Summary
Este protocolo proporciona un método de aislamiento de ADN simple y rentable para el análisis de alteraciones de la microbiota intestinal murina durante el desarrollo de enfermedades autoinmunes.
Abstract
La microbiota intestinal tiene un papel importante en la educación del sistema inmunológico. Esta relación es extremadamente importante para comprender las enfermedades autoinmunes que no solo son impulsadas por factores genéticos, sino también por factores ambientales que pueden desencadenar la aparición y / o empeorar el curso de la enfermedad. Un estudio publicado anteriormente sobre la dinámica de la microbiota intestinal en ratones hembra LMR/lpr propensos al lupus mostró cómo los cambios en la microbiota intestinal pueden alterar la progresión de la enfermedad. Aquí, se describe un protocolo para extraer muestras representativas de la microbiota intestinal para estudios de autoinmunidad. Las muestras de microbiota se recogen del ano y se procesan, de las cuales se extrae el ADN utilizando un método de fenol-cloroformo y se purifica mediante precipitación de alcohol. Después de realizar la PCR, los amplicones purificados se secuencian utilizando una plataforma de secuenciación de próxima generación en el Laboratorio Nacional de Argonne. Finalmente, se analizan los datos de secuenciación del gen de ARN ribosómico 16S. Como ejemplo, se muestran los datos obtenidos de las comparaciones de la microbiota intestinal de ratones LMR/lpr con o sin CX3CR1. Los resultados mostraron diferencias significativas en géneros que contienen bacterias patógenas, como las del filo Proteobacteria, así como el género Bifidobacterium, que se considera parte de la microbiota comensal sana. En resumen, este método de aislamiento de ADN simple y rentable es confiable y puede ayudar a la investigación de los cambios en la microbiota intestinal asociados con enfermedades autoinmunes.
Introduction
Los seres humanos y las bacterias han coexistido durante mucho tiempo. Han establecido una relación codependiente con efectos beneficiosos mutuos que influye en las respuestas inmunes del huésped de manera cuantitativa y cualitativa1. Estudios recientes sugieren una asociación entre la composición de la microbiota intestinal y la patogénesis de enfermedades autoinmunes que incluyen la esclerosis múltiple 2, la artritis reumatoide3, la diabetes tipo2 4, la enfermedad inflamatoria intestinal5 y el lupus eritematoso sistémico (LES)6. Sin embargo, aún no está claro si la microbiota intestinal es la causa principal o un efecto secundario de estas enfermedades autoinmunes7. Potencialmente, la microbiota intestinal podría exacerbar la enfermedad durante la fase efectora de los trastornos autoinmunes o desempeñar un papel en la regulación de la inducción de estas enfermedades8.
Se ha descrito disbiosis intestinal en ratones hembra propensos al lupus MRL/Mp-Faslpr (LMR/lpr), y se observaron cambios en la microbiota intestinal con un agotamiento significativo de los lactobacilos9. Cuando se administró por vía oral una mezcla de cinco cepas de Lactobacillus, los síntomas similares al lupus se atenuaron en gran medida en estos ratones, lo que sugiere un papel esencial de la microbiota en la regulación de la patogénesis del LES.
La siguiente técnica de extracción de ADN permite seguir las fluctuaciones de la microbiota y analizarlas cualitativa y cuantitativamente durante el curso de la enfermedad murina similar al LES en ratones propensos al lupus. Ya sea para examinar la microbiota intestinal sana o definir la disbiosis, es importante examinar críticamente cómo se recopilan los datos y si son precisos y reproducibles10. Cada paso es crítico en este proceso. Se debe utilizar una metodología adecuada para extraer ADN microbiano, ya que cualquier posible problema que introduzca sesgos durante el proceso de extracción de ADN podría resultar en una representación microbiana inexacta. Si bien el método fenol-cloroformo se describe aquí, existen kits disponibles comercialmente para extraer ADN de bacterias que funcionan bien en casos particulares11. Sin embargo, su usabilidad está limitada por el costo y la cantidad de muestra requerida.
El protocolo presentado aquí es rentable y requiere solo una pequeña cantidad de muestra. Funciona bien con cualquier tipo de muestra de heces y es útil para estudiar la dinámica de la microbiota intestinal a lo largo del tiempo, así como las comparaciones entre grupos. El ADN se aísla con un método de purificación de alcohol, que utiliza fenol, cloroformo y alcohol isoamílico. La extracción a base de alcohol ayuda a limpiar y eliminar la muestra de proteínas y lípidos, donde el ADN se precipita en el paso final. El método propuesto tiene una eficiencia y calidad significativamente altas y ha demostrado ser preciso en la identificación de poblaciones bacterianas. Una nota crítica durante el procedimiento es que la contaminación del ADN puede ocurrir, y por lo tanto se requiere un manejo adecuado de la muestra12.
Luego, el ADN es analizado por las plataformas de secuenciación de próxima generación para el gen 16S rRNA, como el Illumina MiSeq. En particular, la región hipervariable V4 se analiza para proporcionar una mejor cuantificación de los taxones de alto rango13. El análisis bioinformático posterior se subcontrata, seguido de un análisis interno utilizando métodos estadísticos estándar. Existen numerosos programas de software bioinformático de código abierto disponibles para la secuenciación posterior, y el tipo de análisis realizados depende en gran medida de la cuestión biológica específica de interés14. Este protocolo se centra específicamente en los pasos experimentales previos a la secuenciación y proporciona un método más versátil, rentable, comparable y eficiente para obtener ADN de muestras fecales.
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Protocol
El locus Cx3cr1 gfp/gfp de ratones B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J se cruzó con MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) durante 10 generaciones para generar ratones MRL/lpr-CX 3 CR1 gfp/gfp. El cribado del genoma utilizando paneles de polimorfismo de nucleótido único (SNP) confirmó que el fondo genético de los ratones recién generados era más del 97% idéntico al de MRL / lpr. Después de eso, los ratones fueron criados y mantenidos en un ambiente específico libre de patógenos siguiendo los requisitos específicos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Virginia Tech. Las muestras se recolectaron cuando los ratones tenían 13, 14 y 15 semanas de edad.
1. Recogida de muestras de microbiota de ratones
- Saque cada ratón individualmente de su jaula. Recoja un pellet fecal directamente del ano y guárdelo a -80 °C hasta que se procese. Procese las muestras con pinzas, tubos y guantes estériles y limpios.
NOTA: Se puede usar un recipiente (por ejemplo, un vaso de precipitados) para colocar el mouse mientras espera la muestra fecal. Limpie el recipiente con etanol antes y después de cada ratón. - Agregue un pellet congelado a un tubo de tapón de rosca de 2 ml previamente pesado. Registre el peso fecal en gramos, que debe estar entre 0.02-0.05 g por pellet fecal.
- Agregue al pellet una capa delgada de perlas de vidrio de 0,1 mm, 500 μL de tampón de lisis (50 mM de NaCl, 5 mM Tris y 50 mM de EDTA) y 200 μL de 20% de SDS.
- Batir el tubo durante 4 minutos en un homogeneizador (a máxima potencia), seguido de 3-5 minutos de vórtice.
- Gire durante un corto tiempo para eliminar las burbujas y la espuma (presione el botón de la centrífuga hasta que alcance 1,000-1,200 x g, y luego suéltelo).
2. Extracción de ADN
- Transfiera 350 μL de sobrenadante obtenido en el paso 1.5 (asegurándose de no transportar residuos) a un nuevo tubo de tapa a presión de 1,5 ml. Añadir 500 μL de mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (PCI; 25:24:1, v/v) y vórtice durante 1 min.
NOTA: A partir de ahora, las muestras deben manipularse dentro de una campana química. La PCI es tóxica. - Girar a 6.000 x g durante 3 min a 4 °C. Transfiera 180 μL de la fase acuosa (capa superior) a un nuevo tubo de tapa de presión de 1,5 ml. Añadir 180 μL (1:1) de cloroformo, invertir y mezclar.
NOTA: Minimice la contaminación de la capa inferior al transferir la capa superior. - Girar a 18.400 x g durante 3 min a 4 °C. Transfiera 180 μL de la fase acuosa a un nuevo tubo de tapa a presión.
NOTA: Después de desechar PCI y cloroformo, los siguientes pasos se pueden realizar en un gabinete de seguridad biológica. - Agregue 180 μL de isopropanol frío y 36 μL de 5M NH4Ac. Invierta varias veces para mezclar y coloque el tubo en hielo durante 20 min.
- Girar a 18.400 x g durante 20 min a 4 °C. Vierta para desechar el sobrenadante. Lave el pellet varias veces con 500 μL de etanol frío al 70% mientras invierte.
NOTA: El etanol debe diluirse con agua estéril doblemente desionizada. - Girar a 18.400 x g durante 3 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante para eliminar el etanol residual.
- Seque al aire el tubo boca abajo sobre papel de seda durante 20 minutos, hasta que el pellet se vuelva transparente. Suspender el pellet en 50 μL de agua de grado molecular. Calentar el líquido a 37 °C durante 10 minutos para disolver completamente los gránulos grandes de ADN.
- Girar los tubos después del calentamiento para recuperar las gotas de condensación en la tapa (3.400 x g durante 1 min).
- Mida la concentración y obtenga la relación 260/280 utilizando un espectrofotómetro. Use agua de grado molecular como un espacio en blanco. El ADN de buena calidad debe tener proporciones 260/280 que oscilan entre 1,8 y 2.
NOTA: El rendimiento esperado de ADN es de al menos 0,03 g por pellet fecal.
3. Preparación de la muestra para la secuenciación del gen 16S rRNA
- Envíe las muestras de ADN al Laboratorio Nacional de Argonne, donde se someten a la preparación de la biblioteca y se secuencian en el Illumina Miseq.
- Envíe las muestras en placas de 96 pocillos completamente faldadas, con muestras dispuestas en filas (A1-A12, B1-B12, etc.) y selladas con sellos de placa de aluminio.
- Enviar un volumen final de 20 μL por muestra por pocillo, con una concentración de 1 a 50 ng/μL.
NOTA: Las diluciones deben hacerse con agua de grado molecular. - Después de preparar las muestras, hilar a 600 x g durante 1 min a temperatura ambiente antes de congelar las muestras a -80 °C durante 24 h.
- Enviar durante la noche en hielo seco.
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Representative Results
Los resultados del Laboratorio Nacional de Argonne son analizados por un bioinformático calificado, seguido de un análisis interno de los datos utilizando métodos estadísticos estándar. Los análisis típicos del microbioma implican la agrupación de secuencias similares en unidades taxonómicas operativas (OTU) o variantes de secuencia de amplicón (ASV) como un proxy para diferentes microorganismos en una muestra. Los recuentos de OTU o ASV en todas las muestras se pueden usar para verificar los cambios en la diversidad dentro de la muestra (alfa) y la diversidad entre muestras (beta). También se pueden usar para probar taxones que son diferencialmente abundantes en todas las categorías de metadatos de interés.
Como se muestra en la Figura 1, la cepa de ratón que carece del receptor CX3CR1 tiene una composición de microbiota intestinal diferente. En comparación con los ratones LMR/lpr de tipo salvaje, los ratones LMR/lpr-CX 3 CR1 gfp/gfp (que expresan la proteína verde fluorescente enlugar de CX3CR1) muestran diferencias significativas en ciertos géneros relevantes para bacterias potencialmente patógenas como las del filo Proteobacteria. Además, se observaron algunas diferencias para las bacterias comensales "sanas" como Bifidobacterium, pero no Lactobacillus.
Figura 1: Comparaciones de la microbiota intestinal a nivel de género para ratones MRL/lpr y MRL/lpr-CX3CR1. La abundancia de diferentes géneros a las 13, 14 y 15 semanas de edad (n = 5 ratones hembra por grupo). Se realizó ANOVA bidireccional. Sin significancia ('ns'), *P < 0,05, **P < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Una microbiota intestinal equilibrada puede proteger al cuerpo humano de las enfermedades. Una vez que este equilibrio se ve interrumpido por desencadenantes externos o internos, las consecuencias pueden ser devastadoras. Este método presenta una forma de analizar la dinámica de la microbiota intestinal en modelos murinos. El método es adecuado no solo para comparaciones entre grupos, sino también para rastrear la microbiota intestinal a lo largo del tiempo para identificar mejor los factores dependientes del tiempo que alteran la microbiota intestinal.
Todos los ratones en el experimento deben ser manejados en el mismo entorno. Una cuestión esencial a considerar al recolectar muestras fecales es ser consistente con la hora, el día y el lugar. Los ratones son coprófagos. Esto significa que comen sus heces o las que les rodean para obtener nutrientes esenciales. Por lo tanto, las heces no se pueden recoger de la jaula. Las muestras deben recogerse frescas y directamente del ano. El mejor método es masajear el ratón mientras lo sostiene o colocar el ratón en un recipiente. Además, se recomienda que las muestras se procesen al mismo tiempo y se congelen a -80 °C mientras se espera que todas las muestras estén listas.
La extracción de ADN es extremadamente sensible al pipeteo y la manipulación, por lo que todas las muestras deben procesarse al mismo tiempo. Otra consideración es evitar la contaminación ambiental; Por lo tanto, cada paso que no se realice necesariamente en la campana química debido a los reactivos tóxicos debe realizarse en un gabinete de seguridad biológica. A pesar de que las posibilidades de contaminación ambiental son bajas y no hay un paso para permitir que las bacterias crezcan, este método es extremadamente sensible y se recomienda absolutamente evitar cualquier posible contaminación. Además, pesar los gránulos ayudará a aumentar la consistencia entre las muestras. Como ventaja sobre los kits disponibles comercialmente, este método es particularmente bueno para lograr altas concentraciones de ADN. El rendimiento de ADN obtenido con este protocolo oscila entre 0,03 g y 0,07 g dependiendo del peso del pellet fecal. En comparación, los kits comerciales pueden producir entre 0,005 g y 0,05 g, pero con una mayor probabilidad de saturación limitada por el paso de retención de la columna.
El paso de batir cuentas es importante para romper el pellet fecal en trozos pequeños para que el agente de lisis pueda llegar a todas las bacterias. Si este paso no se realiza bien, los pellets pueden desintegrarse parcialmente y se pueden alcanzar menos bacterias representativas. Además, al transferir sobrenadantes, el pipeteo correcto es importante, ya que llevar parte del tampón residual del paso anterior alteraría el rendimiento y la calidad del ADN al final.
Al diluir las muestras para la secuenciación del gen de ARN ribosómico 16S, es importante actuar rápidamente antes de que las muestras se coloquen en el congelador. También es importante mezclar bien las muestras antes de realizar diluciones. Evite dejar muestras a temperatura ambiente durante largos períodos de tiempo. Dado que los volúmenes son pequeños, congelar las muestras en la placa antes de enviarlas ayudará a minimizar la pérdida.
El Laboratorio Nacional de Argonne analiza la región V4 del gen 16S rRNA. La región V4 está mejor conservada que las otras regiones y tiene una mejor estimación para los taxones de alto rango13. Mientras que las otras regiones son mejores para el análisis de especies en rápida evolución y pueden ayudar a identificar y discriminar mejor el género o la especie, esas regiones acumulan mutaciones más rápido que V4.
Una vez que los resultados están de vuelta y son analizados por un bioinformático calificado, el software estadístico se puede utilizar para trazar los resultados y comparar grupos. Es importante comprender las limitaciones de esta técnica y los resultados después del análisis bioinformático. Cuanto menor sea el nivel taxonómico, menor será la precisión o mayores las variaciones. Desde el filo hasta la familia, e incluso el nivel de género se puede analizar con fiabilidad. Sin embargo, las anotaciones a nivel de especie no son precisas con este método. La secuenciación de escopeta, por otro lado, puede alcanzar el nivel de especie; sin embargo, aunque puede proporcionar más información sobre las funciones biológicas de una comunidad, la secuenciación del gen 16S rRNA sigue siendo un método preciso y rentable para cuantificar las distribuciones taxonómicas de una comunidad microbiana15.
En resumen, se ha descrito un protocolo rentable para analizar la microbiota intestinal y estudiar su dinámica con la máxima precisión que puede ayudar a revelar cambios longitudinales a lo largo del tiempo, así como diferencias entre grupos.
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Disclosures
Los autores declaran que no existe conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos la ayuda del Laboratorio Nacional de Argonne y nuestros bioinformáticos colaboradores. Este trabajo es apoyado por varios NIH y subvenciones internas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
- Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).
- Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).
- Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).
- Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
- Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
- Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).
- Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).
- Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).
- Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365 (2016).
- Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).
- Galloway-Peña, J., Hanson, B.
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).
