Summary
Denne protokollen gir en enkel, kostnadseffektiv DNA-isolasjonsmetode for analyse av murine gut mikrobiota endringer under utvikling av autoimmun sykdom.
Abstract
Tarmmikrobiota har en viktig rolle i å utdanne immunforsvaret. Denne sammenhengen er ekstremt viktig for å forstå autoimmune sykdommer som ikke bare er drevet av genetiske faktorer, men også miljøfaktorer som kan utløse utbruddet og/eller forverre sykdomsforløpet. En tidligere publisert studie om dynamikken i tarmmikrobiotaen hos lupus-utsatt MRL / lpr kvinnelige mus viste hvordan endringer i tarmmikrobiotaen kan endre sykdomsprogresjonen. Her beskrives en protokoll for å trekke ut representative prøver fra tarmmikrobiotaen for studier av autoimmunitet. Mikrobiotaprøver samles fra anus og behandles, hvorfra DNA ekstraheres ved hjelp av en fenol-kloroformmetode og renses ved alkoholutfelling. Etter at PCR er utført, sekvenseres rensede amplikoner ved hjelp av en Next Generation Sequencing-plattform ved Argonne National Laboratory. Til slutt analyseres 16S ribosomale RNA-gensekvenseringsdata. Som et eksempel er data hentet fra tarmmikrobiota-sammenligninger av MRL / lpr-mus med eller uten CX3CR1 vist. Resultatene viste signifikante forskjeller i slekter som inneholder patogene bakterier som de i phylum Proteobacteria, samt slekten Bifidobacterium, som regnes som en del av den sunne kommensale mikrobiotaen. Oppsummert er denne enkle, kostnadseffektive DNA-isolasjonsmetoden pålitelig og kan hjelpe undersøkelsen av tarmmikrobiotaendringer assosiert med autoimmune sykdommer.
Introduction
Mennesker og bakterier har eksistert sammen i lang tid. De har etablert et medavhengig forhold med gjensidige gunstige effekter som påvirker vertsimmunresponser på kvantitative og kvalitative måter1. Nylige studier tyder på en sammenheng mellom tarmmikrobiotasammensetningen og patogenesen av autoimmune sykdommer som inkluderer multippel sklerose 2, revmatoid artritt3, type2 diabetes4, inflammatorisk tarmsykdom5 og systemisk lupus erythematosus (SLE)6. Men om tarmmikrobiotaen er hovedårsaken eller en sekundær effekt av disse autoimmune sykdommene, er det fortsatt uklart7. Potensielt kan tarmmikrobiota forverre sykdommen under effektorfasen av autoimmune lidelser eller spille en rolle i å regulere induksjonen av disse sykdommene8.
Intestinal dysbiose er rapportert hos kvinnelige lupus-utsatte MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) mus, og tarmmikrobiotaendringer med signifikant uttømming av laktobaciller ble observert9. Når en blanding av fem Lactobacillus-stammer ble oralt administrert, ble lupus-lignende symptomer i stor grad dempet i disse musene, noe som tyder på en viktig rolle for mikrobiota i regulering av SLE-patogenese.
Følgende teknikk for DNA-ekstraksjon gjør det mulig å følge mikrobiotafluktuasjoner og analysere dem kvalitativt og kvantitativt i løpet av murine SLE-lignende sykdom hos lupus-utsatte mus. Enten du skal undersøke den sunne tarmmikrobiotaen eller definere dysbiose, er det viktig å kritisk undersøke hvordan data samles inn og om det er nøyaktig og reproduserbart10. Hvert trinn er kritisk i denne prosessen. En passende metode må brukes til å trekke ut mikrobielt DNA, da ethvert mulig problem som introduserer forstyrrelser under DNA-ekstraksjonsprosessen kan føre til unøyaktig mikrobiell representasjon. Mens fenol-kloroformmetoden er beskrevet her, er det kommersielt tilgjengelige sett for å trekke ut DNA fra bakterier som fungerer bra i spesielle tilfeller11. Imidlertid er deres brukervennlighet begrenset av kostnaden og nødvendig prøvemengde.
Protokollen som presenteres her er kostnadseffektiv og krever bare en liten mengde prøve. Det fungerer fint med alle slags avføringsprøver og er nyttig for å studere dynamikken i tarmmikrobiotaen over tid, samt sammenligninger mellom grupper. DNA isoleres med en metode for alkoholrensing, som bruker fenol, kloroform og isoamylalkohol. Alkoholbasert ekstraksjon bidrar til å rense og fjerne prøven av proteiner og lipider, hvor DNA utfelles i det siste trinnet. Den foreslåtte metoden har betydelig høy effektivitet og kvalitet og har vist seg å være nøyaktig i å identifisere bakteriepopulasjoner. Et kritisk notat under prosedyren er at DNA-forurensning kan oppstå, og dermed er det nødvendig med passende prøvehåndtering12.
DNA blir deretter analysert av Next Generation Sequencing-plattformene for 16S rRNA-genet, for eksempel Illumina MiSeq. Spesielt analyseres V4 hypervariabel region for å gi en bedre kvantifisering for høyrangs taxa13. Den påfølgende bioinformatikkanalysen er outsourcet, etterfulgt av intern analyse ved hjelp av standard statistiske metoder. Det finnes mange open-source bioinformatikk programmer tilgjengelig for nedstrøms sekvensering, og den type analyser som utføres avhenger sterkt av det spesifikke biologiske spørsmålet av interesse14. Denne protokollen fokuserer spesielt på de eksperimentelle trinnene før sekvensering og gir en mer allsidig, kostnadseffektiv, sammenlignbar og effektiv metode for å oppnå DNA fra fekale prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cx3cr1 gfp/gfp-lokuset til B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J-mus ble tilbakekrysset til MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) i 10 generasjoner for å generere MRL/lpr-CX 3CR1 gfp/gfp-mus. Genom screening ved hjelp av single nucleotide polymorphism (SNP) paneler bekreftet at den genetiske bakgrunnen til nygenererte mus var mer enn 97% identisk med MRL / lpr. Etter det ble mus avlet og vedlikeholdt i et spesifikt patogenfritt miljø etter de spesifikke kravene fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Virginia Tech. Prøver ble samlet inn når musene var 13, 14 og 15 uker gamle.
1. Innsamling av mikrobiotaprøver fra mus
- Ta hver mus individuelt ut av buret. Samle en fekalpellet direkte fra anus og oppbevar den ved -80 °C til den behandles. Behandle prøvene med sterile og rene tang, rør og hansker.
MERK: En beholder (f.eks. et beger) kan brukes til å plassere musen mens du venter på fekalprøven. Rengjør beholderen med etanol før og etter hver mus. - Tilsett en frossen pellet i et ferdigveid 2 ml skrukorkrør. Registrer fekalvekten i gram, som skal være mellom 0,02-0,05 g per fekalpellet.
- Tilsett pelleten et tynt lag med 0,1 mm glassperler, 500 μL lysisbuffer (50 mM NaCl, 5 mM Tris og 50 mM EDTA) og 200 μL 20% SDS.
- Perle-slå røret i 4 min i en homogenisator (ved maksimal effekt), etterfulgt av 3-5 min vortexing.
- Spinn i kort tid for å eliminere boblene og skummet (trykk på knappen på sentrifugen til den når 1,000-1,200 x g, og slipp deretter).
2. DNA-ekstraksjon
- Overfør 350 μL supernatant oppnådd i trinn 1.5 (sikrer at det ikke bærer rusk) til et nytt 1,5 ml snap cap rør. Tilsett 500 μL fenol-kloroform-isoamylalkohol (PCI; 25: 24: 1, v / v) blanding og vortex i 1 min.
MERK: Fra nå av må prøver håndteres inne i en kjemisk hette. PCI er giftig. - Spinn ved 6,000 x g i 3 minutter ved 4 °C. Overfør 180 μL av den vandige fasen (topplaget) til et nytt 1,5 ml snap cap rør. Tilsett 180 μL (1:1) kloroform, inverter og bland.
MERK: Minimer forurensning fra bunnlaget når du overfører topplaget. - Spinn ved 18 400 x g i 3 minutter ved 4 °C. Overfør 180 μL av den vandige fasen til et nytt snap cap rør.
MERK: Etter kassering av PCI og kloroform, kan følgende trinn utføres i et biologisk sikkerhetsskap. - Tilsett 180 μL kald isopropanol og 36 μL 5M NH4Ac. Inverter noen ganger for å blande, og legg røret på is i 20 minutter.
- Spinn ved 18 400 x g i 20 minutter ved 4 °C. Hell for å kaste supernatanten. Vask pelleten flere ganger med 500 μL kald 70% etanol mens du inverterer.
MERK: Etanol skal fortynnes med dobbelt avionisert sterilt vann. - Spinn ved 18 400 x g i 3 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten for å fjerne gjenværende etanol.
- Lufttørk røret opp ned på silkepapir i 20 minutter, til pelleten blir klar. Stopp pelleten i 50 μL molekylært vann. Varm væsken ved 37 °C i 10 minutter for å løse opp store DNA-pellets helt.
- Spinnrør etter oppvarming for å gjenvinne kondensdråper på lokket (3 400 x g i 1 min).
- Mål konsentrasjonen og oppnå forholdet 260/280 ved hjelp av et spektrofotometer. Bruk molekylært vann som et emne. DNA av god kvalitet bør ha 260/280-forhold mellom 1,8 og 2.
MERK: Forventet DNA-utbytte er minst 0,03 g per fekalpellets.
3. Prøvepreparering for 16S rRNA-gensekvensering
- Send DNA-prøvene til Argonne National Laboratory, hvor de gjennomgår bibliotekforberedelse og sekvenseres på Illumina Miseq.
- Send prøver i fullt skjørt 96-brønnsplater, med prøver arrangert i rader (A1-A12, B1-B12, etc.), og forseglet med folieplatetetninger.
- Send et endelig volum på 20 μL per prøve per brønn, varierende i konsentrasjon fra 1-50 ng / μL.
MERK: Fortynninger bør gjøres med molekylært vann. - Etter å ha forberedt prøvene, spinn ved 600 x g i 1 min ved romtemperatur før du fryser prøvene ved -80 ° C i 24 timer.
- Send over natten på tørris.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene fra Argonne National Laboratory analyseres av en kvalifisert bioinformatiker, etterfulgt av en intern analyse av dataene ved hjelp av standard statistiske metoder. Typiske mikrobiomanalyser involverer gruppering av lignende sekvenser i operasjonelle taksonomiske enheter (OTUer) eller amplikonsekvensvarianter (ASV) som en proxy for forskjellige mikroorganismer i en prøve. Tellinger av OTUer eller ASV-er på tvers av prøver kan deretter brukes til å teste for endringer i mangfold innen utvalg (alfa) og mangfold mellom utvalg (beta). De kan også brukes til å teste for taxa som er differensielt rikelig på tvers av metadatakategorier av interesse.
Som vist i figur 1, har musestammen som mangler reseptoren CX3CR1 en annen tarmmikrobiotasammensetning. Sammenlignet med villtype MRL/lpr viser MRL/lpr-CX 3CR1 gfp/gfp-mus (som uttrykker det grønne fluorescerende proteinet i stedet for CX3CR1) signifikante forskjeller i visse slekter som er relevante for potensielt patogene bakterier som de i phylum Proteobacteria. I tillegg ble det observert noen forskjeller for "sunne" kommensale bakterier som Bifidobacterium, men ikke Lactobacillus.
Figur 1: Sammenligning av tarmmikrobiota på slektsnivå for MRL/lpr og MRL/lpr-CX3CR1 mus. Overfloden av forskjellige slekter ved 13, 14 og 15 ukers alder (n = 5 kvinnelige mus per gruppe). Toveis ANOVA ble utført. Ingen signifikans ('ns'), *P < 0,05, **P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Balansert tarmmikrobiota kan beskytte menneskekroppen mot sykdommer. Når denne balansen er forstyrret av eksterne eller interne utløsere, kan konsekvensene være ødeleggende. Denne metoden presenterer en måte å analysere dynamikken i tarmmikrobiota i murine modeller. Metoden er egnet ikke bare for sammenligninger mellom grupper, men også for å spore tarmmikrobiotaen over tid for bedre å identifisere tidsavhengige faktorer som forstyrrer tarmmikrobiotaen.
Alle musene i forsøket må håndteres i samme miljø. En viktig sak å vurdere når du samler fekale prøver, er å være i samsvar med tid, dag og sted. Mus er koprofagiske. Dette betyr at de spiser avføringen eller de rundt dem for å få essensielle næringsstoffer. Derfor kan avføring ikke samles fra buret. Prøver må samles frisk og direkte fra anus. Den beste metoden er å massere musen mens du holder den eller plassere musen i en beholder. I tillegg anbefales det at prøvene behandles samtidig og fryses ned ved -80 °C mens man venter på at alle prøvene skal være klare.
DNA-ekstraksjon er ekstremt følsom for pipettering og håndtering, så alle prøvene bør behandles samtidig. En annen vurdering er å unngå miljøforurensning; Derfor bør hvert eneste trinn som ikke nødvendigvis utføres i den kjemiske hetten på grunn av de giftige reagensene, gjøres i et biologisk sikkerhetsskap. Selv om sjansene for miljøforurensning er lave og det ikke er noe skritt for å la bakterier vokse, er denne metoden ekstremt følsom, og det anbefales absolutt å unngå mulig forurensning. I tillegg vil veiing av pellets bidra til å øke konsistensen mellom prøvene. Som en fordel i forhold til kommersielt tilgjengelige sett, er denne metoden spesielt god for å oppnå høye konsentrasjoner av DNA. DNA-utbyttet oppnådd med denne protokollen varierer mellom 0,03 g og 0,07 g avhengig av vekten av fekalpelleten. Til sammenligning kan kommersielle sett gi mellom 0,005 g og 0,05 g, men med større sjanse for metning som begrenset av kolonneretensjonstrinnet.
Perle-bankende trinnet er viktig for å bryte fekalpelleten i små biter, slik at lysismidlet kan nå alle bakteriene. Hvis dette trinnet ikke er godt utført, kan pellets delvis oppløses, og færre representative bakterier kan nås. I tillegg, når du overfører supernatanter, er riktig pipettering viktig, siden det å bære en del av restbufferen fra forrige trinn vil endre utbyttet og kvaliteten på DNA på slutten.
Ved fortynning av prøvene for 16S ribosomal RNA-gensekvensering er det viktig å handle raskt før prøvene settes i fryseren. Det er også viktig å blande prøver godt før du utfører fortynninger. Unngå å etterlate prøver ved romtemperatur i lange perioder. Siden volumene er små, vil frysing av prøvene i platen før du sender dem bidra til å minimere tap.
Argonne National Laboratory analyserer V4-regionen i 16S rRNA-genet. V4-regionen er bedre bevart enn de andre regionene og har et bedre estimat for høyt rangert taxa13. Mens de andre regionene er bedre for analyse av raskt utviklende arter og kan bidra til å identifisere og bedre diskriminere slekt eller art, akkumulerer disse regionene mutasjoner raskere enn V4.
Når resultatene er tilbake og analysert av en kvalifisert bioinformatiker, kan statistisk programvare brukes til å plotte resultatene og sammenligne grupper. Det er viktig å forstå begrensningene i denne teknikken og resultatene etter bioinformatikkanalyse. Jo lavere taksonomisk nivå, jo mindre nøyaktighet eller større variasjoner. Fra phylum til familie, og til og med slektsnivået kan analyseres med pålitelighet. Merknader på artsnivå er imidlertid ikke nøyaktige med denne metoden. Haglesekvensering kan derimot nå artsnivået; Men mens det kan gi mer innsikt i de biologiske funksjonene til et samfunn, er 16S rRNA-gensekvensering fortsatt en nøyaktig og kostnadseffektiv metode for å kvantifisere taksonomiske fordelinger av et mikrobielt samfunn15.
Oppsummert er det beskrevet en kostnadseffektiv protokoll for å analysere tarmmikrobiotaen og studere dens dynamikk med maksimal nøyaktighet som kan bidra til å avsløre langsgående endringer over tid, samt forskjeller mellom grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi setter pris på hjelpen fra Argonne National Laboratory og våre samarbeidende bioinformatikere. Dette arbeidet støttes av ulike NIH og interne tilskudd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
- Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).
- Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).
- Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).
- Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
- Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
- Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).
- Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).
- Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).
- Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365 (2016).
- Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).
- Galloway-Peña, J., Hanson, B.
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).
