Summary
A doença cardiovascular é a principal causa de morte em todo o mundo. A calcificação vascular contribui substancialmente para a carga de morbidade e mortalidade cardiovascular. Este protocolo descreve um método simples para quantificar a precipitação de cálcio mediada por células musculares lisas vasculares in vitro por imagem fluorescente.
Abstract
A calcificação vascular envolve uma série de patologias degenerativas, incluindo inflamação, alterações no fenótipo celular, morte celular e ausência de inibidores da calcificação, que concomitantemente levam a uma perda de elasticidade e função dos vasos. A calcificação vascular é um importante contribuinte para a morbidade e mortalidade em muitas patologias, incluindo doença renal crônica, diabetes mellitus e aterosclerose. Os modelos de pesquisa atuais para estudar a calcificação vascular são limitados e só são viáveis nos estágios finais do desenvolvimento da calcificação in vivo. Ferramentas in vitro para o estudo da calcificação vascular utilizam medições de end-point, aumentando as demandas de material biológico e arriscando a introdução de variabilidade nos estudos de pesquisa. Demonstramos a aplicação de uma nova sonda marcada fluorescentemente que se liga ao desenvolvimento de calcificação in vitro em células musculares lisas vasculares humanas e determina o desenvolvimento em tempo real da calcificação in vitro . Neste protocolo, descrevemos a aplicação de nosso recém-desenvolvido ensaio de calcificação, uma nova ferramenta na modelagem de doenças que tem potenciais aplicações translacionais. Consideramos que este ensaio seja relevante em um espectro mais amplo de pesquisa de deposição mineral, incluindo aplicações em pesquisas ósseas, cartilaginosas ou odontológicas.
Introduction
A calcificação vascular (CV) é um fator de risco independente para morbidade e mortalidade cardiovascular 1,2,3. Há muito considerado um processo químico passivo de deposição mineral ectópica, agora aparece uma resposta de cicatrização tecidual modificável envolvendo a contribuição ativa de várias células, incluindo células musculares lisas vasculares ativadas (hVSMC) como um impulsionador da doença 4,5. In vivo A CV pode ser medida por tomografia computadorizada multislice como avaliação da carga aterosclerótica 6,7,8. Atualmente, uma mudança de paradigma está em andamento, em que a gravidade da CV está se tornando reconhecida como um fator de risco em doenças cardiovasculares, diabetes tipo II, doença renal crônica e envelhecimento 9,10,11,12,13,14,15.
Os hVSMCs são o tipo de célula mais abundante no sistema cardiovascular e um ator principal no desenvolvimento da CV. A calcificação induzida por hVSMC in vitro é um modelo de doença amplamente utilizado para estudar doenças cardiovasculares16,17. No entanto, a maioria dos protocolos para a detecção de calcificação in vitro usa medições de ponto final que podem limitar a aquisição de dados, exigir maior uso de material celular e retardar a pesquisa. Métodos comuns para a detecção da calcificação do hVSMC in vitro incluem o ensaio de o-cresolftaleína, que mede a deposição de cálcio solubilizado em relação à proteína total e requer lise celular18. Além disso, utiliza-se a coloração Alizarin Red, que se liga diretamente aos depósitos de cálcio em células ou tecidos fixos19. Para estudar a calcificação do hVSMC ao longo do tempo com o-cresolftaleína ou Alizarin Red requer lotes de replicações por ponto de tempo, aumentando a demanda por material biológico e, por sua vez, aumentando a chance de variabilidade.
Neste artigo, detalhamos o método para a aplicação de um novo ensaio que utiliza hVSMCs com uma sonda de imagem fluorescente para determinar a progressão da CV in vitro, bem como a função como um ensaio singular de calcificação em estágio terminal. Demonstramos anteriormente que este ensaio é diretamente comparável aos métodos o-cresolftaleína e Alizarina Vermelha e pode ser usado para distinguir entre diferentes condições de cultura20. Além das medidas em tempo real, este ensaio pode ser utilizado para determinar a propensão de amostras de soro ou plasma como um marcador substituto para o desenvolvimento clínico da CV20. Isso ajudará na aplicação de estratégias biológicas das ciências cardiovasculares e modelagem de doenças. Uma aplicação adicional do ensaio pode ser como um sistema BioHybrid translacional para avaliar a gravidade ou a progressão da CV a partir de constituintes sanguíneos, como soro ou plasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Semeadura, manutenção e indução de calcificação celular
- Para cultivar células primárias, use um gabinete de fluxo de ar laminar, luvas e equipamentos estéreis. Desinfete as mãos e o espaço de trabalho antes e depois de realizar qualquer trabalho. Trate todas as células primárias e meios de cultura como um potencial risco biológico, salvo prova em contrário. De preferência, células e meios excedentes de autoclave antes da eliminação. Não inative quimicamente e autoclave, pois isso liberará vapores tóxicos.
- Cultura hVSMC em placas de cultura celular não revestidas.
- Manter rotineiramente o hVSMC em meio de crescimento constituído por meio M199 suplementado com 10%-20% FBS e 1% Pen/Strep e incubar a 37 °C e 5% de CO2.
- Divida as células em uma confluência de 70% a 90%.
- Para dividir, lave os hVSMCs 2x com PBS. Adicionar tripsina e incubar durante 2-5 min a 37 °C. Verifique o desprendimento das células ao microscópio.
- Inibir a reação de tripsina adicionando meio contendo soro. Centrifugar as células a 350 x g durante 4 min e ressuspender o pellet em meio de manutenção. Os hVSMCs seguem um esquema de divisão de 1:2.
- Para iniciar o experimento de calcificação, prepare as células seguindo as instruções para uma divisão (Etapa 1.4.1). Após a ressuspensão, conte as células e as sementes em uma placa de 48 poços a uma densidade de 10-15 x 103 células/cm2. Semeia as células evitando o uso dos poços externos, conforme recomendado na Figura 1 Suplementar.
- Deixe as células aderirem e se recuperem por 24 h (durante a noite) enquanto incubam a 37 °C e 5% de CO2.
- Lave suavemente as células 2x com PBS, aspirando cuidadosamente todos os PBS restantes após a2ª lavagem.
- Adicionar suavemente o meio de calcificação e incubar a 37 °C e 5% de CO2. O meio de calcificação deve conter um estímulo de calcificação, fetuína A marcada fluorescentemente (por exemplo, com proteína fluorescente vermelha [RFP]) (1 μg/mL) e coloração nuclear HOECHST 33342 (0,1 μg/mL) ou coloração nuclear fluorescente viva semelhante. Não use DAPI, pois isso não é permeável.
- Verifique diariamente com um microscópio de luz até que ocorra a calcificação.
NOTA: Para obter observações sobre a cultura de células e a manutenção de hVMSCs, consulte o Arquivo Suplementar 1.
2. Detecção de calcificação por imagem
Observação : O protocolo a seguir fornece as etapas gerais a serem tomadas na preparação, geração de imagens e análise de dados. As capturas de tela que suportam as instruções para cada etapa usando uma plataforma de imagem automatizada e o software de análise de imagem correspondente (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes) são fornecidas no Arquivo Suplementar 2 e no Arquivo Suplementar 3. Outros instrumentos de imagem e ferramentas de processamento de imagem podem ser usados para aplicar este protocolo. No entanto, imagens repetidas no mesmo local em cada poço são cruciais para a aquisição significativa de dados. A criação de um protocolo para calcificação e reutilização de imagens em cada etapa de imagem é necessária para a obtenção de resultados reprodutíveis. Na primeira vez que aplicar o método, siga as etapas abaixo para se preparar antes da imagem.
- Configuração do protocolo
- Abra o software e selecione Protocolos e Criar Novo.
- Selecione Procedimento e clique em Definir temperatura. Na janela pop-up, defina a temperatura como 37 °C e o gradiente como 1 °C e clique em OK. Selecione o tipo de prato de escolha no menu suspenso. Adicione a etapa de criação de imagens clicando em Imagem. Selecione o gerador de imagens invertido e clique em OK.
- Adicione três canais de imagem e defina-os como DAPI (377, 447 nm), RFP (531, 593 nm) e brightfield. Marque a caixa Montagem e defina o número e a localização desejados das imagens. 2 x 2 para uma placa de 48 poços é uma escolha comum. Altere a sobreposição para representar uma melhor cobertura de cada poço. Selecione quais poços devem ser fotografados. Uma nova janela será aberta onde os poços de interesse podem ser selecionados.
- Clique em Opções de Foco para definir o modo de foco. Uma nova janela será aberta. Defina cada canal individualmente. Comumente, os poços são focados automaticamente no canal "DAPI". Defina todos os outros canais como Altura Focal Fixa do Primeiro Canal e defina clicando em OK. Feche a janela.
- Inicie as etapas de redução de dados de pré-configuração clicando em Redução de Dados e selecione Pré-processamento de Imagem. A configuração desta etapa reduz o plano de fundo de fluorescência. Aceite as configurações padrão selecionando OK. Um novo conjunto de imagens será criado com o prefixo "TSF". As imagens originais serão preservadas.
- Configure uma etapa para contar as células selecionando Análise Celular. Selecione Imagens TSF DAPI no menu suspenso Canal . Defina mais detalhes após a realização da imagem. Essa etapa também pode ser considerada redução de dados; certifique-se sempre de manter as imagens originais.
- Prepare a análise do sinal RFP (calcificação) selecionando Estatísticas. Na janela pop-up, rotule Etapa e selecione TSF RFP como o canal de entrada. Marque as caixas Valor Superior e Valor Inferior. Marque a caixa Área Total na lista inferior. Selecione Nenhum na coluna Efeito de Cor. Na janela pop-up, clique em Personalizado e marque a caixa Plano de fundo. Isso codificará por cores os resultados de baixo-alto para facilitar a avaliação. Pressione OK.
- Para uma leitura justa, normalize o sinal de RFP por célula. Ao fazer isso, uma área total é dividida por célula. Para configurar esta etapa, pressione Ratio no lado esquerdo. Na janela pop-up, selecione para entrada de dados 1 RFP Quantificação: Área Total no menu suspenso. Selecione ainda mais Contagem de células como entrada de dados 2.
- Por fim, selecione um Novo Nome do Conjunto de Dados e pressione OK e OK novamente. Selecione Efeito de cor, conforme descrito anteriormente. No canto superior esquerdo, selecione Arquivo e salve o arquivo como protocolo (tipo de arquivo .prt).
- Diariamente após a primeira calcificação ocorre
- Para cada ponto de tempo, repita estas etapas. No software de inicialização, pressione Ler agora e Protocolo existente.... Selecione o protocolo que foi criado na etapa anterior. O programa pedirá para salvar o experimento. Isso pode ser feito nesta etapa, mas também em qualquer etapa posterior manualmente, clicando no botão Salvar no canto superior esquerdo.
- Uma janela pop-up pedirá para aguardar o aquecimento do sistema. Ligue o controlador de gás CO2 e defina-o para 5%.
- Uma vez que o sistema tenha atingido a temperatura definida, um prompt aparecerá para inserir uma placa e ler. Pressione Cancelar. Isso ocorre porque, para cada ponto de tempo, a exposição de cada fluorocromo deve ser ajustada individualmente.
- Transporte a placa da incubadora para o gerador de imagens em um cofre que resiste a quebrar e derramar e esteja de acordo com os regulamentos locais de biossegurança para o transporte de células vivas, em caso de acidente. Coloque a placa no leitor de placas.
- Após o cancelamento, clique em Procedimento. Na janela pop-up, selecione Pre-Set Imaging Step. Ajuste o foco e a exposição no canal DAPI primeiro. Desmarque a caixa Exposição automática em todos os canais. Em seguida, clique no ícone Microscópio ao lado do canal DAPI . Uma nova janela será aberta.
- Selecione o poço para se concentrar. Use um poço com calcificação média a alta para esta etapa. Se um sinal já estiver visível, primeiro clique em Foco automático e, em seguida, em Exposição automática. Caso contrário, primeiro aumente a exposição e repita o foco automático e a exposição automática. Se desejado, a exposição pode ser ajustada manualmente, selecionando o menu suspenso de exposição. Verifique as configurações em vários poços. Uma vez satisfeito, salve as configurações.
- Ajuste a exposição da mesma maneira para todos os canais.
ATENÇÃO: Não se concentre em outros canais; apenas ajustar a exposição. O foco simples deve ser o mesmo para todos os canais. - Feche a janela do procedimento. Selecione o botão verde Ler Agora na barra de tarefas superior. Salve o experimento conforme indicado pelo software.
NOTA: O software agora lerá automaticamente todos os poços selecionados nas configurações selecionadas.
3. Análise dos dados
NOTA: Para obter capturas de tela detalhadas sobre como executar a análise de dados usando uma plataforma de imagem automatizada e o software de análise de imagem correspondente (consulte Tabela de materiais para obter detalhes), consulte o Arquivo Suplementar 4. Se estiver usando instrumentos de imagem alternativos ou software de análise, as imagens devem ser exportadas e processadas em lote, garantindo que a exposição, o limiar de fluorescência ou a intensidade sejam ajustados igualmente para todas as imagens em um conjunto de dados comparativos.
- Enquanto o sistema lê a placa, todas as imagens são processadas automaticamente em segundo plano. Ajuste as configurações para contagem de células selecionando imagens TSF DAPI a serem exibidas. Selecione o poço de escolha clicando duas vezes. Uma nova janela aparecerá. Selecione uma das imagens.
- Selecione a guia Análise . Na janela pop-up, selecione Análise celular: contagem de células. Clique em OK. Desmarque os canais RFP e brightfield. Marque a caixa Realçar Objetos .
- Clique em Opções para abrir o menu. Ajuste o limite de tamanho e intensidade para incluir todos os núcleos, mas excluir detritos. Clique em OK. Clique em Aplicar alterações no canto inferior esquerdo para também transferir as configurações para todas as outras imagens.
- De maneira semelhante a antes, selecione um poço e uma imagem com uma quantidade média a alta de calcificação para melhor ajustar a relação sinal-ruído; clique na guia Análise no menu de tarefas.
- Desta vez, selecione Estatísticas da imagem. Desmarque o canal DAPI e o campo brilhante. Clique em Opções para abrir o menu. Marque a caixa Limites atípicos. Ajuste os valores superior e inferior do limite. Só conte o sinal se ele estiver acima do plano de fundo e exclua se houver detritos/artefatos.
- Para definir um valor de limite não subjetivo para o sinal acima do plano de fundo, selecione a ferramenta de linha na barra de tarefas. Uma janela aparecerá. Desenhe uma linha através de um patch de sinal, mas certifique-se de incluir também uma área de fundo.
NOTA: Um gráfico aparecerá na janela pop-up, mostrando um pico representando o sinal acima da linha de fundo. O valor de altura de pico de 25% representa o limite recomendado. Também é recomendável medir vários patches de sinal para garantir a seleção do limite certo. Ao selecionar manchas de sinal, a seleção de regiões com intensidade de sinal muito alta pode resultar em um limite que negligencia sinais médios e ou inferiores. Recomenda-se, portanto, selecionar manchas de sinal médio a baixo acima do fundo. Exemplos de limites muito altos, muito baixos e precisos são mostrados no Arquivo Suplementar 4. - Uma vez satisfeito, clique em OK e em Aplicar Alterações para transferir as configurações para todos os outros poços. Verifique se o limite está selecionado com precisão nos outros poços.
- Depois que a contagem de células e os limites de RFP estiverem definidos, exporte os dados. Selecione a placa de interesse. No menu suspenso, vários parâmetros podem ser selecionados para exportação. De relevância pode ser a contagem de células, a área de RFP e a "área/célula", que é a métrica usada para comparação entre os grupos. Clique no botão Excel ao lado do menu suspenso para exportar os dados diretamente para uma planilha.
NOTA: No menu suspenso, os valores calculados para a contagem de células, a área total do sinal RFP (refletindo a área de calcificação), bem como a razão normalizada da área total do sinal RFP por célula, agora podem ser selecionados individualmente e exportados para uma planilha. Exiba os resultados como a proporção da área total do sinal de RFP por célula e visualize (por exemplo, gráficos de barras). Aplique um teste t de Student não pareado para comparar dois grupos ou uma ANOVA não pareada para comparar diferentes grupos ao mesmo tempo. Comparar o mesmo grupo em diferentes momentos pode exigir análise estatística pareada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O resultado inclui imagens originais de núcleos corados com HOECHST, calcificação marcada com RFP e imagens de campo brilhante. Diferentes estágios de calcificação que variam de baixo (Figura 2) a alto (Figura 3) podem ser detectados e analisados. A calcificação geralmente pode ser detectada como manchas pretas usando microscopia de luz (Figura 2D e Figura 3B, setas indicam calcificação), que são úteis para avaliação primária e para determinar quando iniciar a imagem. Para melhorar a relação sinal-ruído, as imagens RFP processadas devem ser analisadas para quantificar a calcificação (Figura 2F e Figura 3D, setas indicam calcificação). Finalmente, os dados podem ser apresentados como um gráfico de barras comparando duas ou mais condições em um ponto de tempo, acompanhado de imagens representativas (Figura 4A,B,C). Os dados devem ser exibidos normalizados para a contagem de células (por exemplo, como área de calcificação por célula). Os dados também podem ser exibidos como dados de séries temporais mostrando a mesma condição em vários pontos de tempo (Figura 4D).
Figura 1: Resumo visual resumindo as etapas para a detecção e análise de calcificação semi-automatizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplo de calcificação em estágio inicial. (A)A imagem de sobreposição pode ser exibida e analisada como (B) DAPI (núcleos), (C) RFP (calcificação) e (D) imagens de campo brilhante separadas. (E) Os núcleos são identificados pelo software e podem ser destacados como círculos amarelos para ajustar as configurações. (F) Para análise do sinal RFP, as imagens são pré-processadas para reduzir o sinal de fundo e, (G) posteriormente, um limite pode ser definido para medir o sinal. As setas indicam calcificação no campo brilhante (D) e (F & G) imagens RFP transformadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplo de calcificação em estágio posterior. (A) A imagem de sobreposição pode ser exibida e analisada como imagens separadas (B) de campo brilhante, (C) RFP (calcificação) e (E) DAPI (núcleos). (D) Para análise do sinal de RFP, as imagens são pré-processadas para reduzir o sinal de fundo. As setas indicam calcificação no campo brilhante (B) e (D) imagens RFP transformadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Comparação representativa entre baixa e alta calcificação do hVSMC após 14 dias em cultura com meio de calcificação. Comumente, os dados podem ser exibidos como um gráfico de barras e analisados empregando o teste t de Student não pareado. Imagens representativas de (A) baixa calcificação e (B) alta calcificação. O sinal vermelho (RFP) reflete a calcificação e o sinal azul (HOECHST) exibe núcleos. (C) Calcificação apresentada como sinal positivo fetuína A-RFP (área total) por célula. (D) Exemplo de um ensaio de calcificação medido ao longo do tempo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Exemplo de uma variedade de poços usados para um experimento de calcificação com hVSMCs. O anel externo dos poços não é usado para o experimento de calcificação, mas preenchido com líquido. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 1: Notas sobre a cultura de células e manutenção do hVMSC. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 2: Protocolo de imagem automatizado. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 3: Protocolo de análise de imagens. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 4: Protocolo de análise de dados. Clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste manuscrito, descrevemos um método semi-automatizado para determinação da calcificação in vitro . Para este método, três etapas críticas da calcificação do hVSMC devem ser otimizadas. Primeiro, a densidade celular é crítica para o desenvolvimento da calcificação do hVSMC. Baixas densidades de hVSMCs resultarão em calcificação lenta ou nenhuma e morte celular devido à falta de contato célula-a-célula e ao estresse induzido sob condições calcificantes21. Altas densidades celulares resultam em excesso de confluência, após o que as células se tornam senescentes22 e o desenvolvimento da calcificação pára. É fundamental semear cerca de 70% de confluência na placa do poço que será utilizada para o desenvolvimento subsequente da calcificação, garantindo a capacidade proliferativa e as conexões celulares dos hVSMCs.
Em segundo lugar, o meio de cultura celular que será usado para a indução da calcificação requer otimização. Dentro da pesquisa de calcificação vascular, uma variedade de condições e composições de meios têm sido relatadas para calcificar hVSMCs23,24. Acreditamos que o método é adequado para detectar todos os tipos de calcificação mediada in vitro, e tem sido usado para detectar depósitos estimulados por cálcio, fosfato ou cálcio-fosfato. Independentemente do modo de indução da calcificação, a otimização do meio calcificante é fundamental. No protocolo apresentado, otimizamos a indução de calcificação utilizando M199 com concentração total de cálcio de 4,5 mM Ca2+ com FBS a 2,5%.
Por fim, diferenças locais nas placas durante a calcificação foram observadas. É fundamental aplicar o carregamento aleatório de replicações técnicas para evitar o viés da amostra. Além disso, o carregamento das faixas externas do poço deve ser evitado, pois esses poços sempre se calcificam mais rapidamente na configuração de 48 poços. Isso é potencialmente causado pela desregulação da umidade intraplaca, em que não usar os poços mais externos e carregar esses poços com grandes volumes de líquido ajuda a controlar isso.
Embora o ensaio de calcificação em si possa exigir várias etapas de otimização para garantir a reprodutibilidade com uma configuração específica, uma vez instalado e funcionando, isso se torna simples. Os ensaios de calcificação podem ser executados simultaneamente e repetidamente sob condições estabelecidas, sem a necessidade de otimização adicional. A calcificação mediada por hVSMC pode ser desafiadora e requer experimentação antes que a robustez dos ensaios tenha sido alcançada. Um pesquisador deve ser capaz de determinar o momento ideal antes de iniciar a imagem regular, o que pode levar até 1 semana. Um cronograma de imagem fixo pode ser estabelecido desde o início do experimento, embora isso possa produzir muitas imagens sem leituras diferenciais, usar uma quantidade relativamente grande de armazenamento de dados para imagens e ser demorado na análise.
O procedimento descrito neste protocolo é uma forma de realizar a análise do ensaio de calcificação. Para outros fins, o procedimento deve ser ajustado em conformidade. Nossa análise usando a plataforma de imagem automatizada referenciada garante a reprodutibilidade, embora a análise possa ser realizada usando qualquer célula viva e dispositivo de imagem controlado por temperatura e CO2. Além disso, os pacotes de software comercial correspondentes são otimizados para triagem e análise celular de alto conteúdo, ideais para medir a propensão à calcificação ao longo do tempo. Outras soluções de software, como o freeware ImageJ, podem fornecer análise de imagem e quantificar o desenvolvimento de calcificação também.
A imagem de placas de calcificação em estágio avançado pode ser difícil devido a problemas com o foco automático, caso a cultura encontre detritos flutuantes, resultando em um número reduzido de imagens nítidas e replicações. A análise de imagens deve ser ajustada de acordo, e algumas soluções foram desenvolvidas no software empregado neste protocolo para melhorar e simplificar a análise.
A heterogeneidade celular desempenha um papel crucial na quantificação da calcificação in vitro. Nesta plataforma, utilizamos hVSMCs como biossensores para o desenvolvimento da calcificação. Os hVSMCs primários são derivados de vários doadores com diferentes patologias vasculares subjacentes; portanto, este ensaio ainda está sujeito a alta variabilidade devido à heterogeneidade dos lotes VSMCs. Uma solução possível é o uso de linhagens celulares imortalizadas ou o uso de hVSMCs derivados de células-tronco pluripotentes.
Outra limitação é que o método de quantificação ainda é sensível à subjetividade. A subjetividade nos ensaios de calcificação surge por causa dos ensaios de ponto final, que só estavam disponíveis até recentemente. Os pesquisadores devem decidir quando parar o experimento e medir a calcificação, aumentando a subjetividade do ensaio. Acreditamos que o método introduzido neste manuscrito é superior, pois medimos ao longo do tempo e podemos comparar o desenvolvimento da calcificação em um determinado período. Ligada a isso, a configuração de iluminação precisa ser ajustada para cada ponto de tempo separadamente devido à diminuição do sinal ao longo do tempo. Devido a isso, a quantidade de sinal representada em uma imagem ainda é influenciada pela opinião de um indivíduo. É crucial que a iluminação seja realizada com as mais altas relações sinal-ruído para que a análise pós-imagem possa ser realizada da forma mais objetiva possível.
Embora vejamos a subjetividade deste ensaio como uma limitação, acreditamos que ele é superior a outros métodos de calcificação in vitro . Ao contrário dos métodos existentes, nosso ensaio de calcificação semi-automatizado tem a vantagem de que as imagens podem ser analisadas anonimamente, fornecendo assim uma opinião cega independente. Além disso, as imagens podem ser analisadas em um estágio posterior com as mesmas configurações definidas em um conjunto de dados, reduzindo assim a subjetividade.
Os métodos atuais de determinação da calcificação dependem de medidas de ponto final ou não possuem o componente vascular25,26,27. Dentro da clínica, ferramentas como tomografia computadorizada, ultrassonografia intravascular e ressonância magnética são caras e um fardo para os pacientes. A pesquisa de biomarcadores provou seu uso, mas não reflete a carga de calcificação dos pacientes. Acreditamos que este ensaio semi-automatizado usa não apenas um único biomarcador, mas uma coleção de componentes circulantes, refletindo o estado cardiovascular de um paciente. Isso pode ser usado para medir uma resposta de calcificação como um biossensor. Potenciais outras aplicações do método descrito incluem a triagem sérica dos pacientes para o desenvolvimento de calcificação in vitro como um marcador substituto para o desenvolvimento personalizado de calcificação vascular. A plataforma demonstrou sua sensibilidade à diálise e ao tratamento com vitamina K, além de doenças metabólicas e não metabólicas que estão ligadas a pacientes com mau estado cardiovascular e prognóstico20. Como o princípio do ensaio é baseado na detecção de cristais de cálcio, levantamos a hipótese de que ele também pode ser relevante em outras áreas de pesquisa onde a mineralização pode ser relevante, como osteoartrite, osteoporose, medicina regenerativa óssea ou pesquisa odontológica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Leon Schurgers recebeu subsídios institucionais da Bayer, Boehringer Ingelheim, NattoPharma e IDS. Leon Schurgers possui ações da Coagulation Profile. Willi Jahnen-Dechent é co-fundador e acionista da CALCISCON AG.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelos programas de pesquisa e inovação Horizonte 2020 da União Europeia sob o contrato de subvenção Marie Sklodowska-Curie No 722609 and 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Esta pesquisa foi apoiada pela BioSPX. O WJ-D recebeu financiamento do 322900939 de identificação do projeto TRR219 da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação Alemã de Pesquisa) e do ID do projeto 403041552
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
- Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
- Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
- Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
- Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
- Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
- Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
- Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
- Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
- Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
- Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
- Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
- Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
- Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
- Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
- Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
- Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
- Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
- Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
- Wang, X. -R., Zhang, J. -J., Xu, X. -X., Wu, Y. -G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
- Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
- Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
- Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
- Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
- Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).
