. Typiska mikrobiomanalyser involverar klustring av liknande sekvenser i operativa taxonomiska enheter (OTU) eller ampliconsekvensvarianter (ASV) som en proxy för olika mikroorganismer i ett prov. Antal OTU eller ASV:er över prover kan sedan användas för att testa förändringar i mångfald inom provet (alfa) och mångfald mellan prov (beta). De kan också användas för att testa för taxa som är olika rikliga mellan metadatakategorier av intresse.
Som visas i figur 1 har musstammen som saknar receptorn CX3CR1 en annan tarmmikrobiotakomposition. Jämfört med MRL/lpr av vildtyp visar MRL/lpr-CX3 CR1 gfp/gfp-möss (som uttrycker det gröna fluorescerande proteinet istället för CX3CR1) signifikanta skillnader i vissa släkten som är relevanta för potentiellt patogena bakterier, såsom de i fylumet Proteobacteria. Ytterligare, vissa skillnader noterades för "friska" kommensala bakterier såsom Bifidobacterium, men inte Lactobacillus.
Figur 1: Jämförelser av tarmmikrobiota på släktnivå för MRL/lpr och MRL/lpr-CX3CR1-möss. Överflödet av olika släkten vid 13, 14 och 15 veckors ålder (n = 5 kvinnliga möss per grupp). Tvåvägs ANOVA utfördes. Ingen signifikans ('ns'), *P < 0,05, **P < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Balanserad tarmmikrobiota kan skydda människokroppen från sjukdomar. När denna balans störs av externa eller interna utlösare kan konsekvenserna bli förödande. Denna metod presenterar ett sätt att analysera dynamiken i tarmmikrobiota i murina modeller. Metoden lämpar sig inte bara för jämförelser mellan grupper utan också för att spåra tarmmikrobiotan över tid för att bättre identifiera tidsberoende faktorer som stör tarmmikrobiotan.
Alla möss i experimentet måste hanteras i samma miljö. En viktig sak att tänka på när du samlar fekala prover är att vara konsekvent med tid, dag och plats. Möss är koprophagiska. Detta innebär att de äter avföring eller de omkring dem för att få viktiga näringsämnen. Därför kan avföring inte samlas in från buret. Prover måste samlas in färska och direkt från anusen. Den bästa metoden är att massera musen medan du håller den eller placera musen i en behållare. Dessutom rekommenderas att proverna bearbetas samtidigt och fryses vid -80 °C i väntan på att alla prover ska vara klara.
DNA-extraktion är extremt känslig för pipettering och hantering, så alla prover bör behandlas samtidigt. Ett annat övervägande är att undvika miljöföroreningar; Därför bör varje steg som inte nödvändigtvis utförs i den kemiska huven på grund av de giftiga reagenserna göras i ett biologiskt säkerhetsskåp. Även om risken för miljöförorening är låg och det inte finns något steg för att tillåta bakterier att växa, är denna metod extremt känslig, och att undvika eventuell förorening rekommenderas absolut. Dessutom kommer vägning av pellets att bidra till att öka konsistensen mellan proverna. Som en fördel jämfört med kommersiellt tillgängliga kit är denna metod särskilt bra för att uppnå höga koncentrationer av DNA. DNA-utbytet erhållet med detta protokoll varierar mellan 0,03 g och 0,07 g beroende på vikten av fekalpelleten. Som jämförelse kan kommersiella kit ge mellan 0,005 g och 0,05 g, men med en högre risk för mättnad som begränsas av kolonnretentionssteget.
Pärlslagningssteget är viktigt för att bryta fekalpelleten i små bitar så att lysmedlet kan nå alla bakterier. Om detta steg inte utförs väl kan pellets delvis sönderdelas och färre representativa bakterier kan nås. Vid överföring av supernatanter är dessutom korrekt pipettering viktigt, eftersom bärande av en del av restbufferten från föregående steg skulle förändra utbytet och kvaliteten på DNA i slutet.
Vid utspädning av proverna för 16S ribosomal RNA-gensekvensering är det viktigt att agera snabbt innan proverna läggs i frysen. Det är också viktigt att blanda prover väl innan utspädningar utförs. Undvik att lämna prover i rumstemperatur under långa perioder. Eftersom volymerna är små kommer frysning av proverna i plattan innan de skickas att hjälpa till att minimera förlusten.
Argonne National Laboratory analyserar V4-regionen i 16S rRNA-genen. V4-regionen är bättre bevarad än de andra regionerna och har en bättre uppskattning för högt rankade taxa13. Medan de andra regionerna är bättre för analys av snabbt utvecklande arter och kan hjälpa till att identifiera och bättre diskriminera släkt eller arter, ackumulerar dessa regioner mutationer snabbare än V4.
När resultaten är tillbaka och analyseras av en kvalificerad bioinformatiker kan statistisk programvara användas för att plotta resultaten och jämföra grupper. Det är viktigt att förstå begränsningarna med denna teknik och resultaten efter bioinformatikanalys. Ju lägre taxonomisk nivå, desto mindre noggrannhet eller större variationer. Från fylum till familj, och även släktnivån kan analyseras med tillförlitlighet. Anteckningar på artnivå är dock inte korrekta med denna metod. Hagelgevärssekvensering kan å andra sidan nå artnivån; men även om det kan ge mer insikt i de biologiska funktionerna i ett samhälle, är 16S rRNA-gensekvensering fortfarande en exakt och kostnadseffektiv metod för att kvantifiera taxonomiska fördelningar av ett mikrobiellt samhälle15.
Sammanfattningsvis har ett kostnadseffektivt protokoll beskrivits för att analysera tarmmikrobiotan och studera dess dynamik med maximal noggrannhet som kan hjälpa till att avslöja longitudinella förändringar över tid samt skillnader mellan grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi uppskattar hjälpen från Argonne National Laboratory och våra samarbetande bioinformatiker. Detta arbete stöds av olika NIH och interna bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
- Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).
- Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).
- Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).
- Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
- Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
- Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).
- Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).
- Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).
- Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365 (2016).
- Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).
- Galloway-Peña, J., Hanson, B.
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).
