Summary
Dit protocol biedt een eenvoudige, kosteneffectieve DNA-isolatiemethode voor de analyse van veranderingen in de microbiota van de muizendarm tijdens de ontwikkeling van auto-immuunziekten.
Abstract
Darmmicrobiota heeft een belangrijke rol bij het opleiden van het immuunsysteem. Deze relatie is uiterst belangrijk voor het begrijpen van auto-immuunziekten die niet alleen worden aangedreven door genetische factoren, maar ook omgevingsfactoren die het begin kunnen veroorzaken en / of het ziekteverloop kunnen verergeren. Een eerder gepubliceerde studie over de dynamiek van de darmmicrobiota bij lupus-gevoelige MRL / lpr vrouwelijke muizen toonde aan hoe veranderingen van de darmmicrobiota de progressie van de ziekte kunnen veranderen. Hier wordt een protocol beschreven voor het extraheren van representatieve monsters uit de darmmicrobiota voor studies van auto-immuniteit. Microbiotamonsters worden verzameld uit de anus en verwerkt, waaruit het DNA wordt geëxtraheerd met behulp van een fenol-chloroform-methode en gezuiverd door alcoholprecipitatie. Nadat PCR is uitgevoerd, worden gezuiverde amplicons gesequenced met behulp van een Next Generation Sequencing-platform in het Argonne National Laboratory. Ten slotte worden de 16S ribosomale RNA-gensequencinggegevens geanalyseerd. Als voorbeeld worden gegevens getoond die zijn verkregen uit darmmicrobiotavergelijkingen van MRL/lpr-muizen met of zonder CX3CR1. De resultaten toonden significante verschillen in geslachten die pathogene bacteriën bevatten, zoals die in het phylum Proteobacteria, evenals het geslacht Bifidobacterium, dat wordt beschouwd als onderdeel van de gezonde commensale microbiota. Kortom, deze eenvoudige, kosteneffectieve DNA-isolatiemethode is betrouwbaar en kan helpen bij het onderzoek naar veranderingen in de darmmicrobiota geassocieerd met auto-immuunziekten.
Introduction
Mens en bacterie bestaan al heel lang naast elkaar. Ze hebben een codependente relatie opgebouwd met wederzijdse gunstige effecten die de immuunrespons van de gastheer op kwantitatieve en kwalitatieve manieren beïnvloedt1. Recente studies suggereren een verband tussen de samenstelling van de darmmicrobiota en de pathogenese van auto-immuunziekten, waaronder multiple sclerose2, reumatoïde artritis3, type 2 diabetes4, inflammatoire darmziekte5 en systemische lupus erythematosus (SLE)6. Of de darmmicrobiota de hoofdoorzaak of een secundair effect van deze auto-immuunziekten is, is echter nog onduidelijk7. Mogelijk kan de darmmicrobiota de ziekte verergeren tijdens de effectorfase van auto-immuunziekten of een rol spelen bij het reguleren van de inductie van deze ziekten8.
Intestinale dysbiose is gemeld bij vrouwelijke lupus-gevoelige MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) muizen, en darmmicrobiota veranderingen met een significante uitputting van Lactobacillen werden waargenomen9. Wanneer een mengsel van vijf Lactobacillus-stammen oraal werd toegediend, werden lupus-achtige symptomen bij deze muizen grotendeels verzwakt, wat wijst op een essentiële rol van microbiota bij het reguleren van SLE-pathogenese.
De volgende techniek van DNA-extractie maakt het mogelijk om microbiotafluctuaties te volgen en deze kwalitatief en kwantitatief te analyseren in de loop van murine SLE-achtige ziekte bij lupusgevoelige muizen. Of het nu gaat om het onderzoeken van de gezonde darmmicrobiota of het definiëren van dysbiose, het is belangrijk om kritisch te onderzoeken hoe gegevens worden verzameld en of deze nauwkeurig en reproduceerbaar zijn10. Elke stap is cruciaal in dit proces. Er moet een geschikte methodologie worden gebruikt om microbieel DNA te extraheren, omdat elk mogelijk probleem dat vooroordelen introduceert tijdens het DNA-extractieproces kan leiden tot onnauwkeurige microbiële representatie. Hoewel de fenol-chloroformmethode hier wordt beschreven, zijn er in de handel verkrijgbare kits om DNA te extraheren uit bacteriën die in bepaalde gevallen goed werken11. Hun bruikbaarheid wordt echter beperkt door de kosten en de vereiste monsterhoeveelheid.
Het hier gepresenteerde protocol is kosteneffectief en vereist slechts een kleine hoeveelheid monster. Het werkt prima met elk soort ontlastingsmonster en is nuttig bij het bestuderen van de dynamiek van de darmmicrobiota in de loop van de tijd en vergelijkingen tussen groepen. DNA wordt geïsoleerd met een methode van alcoholzuivering, waarbij fenol, chloroform en isoamylalcohol worden gebruikt. Extractie op basis van alcohol helpt bij het reinigen en verwijderen van het monster van eiwitten en lipiden, waarbij DNA in de laatste stap wordt neergeslagen. De voorgestelde methode heeft een aanzienlijk hoge efficiëntie en kwaliteit en is bewezen nauwkeurig te zijn bij het identificeren van bacteriepopulaties. Een kritische noot tijdens de procedure is dat DNA-besmetting kan optreden, en dus is een passende monsterbehandeling vereist12.
Het DNA wordt vervolgens geanalyseerd door de Next Generation Sequencing-platforms voor het 16S-rRNA-gen, zoals de Illumina MiSeq. In het bijzonder wordt het hypervariabele V4-gebied geanalyseerd om een betere kwantificering te bieden voor taxa13 met een hoge rang. De daaropvolgende bioinformatica-analyse wordt uitbesteed, gevolgd door interne analyse met behulp van standaard statistische methoden. Er zijn tal van open-source bioinformatica softwareprogramma's beschikbaar voor downstream sequencing, en het type analyses dat wordt uitgevoerd, hangt sterk af van de specifieke biologische vraag van belang14. Dit protocol richt zich specifiek op de experimentele stappen voorafgaand aan sequencing en biedt een meer veelzijdige, kosteneffectieve, vergelijkbare en efficiënte methode om DNA uit fecale monsters te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De Cx3cr1gfp/gfp locus van B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J muizen werd gedurende 10 generaties teruggekruist naar MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) om MRL/lpr-CX3CR1gfp/gfp muizen te genereren. Genoomscreening met behulp van single nucleotide polymorphism (SNP) panels bevestigde dat de genetische achtergrond van nieuw gegenereerde muizen meer dan 97% identiek was aan die van MRL / lpr. Daarna werden muizen gefokt en onderhouden in een specifieke pathogeenvrije omgeving volgens de specifieke vereisten van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) bij Virginia Tech. Monsters werden verzameld toen de muizen 13, 14 en 15 weken oud waren.
1. Verzameling van microbiotamonsters van muizen
- Haal elke muis afzonderlijk uit zijn kooi. Verzamel een fecale pellet rechtstreeks uit de anus en bewaar deze bij -80 °C totdat deze wordt verwerkt. Verwerk de monsters met steriele en schone tangen, buizen en handschoenen.
OPMERKING: Een container (bijvoorbeeld een bekerglas) kan worden gebruikt om de muis te plaatsen terwijl u wacht op het fecale monster. Reinig de container met ethanol voor en na elke muis. - Voeg een bevroren pellet toe aan een vooraf gewogen schroefdopbuis van 2 ml. Noteer het fecale gewicht in grammen, dat tussen 0,02-0,05 g per fecale pellet moet liggen.
- Voeg aan de pellet een dunne laag van 0,1 mm glasparels, 500 μL lysisbuffer (50 mM NaCl, 5 mM Tris en 50 mM EDTA) en 200 μL 20% SDS toe.
- Klop de buis gedurende 4 minuten in een homogenisator (op maximaal vermogen), gevolgd door 3-5 minuten vortexing.
- Draai gedurende een korte tijd om de bubbels en het schuim te verwijderen (druk op de knop op de centrifuge totdat deze 1.000-1.200 x g bereikt en laat dan los).
2. DNA-extractie
- Breng 350 μL supernatant verkregen in stap 1.5 (zorg ervoor dat er geen vuil wordt vervoerd) over naar een nieuwe 1,5 ml snap cap tube. Voeg 500 μL fenol-chloroform-isoamylalcohol (PCI; 25:24:1, v/v) mengsel en vortex toe gedurende 1 min.
OPMERKING: Vanaf nu moeten monsters in een chemische kap worden behandeld. PCI is giftig. - Draai bij 6.000 x g gedurende 3 min bij 4 °C. Breng 180 μL van de waterige fase (toplaag) over in een nieuwe 1,5 ml klikdopbuis. Voeg 180 μL (1:1) chloroform toe, keer om en meng.
OPMERKING: Minimaliseer vervuiling van de onderste laag bij het overbrengen van de bovenste laag. - Draai bij 18.400 x g gedurende 3 min bij 4 °C. Breng 180 μL van de waterige fase over in een nieuwe snapdopbuis.
OPMERKING: Na het weggooien van PCI en chloroform kunnen de volgende stappen worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast. - Voeg 180 μL koude isopropanol en 36 μL 5M NH4Ac toe. Keer een paar keer om om te mengen en plaats de buis gedurende 20 minuten op ijs.
- Draai op 18.400 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Giet om het supernatant weg te gooien. Was de pellet meerdere keren met 500 μL koude 70% ethanol tijdens het omkeren.
OPMERKING: Ethanol moet worden verdund met dubbel gedeïoniseerd steriel water. - Draai bij 18.400 x g gedurende 3 min bij 4 °C. Gooi het supernatant weg om resterende ethanol te verwijderen.
- Droog de buis ondersteboven op tissuepapier gedurende 20 minuten aan de lucht, totdat de pellet helder wordt. Suspensie van de pellet in 50 μL water van moleculaire kwaliteit. Verwarm de vloeistof gedurende 10 minuten op 37 °C om grote DNA-pellets volledig op te lossen.
- Draai buizen na verwarming om condensdruppels op het deksel terug te winnen (3.400 x g gedurende 1 minuut).
- Meet de concentratie en verkrijg de 260/280 verhouding met behulp van een spectrofotometer. Gebruik water van moleculaire kwaliteit als blanco. Dna van goede kwaliteit moet 260/280-verhoudingen hebben, variërend tussen 1,8 en 2.
OPMERKING: De verwachte DNA-opbrengst is ten minste 0,03 g per fecale pellet.
3. Monstervoorbereiding voor 16S rRNA-gensequencing
- Stuur de DNA-monsters naar het Argonne National Laboratory, waar ze worden voorbereid en worden gesequenced op de Illumina Miseq.
- Stuur monsters in volledig omzoomde 96-well platen, met monsters gerangschikt in rijen (A1-A12, B1-B12, enz.), En verzegeld met folieplaatafdichtingen.
- Stuur een eindvolume van 20 μL per monster per putje, variërend in concentratie van 1-50 ng/μL.
OPMERKING: Verdunningen moeten worden gedaan met water van moleculaire kwaliteit. - Draai na het bereiden van de monsters gedurende 1 minuut op 600 x g bij kamertemperatuur voordat u de monsters gedurende 24 uur bij -80 °C bevriest.
- 's Nachts op droogijs sturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten van argonne national laboratory worden geanalyseerd door een gekwalificeerde bio-informaticus, gevolgd door een interne analyse van de gegevens met behulp van standaard statistische methoden. Typische microbioomanalyses omvatten clustering van vergelijkbare sequenties in operationele taxonomische eenheden (OTA's) of ampliconsequentievarianten (ASV's) als een proxy voor verschillende micro-organismen in een monster. Tellingen van OTA's of ASV's in steekproeven kunnen vervolgens worden gebruikt om te testen op veranderingen in de diversiteit binnen de steekproef (alfa) en tussen de steekproef (bèta) diversiteit. Ze kunnen ook worden gebruikt om te testen op taxa die differentieel overvloedig zijn in metadatacategorieën van belang.
Zoals te zien is in figuur 1, heeft de muizenstam zonder receptor CX3CR1 een andere samenstelling van de darmmicrobiota. Vergeleken met wildtype MRL/lpr vertonen MRL/lpr-CX3CR1gfp/gfp muizen (die het groene fluorescerende eiwit tot expressie brengen in plaats van CX3CR1) significante verschillen in bepaalde geslachten die relevant zijn voor potentieel pathogene bacteriën zoals die in de phylum Proteobacteria. Bovendien werden enkele verschillen opgemerkt voor "gezonde" commensale bacteriën zoals Bifidobacterium, maar niet Lactobacillus.
Figuur 1: Vergelijkingen van darmmicrobiota op geslachtsniveau voor MRL/lpr en MRL/lpr-CX3CR1 muizen. De abundantie van verschillende geslachten op de leeftijd van 13, 14 en 15 weken (n = 5 vrouwelijke muizen per groep). Tweeweg ANOVA werd uitgevoerd. Geen significantie ('ns'), *P < 0,05, **P < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evenwichtige darmmicrobiota kunnen het menselijk lichaam beschermen tegen ziekten. Zodra dit evenwicht wordt verstoord door externe of interne triggers, kunnen de gevolgen verwoestend zijn. Deze methode presenteert een manier om de dynamiek van darmmicrobiota in muizenmodellen te analyseren. De methode is niet alleen geschikt voor vergelijkingen tussen groepen, maar ook voor het volgen van de darmmicrobiota in de loop van de tijd om tijdsafhankelijke factoren die de darmmicrobiota verstoren beter te identificeren.
Alle muizen in het experiment moeten in dezelfde omgeving worden behandeld. Een essentiële kwestie om te overwegen bij het verzamelen van fecale monsters is om consistent te zijn met de tijd, dag en plaats. Muizen zijn coprofagisch. Dit betekent dat ze hun uitwerpselen of die om hen heen eten om essentiële voedingsstoffen te verkrijgen. Daarom kunnen uitwerpselen niet uit de kooi worden verzameld. Monsters moeten vers en rechtstreeks uit de anus worden verzameld. De beste methode is om de muis te masseren terwijl je hem vasthoudt of de muis in een container te plaatsen. Bovendien wordt aanbevolen om monsters tegelijkertijd te verwerken en bij -80 °C te invriezen in afwachting van de gereedheid van alle monsters.
DNA-extractie is uiterst gevoelig voor pipetteren en hanteren, dus alle monsters moeten tegelijkertijd worden verwerkt. Een andere overweging is om milieuvervuiling te voorkomen; daarom moet elke stap die niet noodzakelijkerwijs in de chemische kap wordt uitgevoerd vanwege de toxische reagentia, worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast. Hoewel de kans op milieuverontreiniging klein is en er geen stap is om bacteriën te laten groeien, is deze methode uiterst gevoelig en wordt het vermijden van mogelijke besmetting absoluut aanbevolen. Bovendien zal het wegen van de pellets helpen om de consistentie tussen monsters te vergroten. Als een voordeel ten opzichte van commercieel verkrijgbare kits, is deze methode bijzonder goed voor het bereiken van hoge concentraties DNA. De DNA-opbrengst die met dit protocol wordt verkregen, varieert tussen 0,03 g en 0,07 g, afhankelijk van het gewicht van de fecale pellet. Ter vergelijking: commerciële kits kunnen tussen 0,005 g en 0,05 g opleveren, maar met een hogere kans op verzadiging zoals beperkt door de kolomretentiestap.
De kraal-kloppende stap is belangrijk bij het breken van de fecale pellet in kleine stukjes, zodat het lysismiddel alle bacteriën kan bereiken. Als deze stap niet goed wordt uitgevoerd, kunnen pellets gedeeltelijk worden gedesintegreerd en kunnen minder representatieve bacteriën worden bereikt. Bovendien is bij het overbrengen van supernatanten correct pipetteren belangrijk, omdat het dragen van een deel van de restbuffer van de vorige stap de opbrengst en kwaliteit van DNA aan het einde zou veranderen.
Bij het verdunnen van de monsters voor de 16S ribosomale RNA-gensequencing is het belangrijk om snel te handelen voordat de monsters in de vriezer worden geplaatst. Het is ook belangrijk om monsters goed te mengen voordat verdunningen worden uitgevoerd. Vermijd het achterlaten van monsters bij kamertemperatuur voor lange tijd. Omdat de volumes klein zijn, zal het invriezen van de monsters in de plaat voordat ze worden verzonden, helpen om het verlies te minimaliseren.
Het Argonne National Laboratory analyseert het V4-gebied van het 16S-rRNA-gen. De V4-regio is beter geconserveerd dan de andere regio's en heeft een betere schatting voor high-rank taxa13. Terwijl de andere regio's beter zijn voor de analyse van snel evoluerende soorten en kunnen helpen bij het identificeren en beter onderscheiden van geslacht of soort, accumuleren die regio's mutaties sneller dan V4.
Zodra de resultaten terug zijn en geanalyseerd door een gekwalificeerde bio-informaticus, kan statistische software worden gebruikt om de resultaten te plotten en groepen te vergelijken. Het is belangrijk om de beperkingen van deze techniek en de resultaten na bioinformatica-analyse te begrijpen. Hoe lager het taxonomische niveau, hoe kleiner de nauwkeurigheid of hoe groter de variaties. Van phylum tot familie, en zelfs het geslachtsniveau kan met betrouwbaarheid worden geanalyseerd. Annotaties op soortniveau zijn echter niet nauwkeurig met deze methode. Shotgun sequencing, aan de andere kant, kan het soortniveau bereiken; hoewel het meer inzicht kan geven in de biologische functies van een gemeenschap, is 16S rRNA-gensequencing nog steeds een nauwkeurige en kostenefficiënte methode om taxonomische distributies van een microbiële gemeenschap te kwantificeren15.
Samenvattend is een kostenefficiënt protocol beschreven om de darmmicrobiota te analyseren en de dynamiek ervan te bestuderen met de maximale nauwkeurigheid die kan helpen om longitudinale veranderingen in de loop van de tijd en verschillen tussen groepen te onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We waarderen de hulp van het Argonne National Laboratory en onze samenwerkende bio-informatici. Dit werk wordt ondersteund door verschillende NIH en interne subsidies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
- Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).
- Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).
- Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).
- Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
- Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
- Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).
- Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).
- Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).
- Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365 (2016).
- Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).
- Galloway-Peña, J., Hanson, B.
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).
