Summary
Burada, tek hücreli dizileme için yüksek kaliteli tek hücreli bir tilapia bağırsağı süspansiyonunun hazırlandığını gösteriyoruz.
Abstract
Nil tilapyası, dünya çapında en yaygın kültüre alınmış tatlı su balığı türlerinden biridir ve su ürünleri balık çalışmaları için yaygın olarak kullanılan bir araştırma modelidir. Yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonların hazırlanması, tek hücreli RNA veya genom dizilimi gibi tek hücreli seviyedeki çalışmalar için gereklidir. Bununla birlikte, su ürünleri yetiştiriciliği balık türleri, özellikle tilapia bağırsağı için kullanıma hazır bir protokol yoktur. Etkili ayrışma enzimleri doku tipine bağlı olarak değişir. Bu nedenle, minimum hasarla yeterli canlı hücre elde etmek için uygun enzim veya enzim kombinasyonunu seçerek doku ayrışma protokolünü optimize etmek esastır. Bu çalışma, Nil tilapia bağırsağından kollajenaz / dispaz enzim kombinasyonu ile yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için optimize edilmiş bir protokolü göstermektedir. Bu kombinasyon, sindirim sonrası hücre agregasyonunu azaltmak için sığır serum albümini ve DNaz kullanımı ile ayrışma için oldukça etkilidir. Hücre çıkışı,% 90 hücre canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşılar. Bu protokol, diğer balık türlerinin bağırsaklarından tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için de değiştirilebilir. Bu araştırma, etkili bir referans protokolü sağlar ve su ürünleri yetiştiriciliği balık türleri için tek hücreli süspansiyonların hazırlanmasında ek denemelere olan ihtiyacı azaltır.
Introduction
Hücreler organizmaların temel birimleridir. Toplu doku çalışmaları ile karşılaştırıldığında, tek hücre düzeyinde çalışmalar hücre heterojenliğini yansıtabilir ve daha yüksek çözünürlüklü bilgi sağlayabilir1. Son yıllarda, araştırmacılar memelilerde, zebra balıklarında ve diğer model organizmalarda genom, transkriptom, epigenom veya multi-omik çalışmalar için tek hücreli dizileme teknolojilerini tek hücreli seviyelerde uyguladılar ve büyük atılımlar bildirdiler 2,3,4,5,6,7 . Çoğu çalışma model organizmalara odaklanmış olsa da, ekonomik balık türlerinde tek hücreli dizileme için az sayıda referans protokolü veya ticari ayrışma kiti vardır, bu da su ürünleri yetiştiriciliği araştırmalarında tek hücreli dizilemenin uygulanmasını sınırlar. Bu nedenle, yüksek hücre canlılığına ve nükleik asit bütünlüğüne sahip yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar üreten doku ayrışma protokollerinin geliştirilmesi çok önemlidir.
Minimum hasarla yeterli sayıda canlı hücre elde etmek için doku ayrışma protokolünün uygun enzim veya enzim kombinasyonu ile optimize edilmesi esastır. Doku ayrışması için en etkili enzim doku tipine bağlı olarak değişir. Memelilerde, kollajenaz, dispaz, tripsin, papain, elastaz, hyaluronidaz, liberaz, accutaz ve trypLE 8,9 dahil olmak üzere memeli katı dokuları için tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak için çeşitli enzimler kullanılmıştır. Mekanik bozulma ile birlikte tripsin sindirimi, balıklarda hücre kültürü için dokuları ayrıştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır10,11,12,13,14. Tripsin ayrıca sıçan bağırsağı15 ve zebra balığı solungaç dokusu16'da doku ayrışması için sindirim kokteyline kullanılmış veya eklenmiştir. Bununla birlikte, çeşitli nedenlerden dolayı, tripsin tek hücreli dizileme için en iyi seçenek değildir. Tek başına tripsin genellikle doku ayrışması için etkisizdir. Ek olarak, tripsin DNA ipliğinin17,18 kırılmasını ve RNA yıkımının19'u indükler.
Papain, hücreler arasındaki sıkı kavşakları oluşturan proteinleri bozar. Memeli sinir ve düz kas hücrelerinde, papain diğer proteazlardan daha verimli ve daha az yıkıcıdır20,21. Bununla birlikte, tripsin gibi, papain, enzimatik sindirim sırasında meydana gelen hücre lizisi nedeniyle hücrelerin serbest DNA kaynaklı toplanmasına neden olur9. Elastaz, tipik olarak ciltte, akciğerlerde, bağlarda, tendonlarda ve vasküler dokularda bulunan elastini parçalamaktadır22. Genellikle akciğer dokusunu ayırmak için kollajenaz, dispaz veya tripsin ile kombinasyon halinde kullanılır8. Hyaluronidaz hyaluronan'ın glikosidik bağlarını parçalayarak çeşitli bağ dokularında ve ciltte hücre dışı matriksin sindirimine katkıda bulunur 9,23.
Genel olarak, kollajenaz ve dispaz hücre dışı matriks parçalanması için iyi seçeneklerdir. İnsan, fare ve zebra balığı bağırsaklarının ayrışmasında kullanılmıştır24,25,26,27. Kollajenaz, kollajendeki peptit bağını yok eder, hücre dışı matrisin sindirimini teşvik eder ve hücreleri süspansiyona bırakır ve bu nedenle kollajenaz genellikle karaciğer 28,29, dalak30, pankreas31 ve bağırsak25 dahil olmak üzere insan ve fare katı doku ayrışması için kullanılır . Dispoz, polar olmayan amino asit kalıntılarının N-terminal peptid bağlarını hidrolize eden ve kollajenazdan daha hafif olan bir proteazdır. Fibronektin, tip IV kollajen ve daha az ölçüde tip I kollajen gibi hücre dışı matriks bileşenlerini, hücre-hücre kavşaklarını etkilemeden ayırır. Dispaz, bağırsak25,32, beyin33, karaciğer34, vb. gibi doku ayrışması için ayrı ayrı veya diğer enzimlerle birlikte kullanılır. Ek olarak, liberaz, accutaz ve trypLE dahil olmak üzere ticari olarak temin edilebilen sindirim kokteylleri, özellikle cilt, karaciğer ve böbrek 8,9 için katı doku ayrışması için iyi alternatiflerdir.
Nil tilapiası (Oreochromis niloticus), Perciformes takımının Cichlidae familyasına aittir. Tropikal ve subtropikal bölgelerde en çok kültürlü tatlı su balığı türlerinden biridir ve 2022 yılında yıllık 4,5 milyon ton üretim gerçekleştirmiştir35. İyi açıklamalı bir genoma sahip en iyi çalışılmış su ürünleri yetiştiriciliği balık türlerinden biridir. Nil tilapyası, kısa üretim süresi, yetiştirme kolaylığı ve çok çeşitli yetiştirme ortamlarına adaptasyonu nedeniyle su ürünleri yetiştiriciliği balık türleri için ideal bir araştırma modelidir. Bağırsak, beslenme, sindirim ve emilim, metabolizma ve mukozal bağışıklık organı olduğu için büyük araştırma ilgi çekicidir. Bağırsak, mikrobiyal popülasyonların yaşam alanıdır ve önemli bir bağışıklık dokusudur36. Makrofajlar, B hücreleri, granülositler ve T hücreleri dahil olmak üzere çok sayıda immün hücre tipinin varlığı nedeniyle immünolojik olarak aktiftir.
Bu çalışmada, su ürünleri balık türlerinde tek hücreli seviye çalışmalarını kolaylaştırmak için Nil tilapia bağırsağından yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için bir protokol geliştirdik. Bu dokuya özgü enzimlerin özelliklerine ve ön çalışmalara göre, kollajenaz / dispaz tilapia bağırsak dokusunun ayrışması için uygundur. Tek hücreli süspansiyonların hazırlanmasında göz önünde bulundurulması gereken son enzim tipi, apoptotik yollarıbaşlatmadan enzimatik sindirim sırasında ölü hücre lizisi yoluyla salınan serbest DNA'yı parçalayarak hücre agregasyonunu önleyen DNaz-I'dir 9 ve canlı hücre verimini arttırır36. Ek olarak, hücre kümelenmesini azaltmak ve hücre canlılığını artırmak için yıkama tamponuna sığır serum albümini (BSA) eklenir. Birçok reaktif şirketi BSA'yı bir enzim stabilizatörü olarak tanımlamaktadır. PBS'ye (fosfat tamponlu salin) %0,04-%1 BSA ilavesi, olumsuz etkileri olmayan tek hücreli dizileme süspansiyonları hazırlamak için bir yıkama çözeltisi geliştirmek için kullanılmıştır38. Düşük bir BSA oranının eklenmesi, hücre canlılığının korunmasına yardımcı olabilir ve hücre lizisi nedeniyle hücrelerin serbest DNA kaynaklı toplanmasını önleyebilir. Bu protokol aynı zamanda diğer su ürünleri balık türlerinin bağırsaklarından hücre ayrışma protokolleri geliştirmek için değerli bir referans sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma sırasındaki tüm hayvan protokolleri Hainan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (Protokol numarası: HNUAUCC-2022-00063; Onay tarihi: 2022-03-03). Bu deneyde kullanılan ekipman ve malzemelerin bir listesi Malzeme Tablosunda bulunabilir. Geçerli protokolün bir özeti Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Balık hazırlama
- Ortalama vücut ağırlığı 100 g olan 6 aylık Nil tilapyasını güvenilir bir kaynaktan elde edin. Herhangi bir hastalık belirtisi olmayan balıkları seçin.
- Bir sonraki adıma geçmeden önce balıkları 24 saat beslemeyi bırakın.
NOT: Balık orucu, bağırsak içeriğinin hacmini azaltır ve bağırsak segmentlerinin hazırlanmasını kolaylaştırır. - Vücut yüzeyindeki gevşek bağlı bakterileri yıkamak için balıkları iyi havalandırılmış steril suda 15 dakika durulayın.
- Balıkları 300 mg / L tricaine metansülfonat (MS-222) ile tüm hareketler durana kadar yaklaşık 10 dakika ötenazi yapın.
2. Reaktif hazırlama
- %0,08 BSA-Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini (BSA-DPBS, hücre durulama ve yeniden süspansiyon için) hazırlayın. 0,08 g BSA'yı (%0,8 w/v) 100 mL 1x DPBS içinde çözün. 4 °C'de saklayın ve kullanıldığında buz üzerinde önceden soğutun.
NOT: BSA ilavesi, hücre kümelenmesini en aza indirmek için faydalıdır. BSA oranı, hücre kümelenme koşullarına göre %0,04'ten %1'e kadar artırılabilir. - Enzimatik hücre ayrışma reaktifini hazırlayın.
- Kollajenaz/dispozu 1x PBS ile 1 mg/mL'lik nihai konsantrasyona (0.1 U/mL kollajenaz ve 0.8 U/mL dispoz) seyreltin. DPBS değil PBS kullanıldığından emin olun.
NOT: PBS, enzimin düzgün çalışması için gereken kalsiyum iyonlarını sağlar. DPBS bu adımda kullanılmamalıdır çünkü Ca 2+/Mg2+ içermez. Ek olarak, mevcut protokolde kollajenaz tip I kullanılır. - Seyreltmeyi steril 0,22 μm membran filtreden geçirin.
- % 95 hacimli kollajenaz / dispaz çözeltisi ve% 5 hacim fetal sığır serumu (FBS) içeren bir hücre ayrışma reaktifi hazırlayın.
NOT: Ayrışma reaktifi her kullanıldığında taze hale getirilmelidir. % 5 FBS kullanmak, sindirim sırasında hücre canlılığının korunmasına yardımcı olur.
- Kollajenaz/dispozu 1x PBS ile 1 mg/mL'lik nihai konsantrasyona (0.1 U/mL kollajenaz ve 0.8 U/mL dispoz) seyreltin. DPBS değil PBS kullanıldığından emin olun.
- Tripan mavi çözeltisi hazırlayın.
- Tripan mavisi çözeltisini 4 ° C buzdolabından alın ve çökelmeyi önlemek için kullanmadan önce birkaç dakika 15-20 ° C'de saklayın.
- Çözeltiyi steril bir 0,22 μm membrandan süzün.
3. Ekipman hazırlama
- Soğutulmuş santrifüjü kullanmadan önce 4 °C'ye kadar önceden soğutun.
- Steril RNaz içermeyen 1,5 mL santrifüj tüpleri, 50 mL konik tüpler, geniş delikli cam pipetler ve uçlar, membran filtreleri, hücre süzgeçleri ve tüm düşük retansiyonlu tüpler ve uçlar elde edin.
- Forseps, makas ve neşter dahil olmak üzere otoklav cam pipetler ve diseksiyon aletleri ve RNaz'ın tek hücreli RNA-seq için olumsuz etkilerini önlemek için RNaz giderme çözeltisi ile ön işlemden geçirilir.
4. Doku diseksiyonu ve hücre ayrışması
- Ötenazi balıkları diseksiyon için buzun üzerine koyun. Aseptik olarak, bağırsağın orta bölümünün 3-4 cm'sini toplayın ve mümkün olduğunca fazla yağ ve mezenter tüketin. Bağırsak yüzeyine bağlı yağları ve forseps ile elastik ve dövülebilir berrak mukoza tabakasını dikkatlice çıkarın.
NOT: Yağ ve mezenter bağırsağın dış yüzeyine tutturulur. - Dissosiyasyon protokolü üzerindeki olumsuz etkilerini önlemek için mümkün olduğunca fazla yağ alın. Bir şırınga kullanarak, bağırsak içeriğini ve mukusunu yıkamak için parçaları steril buz gibi soğuk PBS ile birkaç kez hafifçe durulayın. Zorlu kullanımlardan kaçının.
- Bağırsak segmentini küçük parçalara ayırın ve bunları 1 mL buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj. Süpernatantı yavaşça çıkarın ve 1 mL buz gibi soğuk% 0.08 BSA-DPBS ile değiştirin. Doku parçalarını cam pipet kullanarak nazik aspirasyonla yeniden askıya alın. Bu adımı iki kez yineleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve 30-60 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosunda 1 mL enzimatik ayrışma reaktifi (950 μL kollajenaz / dispaz çözeltisi ve 50 μL FBS) kullanarak doku parçalarını sindirin.
- Ek olarak, numuneler tek hücreli RNA dizilimi için hazırlanmışsa, ayrışma reaktifine 5 μL RNaz inhibitörü (stok çözeltisinde 40 U / μL) ekleyin.
NOT: Kollajenaz/dispaz karışımının nihai konsantrasyonu, 0.1 U/mL'de kollajenaz ve 0.8 U/mL'de dispas dahil olmak üzere 1 mg/mL'dir.
- Ek olarak, numuneler tek hücreli RNA dizilimi için hazırlanmışsa, ayrışma reaktifine 5 μL RNaz inhibitörü (stok çözeltisinde 40 U / μL) ekleyin.
- 30-60 dakikalık su banyosu sırasında tüpü 5 dakikalık aralıklarla manuel olarak ters çevirin.
NOT: Tam inkübasyon süresi kullanılan dokulara göre değişir. Hiçbir toplu doku görülmeyene kadar mikroskop altında ayrışmanın ilerlemesini kontrol edin. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini pipetli bir cam slayt üzerine yerleştirin ve mikroskop altında inceleyin. Hücreler tamamen ayrışmamışsa sindirim süresini artırın. - Tüpleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da döndürün ve geniş delikli uçlar kullanarak enzimatik hücre ayrışma reaktifini yavaşça çıkarın. 1 mL buz gibi soğuk %0,08 BSA-DPBS ekleyin ve 1 dakika boyunca geniş delikli bir cam pipet kullanarak hücreleri nazikçe yukarı ve aşağı pipetin.
- Bu adımı iki kez yineleyin.
NOT: Yukarı ve aşağı pipetleme, hücre bozulmasını önlemek için geniş delikli ve düşük retansiyonlu uçlar kullanılarak dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
- Bu adımı iki kez yineleyin.
- %0,08 BSA-DPBS ile 40 μm'lik bir hücre süzgecini önceden ıslatın ve 50 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin. Hücre süspansiyonunu süzgeçten geçirin. Ek 200 μL DPBS ile dokunup durulayın ve süspansiyonu tüpün altında toplayın.
- Süspansiyonu 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. 5 μL DNaz I (1 U / μL) ekleyin ve 15-20 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj.
- Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 400 μL buz gibi soğuk DPBS'de (Ca 2 + / Mg2 + içermez) yeniden askıya alın. Hücreleri karıştırmak için geniş delikli uçlarla yavaşça yukarı ve aşağı pipet yapın. Bu adımı iki kez yineleyin.
5. Boyama ve mikroskobik inceleme
- Boyama için, hücre süspansiyonunu 1: 1 oranında% 0.4 tripan mavisi çözelti ile karıştırın. Oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.
- Karışımın 5-10 μL'sini bir hemositometreye ekleyin ve mikroskop altında inceleyin.
NOT: Canlı hücreler lekelenmemiş sitoplazmaya sahipken, ölü hücreler mavi bir sitoplazmaya sahip olacaktır (Şekil 2). - Mikroskop altında üç farklı alandaki canlı ve ölü hücreleri sayın. Canlı hücrelerin sayısını bir alandaki toplam hücre sayısına bölerek hücre canlılık yüzdesini hesaplayın.
NOT: Hücre canlılığı% 85'ten fazla olmalı ve hücre konsantrasyonu 1 x 105-1 x 107 / mL'den az olmamalıdır. Hücre süspansiyonu arka planı, kümeler, parçalar veya safsızlıklar olmadan temiz olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, tek hücreli dizileme için Nil tilapia bağırsağının yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonunun hazırlanmasını açıklar (Şekil 1). Bu araştırma, kollajenaz / dispaz karışımının iyi bir ayrışma etkisine sahip olduğunu ve bağırsak dokusu için hafif olduğunu göstermektedir. Optimal sindirim enziminin seçimi, yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için gereklidir. Ön çalışmada, yaygın olarak kullanılan birkaç enzimin ayrışma verimlilikleri karşılaştırılmış ve sonuçlar Tablo 1'de listelenmiştir. Kollajenaz / dispaz karışımının, tek başına kollajenaz, dispaz veya tripsin ve liberaz, tripsin / elastaz, kollajenaz / elastaz ve kollajenaz / tripsin dahil olmak üzere diğer birçok enzim karışımından çok daha iyi bir ayrışma etkisine sahip olduğu doğrulanmıştır. Dahası, kollajenaz / dispaz da deneyin sonunda en uygun hücreleri verdi.
Kuluçka süresi boyunca, ayrışmanın ilerlemesi mikroskop altında kontrol edildi. 30 dakika sonra toplu doku neredeyse gitmişti ve genellikle 45 dakika sonra toplu doku görülmedi. Sindirimden sonra, hücre süspansiyonu süzgeçten kolayca süzülür. Bu protokolü takiben, tripan mavisi boyama ve mikroskobik inceleme, bağırsak hücrelerinin yüksek hücre canlılığına sahip olduğunu gösterdi (% 90'dan fazla; Şekil 2 ve hücre konsantrasyonunun 1 x 107 / mL'ye kadar olabileceği. Hücreler tek hücreler olarak dağıldı. Çoğu hücre parlak ve beyazdı (canlı hücreler), oysa sadece birkaçı koyu veya maviydi (ölü hücreler). Ölü hücreler, geçirgen hücre zarı nedeniyle koyu maviye boyanır. Hücre canlılığı ve hücre konsantrasyonu, tek hücreli dizilemenin gereksinimlerini karşıladı.
Şekil 1: Nil tilapia bağırsak ayrışması ve tek hücreli süspansiyon hazırlama protokollerinin özet akış diyagramı. Reaktifler bağırsak eksizyonundan önce hazırlanır (bölüm 1-2). Bağırsaklar kıyılır ve PBS'de santrifüjlü olarak yıkanır (adım 4.1-4.4). Doku parçaları, hücreleri izole etmek için 37 ° C'lik bir su banyosunda kollajenaz / dispaz çözeltisi kullanılarak sindirilir (adım 4.5-4.6). Sindirilmiş hücre süspansiyonu% 0.08 BAS-DPBS ile durulanır ve 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzülür (adım 4.7-4.8). DNaz I inkübasyonundan sonra, hücre peleti DPBS'de yeniden askıya alınır (adım 4.9-4.10). Tripan mavisi boyama hücre konsantrasyonunu ve canlılığını belirler (bölüm 5). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Nil tilapia bağırsak dokusundan hazırlanan ve tripan mavisi ile boyanmış tek hücreli süspansiyonun mikroskobik incelemesi. Canlı hücreler beyaz ve parlaktır, oysa ölü hücreler koyu ve mavidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Enzim | En iyi çalışma konsantrasyonu (mg/mL) | Ayrışma etkisi |
| Kollajenaz II | 1 | +++ |
| Dispase | 0.25 | ++ |
| Tripsin | 2.5 | ++ |
| Arjantin | 1 | +++ |
| *Kollajenaz/dispaz | 1 | +++++ |
| Kollajenaz II/elastaz | 1/1 | +++ |
| Tripsin/elastaz | 2.5/0.5 | +++ |
| Tripsin/kollajenaz II | 1/1 | +++ |
Tablo 1: Nil tilapia bağırsağı için yaygın olarak kullanılan sindirim enzimlerinin ayrışma etkilerinin karşılaştırılması sonuçları. Daha fazla "+" sembolü, daha yüksek bir ayrışma derecesini ve daha yüksek hücre canlılığını temsil eder. "*" ile etiketlenmiş enzim ticari bir üründür ve 1 mg / mL en iyi çalışma çözeltisi 0.1 U / mL kollajenaz I ve 0.8 U / mL dispoz içerir. Diğer enzim karışımları, araştırmacılar tarafından kullanıldıklarında karıştırıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, Nil tilapia bağırsağının yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonunun hazırlanmasını açıklar. Ayrışmadan önce, özellikle çok yağlı etçil balık bağırsakları için yağ ve mezenterin bağırsaktan çıkarılması gereklidir. Bağırsak içeriğini yıkamak için sert kazıma yerine bir şırınga kullanmak, hücrelere verilen mekanik hasarı azaltır. Hücre canlılığını sağlamak için, doku diseksiyonu ve durulama adımları için sıcaklığın 20 ° C veya altında tutulması da önemlidir. Yıkama çözeltileri buz üzerinde soğutulur ve santrifüj sıcaklığı önceden 4 ° C'ye ayarlanır. En önemlisi, çalışılan doku için hafif ve etkili hücre ayrışma enzimleri seçilmelidir. Önceki bir çalışmaya dayanarak, kollajenaz / dispaz karışımı Nil tilapia bağırsağı için en uygunudur. Bu enzim kombinasyonu daha hafiftir ve tilapia bağırsağı üzerinde tek başına tripsin, dispaz veya kollajenazdan daha etkilidir. Ek olarak, sindirim sırasında hücre canlılığını korumak için ayrışma reaktifine% 5 FBS dahil edildi39. Tam inkübasyon süresi kullanılan dokulara göre değişir. Doku tamamen ayrışmamışsa sindirim süresinin arttırılması gerekir. Ek olarak, kollajenaz / dispaz çalışması için Ca2 + gerektirir. Bu nedenle, PBS, Ca2 + / Mg2 + 'dan arındırılmış DPBS yerine enzimi seyreltmek için kullanılır. Yıkama çözeltileri için, bu iyonların çıkış yönündeki sıralama adımlarını etkilemesi durumunda DPBS kullanılır.
Kollajenaz / dispaz dahil olmak üzere çoğu ayrışma enzimi, genellikle 37 ° C olan optimum sıcaklıklarında maksimum hız ve verimlilikle çalışır. Bu sıcaklıkta, genler transkribe edilir ve ekspresyon seviyeleri40,41'in işlenmesine yanıt olarak değişir. Bu fenomen memelilerde ve zebra balıklarında yapılan çeşitli çalışmalarda bildirilmiştir. Fare böbreğinde, JUN-B, FOS ve Hsp90 dahil olmak üzere apoptoz ve stresle ilişkili genler, farklı enzimatik ayrışma koşulları altında farklı şekilde eksprese edilir40. Hemen erken genlerin ve HSP genlerinin diferansiyel ekspresyonu, zebra balığı yüzgeci hücrelerinde farklı ayrışma koşullarında değişir41. FOS ve JUN ailelerinin birden fazla üyesi de dahil olmak üzere erken yanıt genlerinin, memeli dokularının enzimatik ayrışması ile hazırlanan hücre süspansiyonlarında 37 ° C'de sadece birkaç dakikalık ayrılmadan sonra önemli ölçüde yukarı regüle edildiği gösterilmiştir6. Bu nedenle, apoptoz ve stresle ilişkili genlerdeki ekspresyon değişiklikleri, ScRNA-seq verileri için dikkatlice düşünülmelidir. Bu dezavantaj, ScRNA-seq deneyleri için uygun kontroller kullanılarak aşılabilir. Kontrollerden biri aynı ayrışma koşulları altında tedavi edilmelidir, böylece gen ekspresyonundaki artefakt değişiklikleri tespit edilebilir veya önlenebilir.
Bu protokolde, BSA öncelikle hücre kayıplarını ve hücre kümelenmesini en aza indirmek için DPBS'ye eklenir. BSA'nın %0,04 ila %1 arasındaki oranları, olumsuz etkileri olmadan tek hücreli dizileme süspansiyonları hazırlamak için kullanılabilir38. Doğru BSA oranını kullanmak hücre agregasyonunu azaltacaktır. Farklı dokular ve hücre kümelenme koşulları için uygun oran optimize edilmelidir. Bu protokolde% 0.08 BSA, Nil tilapia bağırsak hücresi bağlanmasını engelledi. Bununla birlikte, Ca 2 + / Mg2 + 'nın aşağı akış uygulamaları üzerindeki etkisini önlemek için son hücre yeniden süspansiyonu BSA içermemelidir.
Hücre agregasyonunu azaltmak için bir başka önlem de DNaz I'in eklenmesidir Rüptüre olmuş veya ölmekte olan hücreler, hücre kümelenmesinin başlıca nedenleri arasında yer alan "yapışkan" DNA moleküllerini serbest bırakır. DNaz, serbest DNA'yı bozar ve böylece hücre kümelenmesini en aza indirir. Bu nedenle, tek hücreli dizileme42,43 için hücre süspansiyonu hazırlığında yaygın olarak kullanılır. Ek olarak, geniş delikli cam pipetler veya uçlar kullanılarak yapılan nazik pipetleme, hücre hasarını azaltmaya yardımcı olur. Özellikle tek hücreli RNA-seq için, makas, tüp, cam pipet ve hücre süzgeçleri gibi aletler RNaz içermemelidir.
Her şeyden önce, yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanmasının tüm süreci, uygun ayrışma enzimi ile yapılmalı, düşük bir sıcaklıkta nazikçe ve hızlı bir şekilde yapılmalı ve yüksek hücre canlılığı ve konsantrasyonu ve nükleik asit bütünlüğü elde etmek için hücrelerin toplanmasını önlemek için önlemler içermelidir. Bu protokol, küçük değişikliklerle diğer balık türleri için bağırsak tek hücreli süspansiyonlarının hazırlanmasında da kullanılabilir. Ek olarak, bu protokol aynı zamanda hücre kültürü ve akış sitometrisi gibi tek hücreli dizileme ve tek hücre düzeyinde çalışmalar için diğer balık dokuları için hücre ayrışma protokolleri geliştirmek için değerli bir referans sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Çin'in Hainan İl Doğa Bilimleri Vakfı'nın (NO. 320QN211) ve Çin'in Sucul Hayvan Hastalıkları Kontrolü ve Sağlıklı Kültürü Guangdong İl Anahtar Laboratuvarı Araştırma Fonu Programı'nın desteğini kabul etmek istiyor (NO. PBEA2021ZD01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
| 40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C. |
| Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
| Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
| Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
| Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
| Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
| RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
| Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
| Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
| Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
References
- Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).
- He, H., et al. Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Wen, L., Tang, F. C. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).
- Xu, R., et al. Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).
- Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
- Andrews, T. S., Hemberg, M. Identifying cell populations with scRNASeq. Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).
- Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Kumar, R., et al. Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus. FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).
- Schnell, S., et al. Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia. Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).
- Xu, S. H., Cooke, I. M.
- Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
- Pan, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia. Scientific Reports. 12, 10144 (2022).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36 (2010).
- Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells. International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).
- Vrtačnik, P., Kos, Š, Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn's colitis model. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).
- Chung, M. I., et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins. Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
- Glass, L. L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine. Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).
- Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
- Gu, W., et al. Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines. Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).
- Yang, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice. Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).
- Howard, R. B., et al. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).
- Pezoldt, J., et al. Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection. Communications Biology. 4 (1), 1355 (2021).
- Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Barriga, F. M., et al. Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
- Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17 (1), 30 (2016).
- Chen, L., et al. Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver. Science of the Total Environment. 821, 152961 (2022).
- FAO. The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , Rome, Italy. (2022).
- Beck, B. H., Peatman, E. Mucosal Health in Aquaculture. , Academic Press. Cambridge, MA. (2015).
- Leelatian, N., et al. A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).
- Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 1 (3), 100144 (2020).
- Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae. MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Avey, D., et al. Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia. Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).
- Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
