使用简单、经济高效的DNA分离方法分析狼疮易发小鼠的粪便微生物群动力学

Summary

该协议提供了一种简单，具有成本效益的DNA分离方法，用于分析自身免疫性疾病发展过程中的小鼠肠道微生物群改变。

Abstract

肠道微生物群在教育免疫系统方面起着重要作用。这种关系对于理解自身免疫性疾病非常重要，这些疾病不仅由遗传因素驱动，而且由可能引发发病和/或恶化病程的环境因素驱动。之前发表的一项关于狼疮易感MRL / lpr雌性小鼠肠道微生物群动力学的研究表明，肠道微生物群的变化如何改变疾病进展。在这里，描述了一种方案，用于从肠道微生物群中提取代表性样本以进行自身免疫研究。从肛门收集微生物群样品并进行处理，使用苯酚 - 氯仿方法从中提取DNA，并通过酒精沉淀纯化。进行PCR后，使用阿贡国家实验室的下一代测序平台对纯化的扩增子进行测序。最后，对16S核糖体RNA基因测序数据进行分析。例如，显示了从具有或不具有CX₃CR1的MRL / lpr小鼠的肠道微生物群比较中获得的数据。结果显示，含有致病菌的属（例如变形杆菌门中的菌属）以及被认为是健康共生微生物群一部分的 双歧杆菌属存在显着差异。总之，这种简单、经济高效的DNA分离方法是可靠的，可以帮助研究与自身免疫性疾病相关的肠道微生物群变化。

Introduction

人类和细菌已经共存了很长时间。它们与互惠互利的关系建立了相互依赖的关系，以定量和定性的方式影响宿主的免疫反应¹。最近的研究表明，肠道微生物群组成与自身免疫性疾病的发病机制之间存在关联，这些疾病包括多发性硬化症 2、类风湿性关节炎³、² 型糖尿病⁴、炎症性肠病⁵ 和系统性红斑狼疮 （SLE）⁶。然而，肠道微生物群是这些自身免疫性疾病的主要原因还是次要影响尚不清楚⁷。潜在地，肠道微生物群可能在自身免疫性疾病的效应阶段加剧疾病，或在调节这些疾病的诱导中发挥作用⁸。

在雌性狼疮易感MRL / Mp-Faslpr（MRL / lpr）小鼠中报告了肠道生态失调，^{并且观察到肠道}微生物群变化伴乳酸杆菌显着消耗9。当口服五种乳酸杆菌菌株的混合物时，这些小鼠的狼疮样症状在很大程度上减轻，这表明微生物群在调节SLE发病机制方面起着重要作用。

以下DNA提取技术允许跟踪微生物群波动，并在狼疮易感小鼠的鼠SLE样疾病过程中定性和定量地分析它们。无论是检查健康的肠道微生物群还是定义生态失调，重要的是要批判性地检查数据的收集方式以及数据是否准确和可重复¹⁰。在这个过程中，每一步都至关重要。必须使用适当的方法来提取微生物DNA，因为在DNA提取过程中引入偏差的任何可能的问题都可能导致微生物表示不准确。虽然这里描述了苯酚-氯仿方法，但有一些市售试剂盒可以从细菌中提取DNA，在特定情况下效果很好¹¹。但是，它们的可用性受到成本和所需样品数量的限制。

这里介绍的方案具有成本效益，只需要少量样品。它适用于任何类型的粪便样本，并且有助于研究肠道微生物群随时间推移的动态以及组之间的比较。DNA使用苯酚，氯仿和异戊醇的酒精纯化方法分离。基于酒精的提取有助于清洁和去除蛋白质和脂质样品，其中DNA在最后一步沉淀。所提出的方法具有显著的高效率和质量，并且已被证明在鉴定细菌种群方面是准确的。手术过程中的一个关键注意事项是可能发生DNA污染，因此需要进行适当的样品处理¹²。

然后通过下一代测序平台分析DNA的16S rRNA基因，例如Illumina MiSeq。特别是，分析V4超可变区域，为高等级分类群¹³提供更好的定量。随后的生物信息学分析被外包，然后使用标准统计方法进行内部分析。有许多开源生物信息学软件程序可用于下游测序，并且执行的分析类型在很大程度上取决于感兴趣的特定生物学问题¹⁴。该协议特别关注测序前的实验步骤，并提供一种更通用、更具成本效益、可比性和更有效的方法来从粪便样品中获取 DNA。

Protocol

将B6.129P2（Cg）-Cx3cr1^tm1Litt/J小鼠的Cx3cr1 gfp/^gfp位点回交至MRL/MpJ-Fas lpr/J（MRL/lpr）10代，产生MRL/^lpr-CX ₃CR1^gfp/gfp小鼠。使用单核苷酸多态性（SNP）面板进行基因组筛选证实，新生成的小鼠的遗传背景与MRL / lpr的遗传背景相同97%以上。之后，按照弗吉尼亚理工大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的特定要求，在特定的无病原体环境中繁殖和维持小鼠。

1. 收集小鼠微生物群样本

1. 将每只老鼠单独从笼子里拿出来。直接从肛门收集粪便颗粒并将其储存在-80°C直至处理。用无菌和干净的镊子、管子和手套处理样品。
   注意：容器（例如烧杯）可用于在等待粪便样本时放置鼠标。在每只小鼠之前和之后用乙醇清洁容器。
2. 将冷冻沉淀添加到预先称重的 2 mL 螺旋盖管中。以克为单位记录粪便重量，每个粪便颗粒应在0.02-0.05克之间。
3. 向沉淀中加入一层薄薄的 0.1 mm 玻璃珠、500 μL 裂解缓冲液（50 mM NaCl、5 mM Tris 和 50 mM EDTA）和 200 μL 20% SDS。
4. 在均质器（最大功率）中将试管拍打4分钟，然后涡旋3-5分钟。
5. 旋转短时间以消除气泡和泡沫（按下离心机上的按钮，直到达到 1，000-1，200 x g，然后松开）。

2. 脱氧核糖核酸提取

1. 将步骤 1.5 中获得的 350 μL 上清液（确保不携带任何碎屑）转移到新的 1.5 mL 卡扣盖管中。加入 500 μL 苯酚-氯仿-异戊醇 （PCI; 25：24：1， v/v） 混合物并涡旋 1 分钟。
   注意：从现在开始，样品需要在化学罩内处理。PCI是有毒的。
2. 在4°C下以6，000× g 旋转3分钟。 将 180 μL 水相（顶层）转移到新的 1.5 mL 卡扣帽管中。加入 180 μL （1：1） 氯仿，转化并混合。
   注意：转移顶层时，尽量减少底层的污染。
3. 在4°C下以18，400× g 旋转3分钟。 将 180 μL 水相转移到新的卡扣帽管中。
   注意：丢弃PCI和氯仿后，可以在生物安全柜中执行以下步骤。
4. 加入 180 μL 冷异丙醇和 36 μL 5M NH₄Ac.倒置几次混合，然后将试管放在冰上 20 分钟。
5. 在4°C下以18，400× g 旋转20分钟。 倒入以弃去上清液。倒置时用 500 μL 冷的 70% 乙醇洗涤沉淀数次。
   注意：乙醇应用双去离子无菌水稀释。
6. 在4°C下以18，400× g 旋转3分钟。 弃去上清液以除去残留的乙醇。
7. 将管子倒置在薄纸上风干20分钟，直到颗粒变得透明。将沉淀悬浮在 50 μL 分子级水中。将液体在37°C下加热10分钟以完全溶解大的DNA沉淀。
8. 加热后旋转管以回收盖子上的冷凝液滴（3，400 x g 1分钟）。
9. 测量浓度并使用分光光度计获得260/280比率。使用分子级水作为空白。高质量的DNA应该有260/280的比例，范围在1.8到2之间。
   注意：每个粪便沉淀的预期DNA产量至少为0.03克。

3. 16S rRNA基因测序的样品制备

1. 将DNA样本送到阿贡国家实验室，在那里进行文库制备，并在Illumina Miseq上进行测序。
   1. 在全裙边的96孔板中发送样品，样品成行排列（A1-A12，B1-B12等），并用箔板密封。
   2. 每孔每个样品发送 20 μL 的最终体积，浓度范围为 1-50 ng/μL。
      注意：稀释应用分子级水进行。
   3. 制备样品后，在室温下以600× g 旋转1分钟，然后将样品在-80°C冷冻24小时。
   4. 在干冰上过夜。

Representative Results

阿贡国家实验室的结果由合格的生物信息学家进行分析，然后使用标准统计方法对数据进行内部分析。典型的微生物组分析涉及将相似序列聚类到操作分类单元（OTU）或扩增子序列变体（ASV）中，作为样品中不同微生物的代表。然后，可以使用跨样本的OTU或ASV计数来测试样本内（alpha）多样性和样本间（beta）多样性的变化。它们还可用于测试在感兴趣的元数据类别中差异丰富的分类群。

如图1所示，缺乏受体CX₃CR1的小鼠品系具有不同的肠道微生物群组成。与野生型MRL / lpr相比，MRL / lpr-CX3 CR1 gfp^{/ gfp}小鼠（表达绿色荧光蛋白而不是CX₃CR1）在某些与潜在致病细菌相关的属中显示出显着差异，例如变形杆菌门中的属。此外，注意到“健康”共生细菌（如双歧杆菌）的一些差异，但没有乳酸杆菌。

图 1：MRL/lpr 和 MRL/lpr-CX₃CR1 小鼠在属水平上的肠道微生物群比较。 13、14和15周龄时不同属的丰度（每组n = 5只雌性小鼠）。进行了双向方差分析。无显著性 （'ns'），*P < 0.05，**P < 0.01。请点击此处查看此图的大图。

Discussion

平衡的肠道微生物群可以保护人体免受疾病侵害。一旦这种平衡被外部或内部触发因素破坏，后果可能是毁灭性的。该方法提供了一种分析小鼠模型中肠道微生物群动力学的方法。该方法不仅适用于组间比较，还适用于随时间跟踪肠道微生物群，以更好地识别破坏肠道微生物群的时间依赖性因素。

实验中的所有小鼠必须在相同的环境中处理。收集粪便样本时要考虑的一个基本事项是与时间、日期和地点保持一致。小鼠具有粪便吞噬性。这意味着他们吃粪便或周围的粪便以获得必需的营养。因此，粪便不能从笼子中收集。样本需要新鲜直接从肛门采集。最好的方法是握住鼠标按摩鼠标或将鼠标放在容器中。此外，建议同时处理样品并在-80°C下冷冻，同时等待所有样品准备好。

DNA提取对移液和处理极其敏感，因此应同时处理所有样品。另一个考虑因素是避免环境污染;因此，由于有毒试剂而不必在化学罩中执行的每个步骤都应在生物安全柜中完成。尽管环境污染的可能性很低，并且没有允许细菌生长的步骤，但这种方法非常敏感，绝对建议避免任何可能的污染。此外，称量颗粒将有助于提高样品之间的一致性。与市售试剂盒相比，这种方法的优势在于实现高浓度的DNA。使用该协议获得的DNA产量范围在0.03g和0.07g之间，具体取决于粪便颗粒的重量。相比之下，商业试剂盒的产量在0.005 g至0.05 g之间，但由于色谱柱保留步骤的限制，饱和的可能性更高。

打珠步骤对于将粪便颗粒破碎成小块非常重要，这样裂解剂就可以到达所有细菌。如果此步骤执行不好，沉淀可以部分分解，并且可以达到较少的代表性细菌。此外，在转移上清液时，正确的移液很重要，因为携带上一步的部分残留缓冲液会改变DNA的产量和质量。

在稀释样品进行16S核糖体RNA基因测序时，重要的是在将样品放入冰箱之前迅速采取行动。在进行稀释之前充分混合样品也很重要。避免将样品长时间放在室温下。由于体积很小，在运输之前将样品冷冻在板中将有助于最大限度地减少损失。

阿贡国家实验室分析16S rRNA基因的V4区域。V4区域比其他区域更保守，对高等级分类群¹³的估计更好。虽然其他区域更适合分析快速进化的物种，并且可以帮助识别和更好地区分属或物种，但这些区域积累突变的速度比V4快。

一旦结果被合格的生物信息学家返回并进行分析，统计软件可用于绘制结果并比较组。了解该技术的局限性以及生物信息学分析后的结果非常重要。分类水平越低，准确性越低或变异越大。从门到科，甚至属水平都可以可靠地分析。然而，使用这种方法在物种水平上的注释并不准确。另一方面，霰弹枪测序可以达到物种水平;然而，虽然它可以更深入地了解群落的生物学功能，但16S rRNA基因测序仍然是量化微生物群落分类分布的准确且具有成本效益的方法¹⁵。

总之，已经描述了一种具有成本效益的方案来分析肠道微生物群并以最大准确性研究其动力学，这有助于揭示随时间推移的纵向变化以及群体之间的差异。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mm glass beads	BioSpec Products	11079101
2 mL screw cap tubes	Thermo Fisher Scientific	3488
20% SDS	FisherScientific	BP1311-1	SDS 20%
96% Ethanol, Molecular Biology Grade	Thermo Fisher Scientific	T032021000CS
Ammonium Acetate (5 M)	Thermo Fisher Scientific	AM9071	NH4AC 5M
B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J	Jackson Laboratory	005582
Bullet Blender storm 24	Next Advance	4116-BBY24M	Homogenizer
Chloroform	FisherScientific	C298-500
DEPC-Treated Water	Thermo Fisher Scientific	AM9916
Ethylenediamine Tetraacetic Acid	FisherScientific	BP118-500	EDTA
Foil plate seal	FisherScientific	NC0302491
Kimwipes-Kimtech 34256	FisherScientific	06-666C
MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice	Jackson Laboratory	000485
Nanodrop 2000 spectrophotomer	Thermo Fisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1)	FisherScientific	BP1752I-400	PCI
Scale with 4 decimals	Mettler Toledo	MS205DU
Skirted 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB-0800
Sodium chloride	FisherScientific	15528154	NaCl
Tris Hydrochloride	FisherScientific	BP1757-100
Vortex	Scientific Industries	SI-0236