Summary
Her beskriver vi en protokol til implementering af mild anæstesi og akupunkturbehandling på en kronisk hypoxi musemodel og gennemførelse af adfærdstest for at vurdere de kognitive ændringer efter behandlingen.
Abstract
Behandlingen af centralnervesygdomme har konsekvent udgjort betydelige udfordringer for det medicinske område. Akupunktur, en ikke-farmakologisk praksis forankret i traditionel kinesisk medicin, indebærer indsættelse af fine nåle i præcise punkter på kroppen og er almindeligt anvendt til styring af forskellige forhold. For nylig har akupunktur vist sig som en lovende terapeutisk intervention for en række neurologiske sygdomme, herunder angst og luftvejslidelser. Imidlertid er potentialet for akupunktur til behandling af kognitiv dysfunktion induceret af kronisk hypoxi endnu ikke blevet undersøgt. Dette papir præsenterer en omfattende protokol til etablering af en musemodel af kronisk hypoxi-induceret kognitiv svækkelse, administration af mild anæstesi, udførelse af akupunkturbehandling og vurdering af adfærdsændringer og hukommelsesevner ved hjælp af åbne felttest og vandlabyrinter. Den trinvise protokol giver detaljerede instruktioner om nøjagtig lokalisering og positionering af akupunkter og nåle til kognitiv forbedring. Ved at anvende denne protokol kan forskere gennemføre systematiske undersøgelser for grundigt at evaluere akupunkturens terapeutiske potentiale for kognitiv dysfunktion.
Introduction
Den globale befolkning står i øjeblikket over for et kritisk aldringsproblem, hvilket resulterer i en hurtig stigning i forekomsten af kognitive lidelser. Den verdensomspændende forekomst af kognitiv svækkelse er ca. 53,97 pr. 1000 personår1. Kronisk cerebral hypoxi forårsaget af vaskulær dysfunktion eller kredsløbs-/luftvejslidelser er fortsat en af de største risikofaktorer for aldersrelateret demens2. Tidligere undersøgelser har vist, at cerebral hypoxi kan øge amyloid-β aflejring ved at ændre BACE1-ekspression3. Derudover har hypoxi været forbundet med gliacelledysregulering og neuroinflammation 4,5. På trods af det voksende omfang af dette problem mangler der i øjeblikket effektive vestlige lægemidler til forebyggelse af kronisk hypoxi-induceret kognitiv tilbagegang. Ikke-farmakologisk traditionel kinesisk medicin, især akupunktur, er blevet brugt i tusinder af år til behandling af kognitive lidelser og har vist lovende resultater til lindring af neurodegenerative sygdomme 6,7. Baihui, Shent og Zusanli akupunkter er effektive punkter til behandling af kognitiv dysfunktion 8,9. Kliniske undersøgelser har vist, at elektroakupunkturbehandling signifikant forbedrer Montreal Cognitive Assessment (MoCA) og Mini-Mental State Examination (MMSE) score hos patienter med vaskulær kognitiv svækkelse og effektivt forbedrer kognitiv dysfunktion8. Selvom undersøgelser har antydet, at akupunktur kan forbedre hukommelsen hos rotter med arteriel ligering - en akut cerebral hypoxi modeller10, en akut cerebral hypoxi model, er der ingen rapport om virkningerne af akupunktur i nogen gnavermodel med kronisk hypoxi-induceret kognitive lidelser. Manglen på forskning i mekanismen har i betydelig grad hæmmet dens kliniske anvendelse.
Tidligere forskning har vist, at udsættelse af rotter for et hypoxisk miljø i en periode på 8 uger kan øge niveauet af oxidativt stress og betændelse i hjernen, hvilket resulterer i et fald i hukommelsesfunktionen11. Denne undersøgelse har til formål at undersøge virkningen af akupunktur på gnavermodeller for at fremme vores forståelse. Det er dog værd at bemærke, at anæstesi typisk kræves under akupunkturbehandling hos gnavere på grund af potentialet for agitation under gentagen stimulering. Langvarig anæstesi kan påvirke kognitiv funktion hos mus betydeligt, da de fleste bedøvelsesmidler kan undertrykke neural aktivitet og hindre informationsbehandling, hvilket fører til adfærdsmæssige underskud12. Flere undersøgelser har vist, at administration af 2,5% sevofluran i en varighed på 6 timer især kan forringe rumlig hukommelse, indlæringsevne og opmærksomhed hos mus13. Desuden tyder beviser på, at høje doser anæstesi kan resultere i neuronal død eller nerveskade hos mus14. Derfor er det bydende nødvendigt at identificere en passende tilgang til at minimere den samlede mængde anæstesi, der anvendes. I denne undersøgelse introducerer vi en effektiv akupunkturmetode til behandling af mus med kognitiv svækkelse sammen med adfærdstest for at vurdere deres hukommelsesevner. Det er vigtigt, at vi præsenterer en modificeret anæstesiteknik til forbehandling, der effektivt kan reducere den samlede dosis anæstesi administreret under eksperimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøgene blev udført med godkendelse fra Udvalget for Dyreforskning og Etik ved Hebei Yiling Medical Research Institute (godkendelsesnummer: N2022148). C57BL/6J-hanmus, der vejer 18-22 g (se materialetabel), blev anbragt i det nye lægemiddelevalueringscenter ved Hebei Yiling Medical Research Institute. De blev forsynet med normal mad og rent vand og udsat for kunstigt lys i 12 timer dagligt. Lokalerne opretholdt et kontrolleret temperaturområde på 20-26 °C og en relativ luftfugtighed på 40-70%.
1. Etablering af en model for mus med kronisk hypoxi (figur 1)
- Inden forsøget påbegyndes, skal dyrebure fremstilles under normalt atmosfærisk tryk og bure med et kontinuerligt iltfattigt miljø. Etabler et kontinuerligt miljø med lavt iltindhold ved at bruge et automatiseret gaskontrolleveringssystem til at skylle kammeret med en blanding af rent ilt og nitrogen.
BEMÆRK: Dette system er programmeret til at styre den elektromagnetiske ventilkontakt og derved sikre præcis levering af gas med hensyn til både tid og koncentration. - Opdel mus tilfældigt i tre grupper: en kontrolgruppe (Con), en modelgruppe (CH) og en elektroakupunkturgruppe (EA + CH). Placer kontrol- og model-/elektroakupunkturmus separat i de to bure med 10 mus pr. bur. Hold lyscyklussen på 12 t/12 timer (lys/mørk).
BEMÆRK: Ingen behandling eller hypoxi induceres i kontrolgruppen (Con). Modelgruppen (CH) består af mus med kronisk hypoxi. Elektroakupunkturgruppen (EA + CH) omfatter hypoxi-inducerede mus behandlet med elektroakupunktur. - For at udvikle kronisk hypoxi skal du etablere parametrene for kammeret med lavt iltindhold ved at bruge en digital iltmåler til at regulere gasstrømningshastigheden og opretholde en iltkoncentration på 10%. Placer dyrene i kammeret med lavt iltindhold kl. 9:00 og fjern dem kl. 17:00, hvilket resulterer i i alt 8 timers uafbrudt eksponering for lavt iltindhold om dagen i 3 måneder.
BEMÆRK: Ved opsætning af levering af nitrogengas for at reducere iltkoncentrationen anbefales det at gå langsomt frem for at forhindre overdreven introduktion af nitrogengas på én gang, da det vil føre til dyredødsfald. - Evaluer den kroniske hypoxi-inducerede kognitive dysfunktionsmodel ved hjælp af histologiundersøgelse og adfærdstest: den åbne felttest15 og vandlabyrinttesten16.
2. Anæstesi (figur 2)
- Forbered bedøvelsesmaskinen til små dyr (se materialetabellen) og varmepuden med konstant temperatur.
BEMÆRK: Under anæstesi er dyr modtagelige for hypotermi, hvilket understreger nødvendigheden af at anvende en varmepude med konstant temperatur til isolering. - Placer musen i anæstesiinduktionsboksen og inducer hurtigt med 2% -2,5% isofluran i ilt (se materialetabel) i ca. 1 min.
BEMÆRK: Denne kortsigtede forbehandling er et afgørende skridt for at sikre, at mus kan trives under lav koncentrationsdosis i længere tid. - Når deres ophidselse faldt, skal du klemme musens tå for at kontrollere dens refleks. Overfør derefter musen til varmepuden med konstant temperatur (37 °C).
- Juster anæstesistrømningshastigheden til ca. 0,5% koncentration. Tilslut anæstesimaskinen til musens mund og næse. Fortsæt med elektroakupunkturbehandling, samtidig med at vedligeholdelsen af anæstesi sikres.
BEMÆRK: Effekten af anæstesi blev bekræftet, da musene holdt op med at blinke. Effekten af anæstesi kan vare i mindst 30 min.
3. Elektroakupunktur behandling
- For effektivt at forbedre kognitiv dysfunktion skal du vælge specifikke akupunkter, såsom Baihui (GV20), Shenting (GV24) og bilateral Zusanli (ST36), baseret på traditionel kinesisk medicinteori og klinisk erfaring (figur 3). Administrer elektroakupunkturbehandling 2 uger før afslutningen af modelleringsprocessen.
- Find GV20-akupunktet på pandens midterlinje i midten af en linje, der forbinder ørens spidser7. Dybden af akupunkturnålens indsættelse skal være 2 mm.
- Placer GV24 akupunktet 1,3 mm direkte over midtpunktet af musens øjne på midten af panden17. Dybden af akupunkturnålens indsættelse skal være 2 mm.
- Placer ST36 akupunktet på ydersiden af knæleddet, ca. 2 mm under hovedet på fibula18,19. Dybden af akupunkturnålindsættelse skal være 3-4 mm.
- Forbered engangsakupunkturnåle (se materialetabel) og en elektroakupunkturanordning (se materialetabel) til proceduren (figur 4).
- Placer musen i den udsatte position under mild anæstesi med 0,5% isofluran, og sørg for, at deres hoveder og lemmer er immobiliseret. Hold en nål i rustfrit stål (diameter: 0,18 mm; længde: 7 mm) med højre hånd ved hjælp af tommelfinger, pegefinger og langfinger.
- Udfør akupunktur ved GV20 og GV24 akupunkter på tværs for 2 mm dybde, løft huden på musens hoved med venstre hånd. Punktering ST36 acupoint lodret i 3-4 mm dybde ved at røre ved det fibulære hoved på den laterale side af musens knæled og trykke på huden med venstre tommelfinger.
BEMÆRK: For akupunkterne placeret på hovedet anbefales det at indsætte nålene i sekvensen af GV24 efterfulgt af GV20. Denne ordre letter operationel bekvemmelighed. Akupunkturpunkter er diskrete anatomiske placeringer snarere end stationære punkter. Derfor har små afvigelser i nålestiksvinklen ingen effekt på den terapeutiske effektivitet, som ligeledes ses hos patienter, der får elektroakupunkturbehandling i kliniske omgivelser. - Tilslut den elektroniske akupunkturenhed til nålene med GV20 og venstre ST36 tilsluttet et elektrodesæt og GV24 og højre ST36 forbundet til et andet (figur 4). Vælg den kontinuerlige bølgetilstand med en elektrisk strømintensitet på 2 mA og en frekvens på 2 Hz 20,21. Bekræft den ideelle behandling ved at observere lokale milde rystelser ved akupunkter og stille tolerance ved musen.
- Når du tilslutter det elektriske akupunkturinstrument, skal du tilslutte den proksimale ende af nålen. Dette hjælper med at minimere påvirkningen forårsaget af forbindelsesledningens vægt og forbedrer dermed forebyggelsen af nålefrigørelse. Brug om nødvendigt tape til at fastgøre den vandret indsatte nål og forbindelsesledningen.
- Administrer den daglige behandling i 30 minutter hver dag i 6 på hinanden følgende dage med en enkelt hviledag mellem hver behandlingscyklus.
4. Åben felttest (figur 5)
BEMÆRK: Den åbne felttest er en konventionel metode, der bruges til at vurdere forsøgsdyrs autonome adfærd, udforskende adfærd, kognitive evner og angstadfærd i nye og ukendte miljøer22. Den består af en reaktionsboks med åbent felt og en registreringsanordning.
- For at udføre testen skal du forberede en hvidvægget terning, der måler 50 cm × 50 cm × 30 cm, med bunden opdelt i 25 lige store firkanter, der måler 10 cm × 10 cm.
- Placer musen i reaktionsboksen med åbent felt til akklimatisering. Lad musen udforske testrummet og gøre sig bekendt med det nye miljø i akklimatiseringsperioden. Udfør den åbne felttest efter akklimatisering af musen til forsøgsmiljøet i 1 time.
BEMÆRK: Dette garanterer minimering af angst eller stress induceret af ændringer i miljøet, hvilket muliggør mere præcise resultater under de efterfølgende adfærdsmæssige vurderinger. - Placer musen i midten af kassen og overvåg den i 10 minutter efter at have ladet musen tilpasse sig omgivelserne i 2 min.
- Brug et videosporingssystem (se materialetabellen) til at registrere musens bevægelsesbane, den samlede tilbagelagte afstand, tid brugt i det centrale område, hastigheden for at krydse det centrale område og antallet af indgange til det centrale område under testen.
- Udfør de relevante handlinger som beskrevet i produktmanualen til videosporingssystemet. Hver mus gennemgår en enkelt test og begynder at udforske fra samme sted i kassen.
- Efter hver test skal du rengøre den åbne feltboks med 75% ethanol for at forhindre falske resultater forårsaget af lugtinterferens, når du bruger en mus.
5. Vandlabyrint (figur 5)
BEMÆRK: Vandlabyrinttesten anvendes ofte som et adfærdsvurderingsværktøj i eksperimenter, der involverer mus for at evaluere deres rumlige indlærings- og hukommelsesevner23.
- Forbered en cirkulær vandtank med en diameter på 120 cm og en dybde på 30 cm. Opdel tanken i fire lige kvadranter: I, II, III og IV. Hvis du bruger sorte mus i eksperimentet, skal du bruge en hvidvandstank; For hvide mus skal du bruge en sort vandtank.
- Placer gardiner omkring den cirkulære vandtank for at forhindre musen i at se forskerne under testen.
- Placer forskellige markører på vandtankens øverste overflade som visuelle tegn til rumlig orientering. Sørg for, at disse markører forbliver stationære under hele eksperimentet for at opretholde konsistens.
- Placer en cirkulær platform med en diameter på 10 cm i kvadrant III af vandtanken som det udpegede målområde. Sørg for, at platformen let kan flyttes og sikres på ethvert ønsket sted.
- Under hele eksperimentet indføres vand i tanken, samtidig med at der opretholdes et temperaturområde på 22-24 ° C.
- Sørg for, at vandstanden forbliver konstant 1 cm over målplatformen. Inkluder en koncentration på 20% af ikke-giftigt titandioxid i vandet for at opnå en tydelig kontrast mellem de sorte mus og den hvide baggrund. Denne kontrast letter kameraets registrering af musens bevægelser og relevante parametre.
- Udfør en 5-dages kontinuerlig rumlig udforskningstest ved sekventielt at placere hver mus i kvadranterne I, II, III og IV.
- Placer musen mod væggen. Flyt væk fra labyrinten for at forhindre musen i at bruge eksperimentatorens position som referencepunkt. Optag den tid, musen tager at finde platformen.
- Hvis musen ikke kan finde undervandsplatformen inden for 90 s, skal du guide musen til platformen og give en 30-s læringsperiode. Derudover skal du registrere latenstiden som 90 s.
- Hvis musen lokaliserer undervandsplatformen inden for 90 s, skal du lade den forblive på platformen i 10 s for læring, før du fjerner den fra vandtanken.
- Tør musen med et håndklæde og returner det til buret.
- Drej placeringen af hver mus i hver kvadrant hvert 20. minut. Registrer hver mus' svømmeafstand, hastighed og den tid, det tager at finde platformen (latenstiden) ved hjælp af videosporingssystemet (se materialetabellen), og udfør de relevante handlinger som beskrevet i produktmanualen.
- Sæt platformen 1 cm over vandoverfladen på dag 1. Placer platformen i en dybde på 1 cm under vandoverfladen på dag 2-5.
- På dag 6 skal du fjerne platformen fra målkvadranten og udføre en rumlig udforskningstest.
- Placer musen i kvadrant I for at udforske frit i 90 sekunder. Computeren registrerer musens svømmebane, den tid, der bruges i målkvadranten, og antallet af gange, den krydser platformen.
BEMÆRK: For at minimere eksperimentelle fejl forårsaget af menneskelige faktorer er det vigtigt at holde referencepunktets position fast i vandlabyrintforsøget. Derudover skal eksperimentatoren straks trække sig tilbage efter at have placeret musen i vandet. Når forsøget er afsluttet, skal musene tørres med et håndklæde og placeres tilbage i deres bur for at opretholde varmen.
- Placer musen i kvadrant I for at udforske frit i 90 sekunder. Computeren registrerer musens svømmebane, den tid, der bruges i målkvadranten, og antallet af gange, den krydser platformen.
6. Hæmatoxylin og eosin (HE) farvning (figur 6)
BEMÆRK: Histologisk undersøgelse af hippocampusområdet hjælper med at vurdere etableringen af hypoxi-modellen og bestemme effekten af akupunkturbehandling.
- Efter adfærdseksperimentet bedøves musen med en intraperitoneal injektion på 20 mg / kg pentobarbitalnatrium og perfuseres med 10% paraformaldehydopløsning (se materialetabel) for at sikre fuldstændig kropsperfusion. Isoler hjernevævet og nedsænk det i 10% paraformaldehydopløsning ved stuetemperatur (RT) i 3 dage for at opnå fiksering.
- Placer hjerneprøverne i en indlejringsboks. Derefter vaskes de behandlede hjerneprøver med rindende vand i 6 timer.
- Anvend en automatiseret vævsprocessor til at dehydrere prøverne ved hjælp af en række alkoholopløsninger med stigende koncentrationer, nemlig 60% ethanol i 1 time, 70% ethanol i 1 time, 90% ethanol i 1 time, 95% ethanol i 2 timer og endelig 100% ethanol i 2 timer.
- Dyp vævsprøverne i xylen i 2 timer for at opnå gennemsigtighed. Efter afslutningen af tørringsprocessen overføres de permeabiliserede prøver derefter til paraffinvoks opvarmet til 60 °C i 3 timer. Endelig integrere dem i en automatisk processor.
- Brug en roterende skiver til at opnå 4 μm sektioner. Derefter udsættes sektionerne for hæmatopoxyninfarvning i en varighed fra 3-8 minutter efterfulgt af eosinfarvning i 1-3 minutter.
- Overfør de farvede sektioner sekventielt til separate beholdere med ren alkohol og xylen. Derefter forsegles og fastgøres de farvede sektioner med neutralt tyggegummi som forberedelse til patologisk undersøgelse under et optisk mikroskop.
- Brug en diasscanner (se Materialetabel) til at scanne udsnittene. Brug derefter visningssoftwaren til at opnå HE-farvningsresultaterne for hippocampusområdet. Sammenlign arrangementet af neuroner og kondensationen af neuronale kerner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering af musebevægelsesbaner i det åbne felteksperiment
Banekortet afslører, at mus i den normale gruppe udviser en dyb tilbøjelighed til udforskning i ukendte miljøer. Deres aktivitetsbaner er primært koncentreret i hjørnerne, mens de dækker hele det åbne felt (venstre panel). I modsætning hertil viser den langsigtede hypoxi-modelgruppe af mus et signifikant formindsket ønske om at udforske nye omgivelser. De dvæler overvejende i hjørnerne uden at udvise nogen udforskende adfærd mod midten af det åbne felt (midterpanel). Efter akupunkturbehandling viser den udforskende aktivitet hos hypoxi-inducerede mus forbedring, og deres adfærd med at vove sig mod midten af det åbne felt genindføres (højre panel) (figur 5A).
Karakterisering af rumlig læring og hukommelse hos mus
I den normale gruppe tilbragte mus relativt længere tid i målkvadranten og krydsede platformen oftere, som vist på banekortet (venstre panel). Den langsigtede hypoxiske modelgruppe af mus viste svækket rumlig hukommelseskapacitet sammenlignet med den normale gruppe, hvilket fremgår af deres manglende evne til at lokalisere målkvadranten inden for den angivne tid (midterste panel). Efter akupunkturbehandling viste musene signifikant forbedring i deres hypoxi-inducerede rumlige hukommelsesevner. De udviste mere organiseret udforskende adfærd og tilbragte mærkbart længere tid i målkvadranten (højre panel) (figur 5B).
Histologisk undersøgelse af musehjerne
I kontrolgruppen viste arrangementet af neuroner i hippocampusområdet hos mus (øverste venstre panel) regelmæssighed, mens det blev forstyrret i den langsigtede hypoxiske modelgruppe (øverste højre panel). Omvendt udviste behandlingsgruppen en forbedring i arrangementet af neuroner (nedre panel). Desuden viste modelgruppen forværret svind af museneuronale kerner sammenlignet med kontrolgruppen, men denne effekt blev delvist lindret i behandlingsgruppen. (Figur 6).
Figur 1: Etablering af en musemodel for hypoxi-induceret kognitiv svækkelse. Musene blev udsat for hypoxi fra dag 1 til dag 90. Elektrisk akupunkturbehandling blev administreret dagligt fra dag 75, hvor hver behandlingscyklus varede 6 dage og i alt 2 behandlingscyklusser. Der var en 1-dages pause mellem cyklusser. Adfærdstest blev udført på dag 93. Histologisk undersøgelse og adfærdstest kan udføres på dag 65 for at bekræfte etableringen af modellen i hippocampalområdet. Forkortelser: Man: måned. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Anæstesi forbehandling før elektroakupunktur. Før de gennemgik elektroakupunkturbehandling, blev musene bedøvet ved hjælp af en (A) anæstesianordning. Musene blev derefter anbragt i en (B) kammerkasse med (C) 2% isofluran i kammeret. (D) Varigheden af den modificerede anæstesimetode var kortere sammenlignet med den klassiske anæstesimetode. (E) Mus, der udsættes for mild anæstesi, bevarer deres reaktion på fodstimulering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Anatomisk struktur af akupunkturpunkter på musehovedet. Denne figur viser de anatomiske positioner af GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) og ST36 (Zusanli) hos mus. (A) Et anatomisk billede af musehovedet, der viser frontal- og parietalknoglerne. (B) Et anatomisk billede af musebenet, der viser skinnebenet, fibula og fibulært hoved. (C) Placering af akupunkturpunkter på musehovedet. (D) GV20 er placeret på pandens midterlinje, i midtpunktet mellem ørens spidser og direkte oven på parietalbenet. GV24 er placeret på pandens midterlinje, lige foran krydset mellem frontale og parietale knogler. ST36 er placeret på ydersiden af bagbenet, ca. 2 mm under det fibulære hoved. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Elektroakupunkturbehandling. Musene gennemgik nålestimulering på bestemte punkter på GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) og bilateral ST36 (Zusanli), mens de var under anæstesi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative resultater af den åbne felttest og vandlabyrinttest efter elektroakupunkturbehandling. (A) Den åbne felttest blev udført for at evaluere adfærdsændringer hos mus, der blev udsat for kronisk hypoxi (CH) og akupunktur (EA) behandling. Tre repræsentative baneplots blev genereret fra testen. (B) Vandlabyrinttesten blev udført for at evaluere den rumlige hukommelse hos mus, der blev udsat for kronisk hypoxi og akupunkturbehandling. Tre repræsentative baneplots blev genereret fra testen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Histologisk undersøgelse af musehjerne efter elektroakupunkturbehandling. Histologiske billeder af musene i kontrolgruppen (øverste venstre panel), hypoxigruppen (øverste højre panel) og behandlingsgruppen (nederste panel). Skalabjælker: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Akupunktur, en ikke-farmakologisk medicinsk praksis med oprindelse i Kina for over 2.000 år siden, involverer indsættelse af tynde nåle i bestemte punkter på kroppen kendt som akupunkturpunkter. Disse punkter menes at være forbundet med kanaler eller meridianer, hvorigennem kroppens vitale energi eller "qi" strømmer24. Ved at stimulere disse punkter har akupunktur til formål at genoprette balance og harmoni i kroppen. Det har vist sig effektivt at behandle forskellige tilstande, herunder kronisk smerte, angst / depression, fordøjelsesproblemer, menstruationskramper og luftvejslidelser 25,26,27,28,29. I de senere år har akupunktur vist sig som en effektiv terapeutisk intervention for neuronale sygdomme, herunder kognitiv dysfunktion. Flere undersøgelser har vist dets evne til at modulere neurotransmittere, øge cerebral blodgennemstrømning, reducere oxidativt stress og forbedre neuroplasticitet 20,30,31,32. Derfor anerkendes det i stigende grad som en sikker og effektiv behandlingsmulighed, især når den anvendes sammen med konventionel lægehjælp33. På trods af sin lange historie og udbredt anvendelse forbliver virkningsmekanismen for akupunktur imidlertid ufuldstændigt forstået. En teori foreslår, at akupunktur stimulerer frigivelsen af endorfiner, kroppens naturlige smertestillende midler, og derved lindrer smerter og fremmer en følelse af velvære34. En anden teori tyder på, at akupunktur kan påvirke det autonome nervesystem, som regulerer forskellige ufrivillige kropsfunktioner 35,36. Selvom vores forståelse af akupunkturens mekanismer stadig udvikler sig, er der en voksende anerkendelse blandt forskere, at en standardiseret laboratoriemetode til akupunktur, især ved hjælp af gnavermodeller, er afgørende for at styre forskningen på dette område.
Valget af en passende anæstesiprotokol er det første afgørende skridt i udførelsen af akupunktur i en musemodel. Traditionelle protokoller involverer ofte kontinuerlig højdosisbedøvelse, som kan have betydelige virkninger på musens nervesystem og kan resultere i falsk-negative adfærdsmæssige testresultater efter akupunkturbehandling. I denne undersøgelse foreslår vi en forbedret protokol, der bruger en forseglet anæstesiboks til gasbedøvelse af musene, indtil de mister bevidstheden. Derefter opretholdes en stabil tilstand ved hjælp af en lavdosis bedøvelse under akupunkturbehandlingen. Denne metode hjælper med at minimere funktionelle og adfærdsmæssige abnormiteter forårsaget af overdreven anæstesidosering og forbedrer nøjagtigheden af eksperimenterne. Derudover kan forskere vælge isofluran i stedet for ketamin og xylazin, da det giver hurtigere restitutionstid og reducerer de systemiske toksicitetsrisici forbundet med ketamin og xylazin37. Det er dog vigtigt at bemærke, at falske negative resultater forårsaget af anæstesi stadig kan forekomme. Selv mild anæstesi, der fortsætter i 2 på hinanden følgende uger, kan have en negativ indvirkning på kognition38. For mere præcist at evaluere effektiviteten af behandlingen kan forskere indarbejde en yderligere gruppe bedøvede mus, der ikke modtager nogen behandling til sammenligningsformål. Et andet kritisk aspekt af akupunkturbehandling hos mus er at bestemme kombinationen af akupunkter. Almindeligt anvendte akupunkter for sygdomme i centralnervesystemet hos mennesker omfatter Baihui (GV20), Yintang (EX-HN3), Shenting (GV24) og Zusanli (ST36) 39,40,41. I denne undersøgelse fokuserede vi på inkluderingen af Baihui (GV20), Shenting (GV24) og Zusanli (ST36) til behandlingen. På trods af udfordringerne ved musens lille størrelse i akupunktlokalisering viser fælles positionering baseret på anatomiske strukturer sig at være en effektiv metode. Endelig er bestemmelse af den passende stimuleringsfrekvens og intensitet et andet vigtigt skridt i udførelsen af akupunkturbehandling hos mus. I denne undersøgelse brugte vi lavfrekvent elektroakupunktur ved 2 Hz og en moderat intensitet på 2 mA. Selvom det terapeutiske resultat af akupunktur er tydeligt, er yderligere udforskning nødvendig for at forstå dens underliggende mekanisme.
På trods af de brede potentielle anvendelser af akupunktur til behandling af neurologiske lidelser har denne teknik visse begrænsninger. En begrænsning er dens store afhængighed af operatørens erfaring, hvilket kan resultere i suboptimale resultater eller skade på forsøgspersoner, når de udføres af uerfarne operatører. En anden begrænsning er behovet for forbedring i klinisk akupunkturbehandling for at øge dens effektivitet. I øjeblikket studerer forskere kombinationen af akupunktur med andre terapier, såsom farmakologiske interventioner og kognitiv træning, for at forbedre behandlingsresultaterne42. Derudover har teknologiske fremskridt ført til udvikling af nye teknikker, som transkraniel magnetisk stimulering (TMS), som kan bruges sammen med akupunktur for yderligere at forbedre kognitiv funktion43. På trods af disse begrænsninger har akupunktur vist betydelige fordele i behandlingen af forskellige neurologiske lidelser og har stort potentiale for fremtidige applikationer, især når de kombineres med andre terapier. Denne artikel indeholder detaljerede metoder til konstruktion af en musemodel af kronisk hypoxi-induceret kognitiv svækkelse, processen med akupunkturbehandling og adfærdsmæssige testmetoder. Disse metoder kan hjælpe forskere med at gennemføre grundige undersøgelser af akupunkturens anvendelse og mekanisme og derved fremme udviklingen af traditionel kinesisk medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af S &T Program of Hebei (NO.E2020100001 og NO.22372502D), High-level S &; T Innovation and Entrepreneurship Talent Project of Shijiazhuang (nr. 07202203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% paraformaldehyde solution | Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd | RL3234 | |
| ANY-maze | Science | SA201 | Video tracking system |
| C75BL/6J mice | BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD | No.110322220103041767 | Gender: Male, Weight: 18–22 g |
| Electroacupuncture device | Great Wall | KWD-808 I | |
| Hwato acupuncture needle | Suzhou Medical Appliance Factory | 2655519 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22 | |
| NanoZoomer Digital Pathology | Hamamatsu Photonics K. K | C9600-01 | |
| Small animal anesthesia machine | RWD | YL-LE-A106 |
References
- Pais, R., Ruano, L., Carvalho, O. P., Barros, H. Global cognitive impairment prevalence and incidence in community dwelling older adults- A systemic review. Geriatrics. 5 (4), Basel, Switzerland. 84 (2020).
- Tian, Z., Ji, X., Liu, J. Neuroinflammation in vascular cognitive impairment and dementia: Current evidence, advances, and prospects. International Journal of Molecular Sciences. 23 (11), 6224 (2022).
- Yuan, Y., et al. Activation of ERK-Drp1 signaling promotes hypoxia-induced Aβ accumulation by upregulating mitochondrial fission and BACE1 activity. FEBS open bio. 11 (10), 2740-2755 (2021).
- Zhu, X., et al. NLRP3 deficiency protects against hypobaric hypoxia induced neuroinflammation and cognitive dysfunction. Ecotoxicology and Environmental Safety. 255, 114828 (2023).
- Li, B., Dasgupta, C., Huang, L., Meng, X., Zhang, L. MiRNA-210 induces microglial activation and regulates microglia-mediated neuroinflammation in neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Cellular & Molecular Immunology. 17 (9), 976-991 (2020).
- Cai, M., Lee, J. H., Yang, E. J. Electro-acupuncture attenuates cognition impairment via anti-neuroinflammation in an Alzheimer's disease animal model. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 264 (2019).
- Xie, L., et al. Electro-acupuncture improves M2 microglia polarization and glia anti-inflammation of hippocampus in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 689629 (2021).
- Huang, L., et al. Effects of acupuncture on vascular cognitive impairment with no dementia: A randomized controlled trial. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 81 (4), 1391-1401 (2021).
- Xi, L., Fang, F., Yuan, H., Wang, D. Transcutaneous electrical acupoint stimulation for postoperative cognitive dysfunction in geriatric patients with gastrointestinal tumor: a randomized controlled trial. Trials. 22 (1), 563 (2021).
- Du, S. Q., et al. Acupuncture inhibits TXNIP-associated oxidative stress and inflammation to attenuate cognitive impairment in vascular dementia rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24 (1), 39-46 (2018).
- Zhang, C. E., et al. Hypoxia-induced tau phosphorylation and memory deficit in rats. Neuro-Degenerative Diseases. 14 (3), 107-116 (2014).
- Liang, X., Zhang, R. Effects of minocycline on cognitive impairment, hippocampal inflammatory response, and hippocampal Alzheimer's related proteins in aged rats after propofol anesthesia. Disease Markers. 2022, 4709019 (2022).
- Lee, J. R., et al. Effect of dexmedetomidine on sevoflurane-induced neurodegeneration in neonatal rats. British Journal of Anaesthesia. 126 (5), 1009-1021 (2021).
- Matsumoto, Y., Fujino, Y., Furue, H. Anesthesia and surgery induce a functional decrease in excitatory synaptic transmission in prefrontal cortex neurons, and intraoperative administration of dexmedetomidine does not elicit the synaptic dysfunction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 572, 27-34 (2021).
- Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The open field test for measuring locomotor activity and anxiety-like behavior. Methods in Molecular Biology. 1916, Clifton, N.J. 99-103 (2019).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2920 (2011).
- Lin, W., et al. TNEA therapy promotes the autophagic degradation of NLRP3 inflammasome in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease via TFEB/TFE3 activation. Journal of Neuroinflammation. 20 (1), 21 (2023).
- Liu, S., et al. A neuroanatomical basis for electro-acupuncture to drive the vagal-adrenal axis. Nature. 598 (7882), 641-645 (2021).
- Jang, J. H., et al. Acupuncture inhibits neuroinflammation and gut microbial dysbiosis in a mouse model of Parkinson's disease. Brain, Behavior, and Immunity. 89, 641-655 (2020).
- Dong, W., et al. Electro-acupuncture improves synaptic function in SAMP8 mice probably via inhibition of the AMPK/eEF2K/eEF2 signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2019, 8260815 (2019).
- Han, Y. G., et al. Electro-acupuncture prevents cognitive impairment induced by lipopolysaccharide via inhibition of oxidative stress and neuroinflammation. Neuroscience Letters. 683, 190-195 (2018).
- Zhang, Q., et al. Electro-acupuncture pre-treatment ameliorates anesthesia and surgery-induced cognitive dysfunction via inhibiting mitochondrial injury and neuroapoptosis in aged rats. Neurochemical Research. 47 (6), 1751-1764 (2022).
- Zheng, X., et al. Electro-acupuncture ameliorates beta-amyloid pathology and cognitive impairment in Alzheimer disease via a novel mechanism involving activation of TFEB (transcription factor EB). Autophagy. 17 (11), 3833-3847 (2021).
- Zhou, W., Benharash, P. Effects and mechanisms of acupuncture based on the principle of meridians. Journal of Acupuncture and Meridian Studies. 7 (4), 190-193 (2014).
- Sun, Y., et al. Efficacy of Acupuncture For Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome : A Randomized Trial. Annals of Internal Medicine. 174 (10), 1357-1366 (2021).
- Jung, J., et al. Lipidomics reveals that acupuncture modulates the lipid metabolism and inflammatory interaction in a mouse model of depression. Brain, Behavior, and Immunity. 94, 424-436 (2021).
- Yang, N. N., et al. Electro-acupuncture ameliorates intestinal inflammation by activating α7nAChR-mediated JAK2/STAT3 signaling pathway in postoperative ileus. Theranostics. 11 (9), 4078-4089 (2021).
- Shetty, G. B., Shetty, B., Mooventhan, A. Efficacy of acupuncture in the management of primary dysmenorrhea: A randomized controlled trial. Journal of Acupuncture and Meridian Studies. 11 (4), 153-158 (2018).
- Nurwati, I., Purwanto, B., Mudigdo, A., Saputra, K., Prasetyo, D. H., Muthmainah, M. Improvement in inflammation and airway remodelling after acupuncture at BL13 and ST36 in a mouse model of chronic asthma. Acupuncture in Medicine. 37 (4), 228-236 (2019).
- Li, P., et al. Acupuncture can play an antidepressant role by regulating the intestinal microbes and neurotransmitters in a rat model of depression. Medical Science Monitor. 27, 929027 (2021).
- Ding, N., Jiang, J., Xu, A., Tang, Y., Li, Z. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 13, 37 (2019).
- Yang, J. W., Wang, X. R., Ma, S. M., Yang, N. N., Li, Q. Q., Liu, C. Z. Acupuncture attenuates cognitive impairment, oxidative stress and NF-κB activation in cerebral multi-infarct rats. Acupuncture in Medicine. 37 (5), 283-291 (2019).
- Li, X., et al. Traditional Chinese acupoint massage, acupuncture, and moxibustion for people with diabetic gastroparesis: A systematic review and meta-analysis. Medicine. 101 (48), 32058 (2022).
- Yang, X. Y., et al. Effect of combined acupuncture-medicine anesthesia in thyroid nodule ablation and its effect on serum β-endorphin. Acupuncture Research. 45 (12), 1006-1009 (2020).
- Uchida, C., et al. Effects of Acupuncture Sensations on Transient Heart Rate Reduction and Autonomic Nervous System Function During Acupuncture Stimulation. Medical Acupuncture. 31 (3), 176-184 (2019).
- Liang, C., Wang, K. Y., Gong, M. R., Li, Q., Yu, Z., Xu, B. Electro-acupuncture at ST37 and ST25 induce different effects on colonic motility via the enteric nervous system by affecting excitatory and inhibitory neurons. Neurogastroenterology and Motility. 30 (7), 13318 (2018).
- Michelson, N. J., Kozai, T. Isoflurane and ketamine differentially influence spontaneous and evoked laminar electrophysiology in mouse V1. Journal of Neurophysiology. 120 (5), 2232-2245 (2018).
- Yu, X., Zhang, F., Shi, J. Sevoflurane anesthesia impairs metabotropic glutamate receptor-dependent long-term depression and cognitive functions in senile mice. Geriatrics & Gerontology International. 19 (4), 357-362 (2019).
- Jeong, J. H., et al. Investigation of combined treatment of acupuncture and neurofeedback for improving cognitive function in mild neurocognitive disorder: A randomized, assessor-blind, pilot study. Medicine. 100 (37), 27218 (2021).
- Lin, Y. K., Liao, H. Y., Watson, K., Yeh, T. P., Chen, I. H. Acupressure improves cognition and quality of life among older adults with cognitive disorders in long-term care settings: A clustered randomized controlled trial. Journal of the American Medical Directors Association. 24 (4), 548-554 (2023).
- Wu, W. Z., et al. Effect of Tongdu Tiaoshen acupuncture on serum GABA and CORT levels in patients with chronic insomnia. Chinese Acupuncture & Moxibustion. 41 (7), 721-724 (2021).
- Zhuo, P. Y., et al. Efficacy and safety of acupuncture combined with rehabilitation training for poststroke cognitive impairment: A systematic review and meta-analysis. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 32 (9), 107231 (2023).
- Li, R. Y., Huang, R. J., Yu, Q. Comparison of different physical therapies combined with acupuncture for poststroke cognitive impairment: A network meta-analysis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2021, 1101101 (2021).
