Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Akupunkturbehandling i en musemodell av kronisk hypoksi-indusert kognitiv dysfunksjon

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65784
Automatic Translation
*1, *2,3, 4, 5,6, 3,5, 4,7, 2,3, 8, 5,6
1Heilongjiang University of Chinese Medicine, 2Hebei Provincial Key Laboratory of Luobing, 3Key Laboratory of State Administration of TCM (Cardio-Cerebral Vessel Collateral Disease), 4Hebei University of Chinese Medicine, 5Shijiazhuang Compound Traditional Chinese Medicine Technology Innovation Center, 6National Key Laboratory of Luobing Research and Innovative Chinese Medicine, 7Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Ltd, 8The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en protokoll for implementering av mild anestesi og akupunkturbehandling på en kronisk hypoksimusemodell og gjennomføring av atferdstester for å vurdere kognitive endringer etter behandling.

Abstract

Behandlingen av sentralnervøse lidelser har konsekvent utgjort betydelige utfordringer for det medisinske feltet. Akupunktur, en ikke-farmakologisk praksis forankret i tradisjonell kinesisk medisin, innebærer innføring av fine nåler i presise punkter på kroppen og brukes ofte til behandling av ulike forhold. Nylig har akupunktur dukket opp som en lovende terapeutisk inngrep for en rekke nevrologiske sykdommer, inkludert angst og respiratoriske lidelser. Imidlertid har potensialet for akupunktur i behandling av kognitiv dysfunksjon indusert av kronisk hypoksi ennå ikke blitt utforsket. Dette papiret presenterer en omfattende protokoll for å etablere en musemodell av kronisk hypoksi-indusert kognitiv svekkelse, administrere mild anestesi, utføre akupunkturbehandling og vurdere atferdsendringer og minneevner ved hjelp av åpne felttester og vannlabyrinter. Den trinnvise protokollen gir detaljerte instruksjoner om nøyaktig lokalisering og posisjonering av akupunkter og nåler for kognitiv forbedring. Ved å bruke denne protokollen kan forskere gjennomføre systematiske studier for å grundig evaluere det terapeutiske potensialet for akupunktur for kognitiv dysfunksjon.

Introduction

Den globale befolkningen står for tiden overfor et kritisk aldringsproblem, noe som resulterer i en rask økning i forekomsten av kognitive forstyrrelser. Den globale forekomsten av kognitiv svikt er ca. 53,97 per 1000 personår1. Kronisk cerebral hypoksi forårsaket av vaskulær dysfunksjon eller sirkulasjons-/luftveissykdommer er fortsatt en av de viktigste risikofaktorene for aldersrelatert demens2. Tidligere studier har vist at cerebral hypoksi kan øke amyloid-β-avsetning ved å modifisere BACE1-uttrykk3. I tillegg har hypoksi vært assosiert med glialcelledysregulering og nevroinflammasjon 4,5. Til tross for det økende omfanget av dette problemet, mangler effektive vestlige medisiner for å forhindre kronisk hypoksi-indusert kognitiv tilbakegang. Ikke-farmakologisk tradisjonell kinesisk medisin, spesielt akupunktur, har blitt brukt i tusenvis av år for å behandle kognitive forstyrrelser og har vist lovende resultater i å lindre nevrodegenerative sykdommer 6,7. Baihui, Shenter og Zusanli acupoints er effektive punkter for behandling av kognitiv dysfunksjon 8,9. Kliniske studier har vist at elektroakupunkturbehandling signifikant forbedrer Montreal Cognitive Assessment (MoCA) og Mini-Mental State Examination (MMSE) score hos pasienter med vaskulær kognitiv svekkelse og effektivt forbedrer kognitiv dysfunksjon8. Selv om studier har antydet at akupunktur kan forbedre hukommelsesevnen til rotter med arteriell ligering - en akutt cerebral hypoksi modell10, en akutt cerebral hypoksimodell, er det ingen rapport om effekten av akupunktur i noen gnagermodell med kroniske hypoksi-induserte kognitive forstyrrelser. Mangelen på forskning på mekanismen har betydelig hindret dens kliniske anvendelse.

Tidligere forskning har vist at å utsette rotter for et hypoksisk miljø i en periode på 8 uker kan øke nivåene av oksidativt stress og betennelse i hjernen betydelig, noe som resulterer i en nedgang i minnefunksjonen11. Denne studien tar sikte på å undersøke effekten av akupunktur på gnagermodeller for å fremme vår forståelse. Det er imidlertid verdt å merke seg at anestesi vanligvis er nødvendig under akupunkturbehandling hos gnagere på grunn av potensialet for agitasjon under gjentatt stimulering. Langvarig anestesi kan påvirke kognitiv funksjon betydelig hos mus, da de fleste bedøvelsesmidler kan undertrykke nevral aktivitet og hindre informasjonsbehandling, noe som fører til atferdsunderskudd12. Flere studier har vist at administrering av 2,5 % sevofluran i en varighet på 6 timer spesielt kan svekke romlig hukommelse, læringsevne og oppmerksomhet hos mus13. Videre tyder bevis på at høye doser anestesi kan føre til nevrondød eller nerveskade hos mus14. Derfor er det viktig å identifisere en egnet tilnærming for å minimere den totale mengden anestesi som brukes. I denne studien introduserer vi en effektiv akupunkturmetode for behandling av mus med kognitiv svekkelse, sammen med atferdstester for å vurdere deres minneevner. Det er viktig at vi presenterer en modifisert anestesiteknikk før behandling som effektivt kan redusere den totale dosen av anestesi administrert under forsøket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøkene ble utført med godkjenning av komiteen for dyreforskning og etikk ved Hebei Yiling Medical Research Institute (godkjenningsnummer: N2022148). Mannlige C57BL/6J-mus som veide 18-22 g (se materialfortegnelse) ble plassert i det nye legemiddelevalueringssenteret til Hebei Yiling Medical Research Institute. De ble forsynt med vanlig mat og rent vann og utsatt for kunstig lys i 12 timer daglig. Rommene opprettholdt et kontrollert temperaturområde på 20-26 °C og relativ fuktighet på 40%-70%.

1. Etablering av kronisk hypoksimusemodell (figur 1)

  1. Før forsøket påbegynnes, må du forberede dyrebur under normalt atmosfærisk trykk og bur med et kontinuerlig oksygenfattig miljø. Etablere et kontinuerlig miljø med lite oksygen ved å bruke et automatisert gasskontrollleveringssystem for å skylle kammeret med en blanding av rent oksygen og nitrogen.
    MERK: Dette systemet er programmert til å styre den elektromagnetiske ventilbryteren, og dermed sikre presis levering av gass både når det gjelder tid og konsentrasjon.
  2. Del musene tilfeldig inn i tre grupper: en kontrollgruppe (Con), en modellgruppe (CH) og en elektroakupunkturgruppe (EA + CH). Plasser kontroll- og modell-/elektroakupunkturmus separat i de to merdene, med 10 mus per merd. Hold lyssyklusen på 12 timer / 12 timer (lys / mørk).
    MERK: Ingen behandling eller hypoksi induseres i kontrollgruppen (Con). Modellgruppen (CH) består av mus med kronisk hypoksi. Elektroakupunkturgruppen (EA + CH) består av hypoksiinduserte mus behandlet med elektroakupunktur.
  3. For å utvikle kronisk hypoksi, etablere parametrene til lavoksygenkammeret ved å bruke en digital oksygenmåler for å regulere gasstrømningshastigheten og opprettholde en oksygenkonsentrasjon på 10%. Plasser dyrene i kammeret med lite oksygen kl. 09.00 og fjern dem kl. 17.00, noe som resulterer i totalt 8 timers uavbrutt eksponering for lavt oksygennivå per dag i 3 måneder.
    MERK: Når du setter opp levering av nitrogengass for å redusere oksygenkonsentrasjonen, anbefales det å fortsette sakte for å forhindre overdreven innføring av nitrogengass samtidig, da det vil føre til dyredødsfall.
  4. Evaluer den kroniske hypoksi-induserte kognitive dysfunksjonsmodellen ved hjelp av histologiundersøkelse og atferdstester: åpen felttest15 og vannlabyrinttest16.

2. Anestesi (figur 2)

  1. Forbered anestesimaskinen for små dyr (se materialtabell) og varmeputen med konstant temperatur.
    MERK: Under anestesi er dyr utsatt for hypotermi, noe som understreker nødvendigheten av å bruke en varmepute med konstant temperatur for isolasjon.
  2. Plasser musen i anestesiinduksjonsboksen og induser raskt med 2%-2,5% isofluran i oksygen (se Materialfortegnelse) i ca. 1 min.
    MERK: Denne kortsiktige forbehandlingen er et viktig skritt for å sikre at mus kan trives under lavkonsentrasjonsdosering i lengre tid.
  3. Når spenningen er redusert, klem musens tå for å sjekke refleksen. Overfør deretter musen til varmeputen med konstant temperatur (37 °C).
  4. Juster anestesistrømningshastigheten til ca. 0,5% konsentrasjon. Koble anestesimaskinen til musens munn og nese. Fortsett med elektroakupunkturbehandling samtidig som du sikrer vedlikehold av anestesi.
    MERK: Effekten av anestesi ble bekreftet da musene sluttet å blinke. Effekten av anestesi kan vare i minst 30 minutter.

3. Elektroakupunktur behandling

  1. For effektivt å forbedre kognitiv dysfunksjon, velg spesifikke akupunkter, som Baihui (GV20), Shenting (GV24) og bilateral Zusanli (ST36), basert på tradisjonell kinesisk medisinteori og klinisk erfaring (figur 3). Administrer elektroakupunkturbehandling 2 uker før ferdigstillelse av modelleringsprosessen.
    1. Finn GV20 acupoint på midtlinjen av pannen, midt på en linje som forbinder ørene7. Dybden på akupunkturnålinnsetting må være 2 mm.
    2. Finn GV24 acupoint 1,3 mm rett over midtpunktet på musens øyne på midtlinjen av pannen17. Dybden på akupunkturnålinnsetting må være 2 mm.
    3. Finn ST36 acupoint på utsiden av kneleddet, ca 2 mm under hodet på fibula18,19. Dybden av akupunkturnålinnsetting må være 3-4 mm.
  2. Klargjør engangs akupunkturnåler (se materialtabell) og en elektroakupunkturanordning (se materialtabell) for prosedyren (figur 4).
  3. Plasser musen i mageleie under mild anestesi med 0,5% isofluran, slik at hodene og lemmene er immobilisert. Hold en nål i rustfritt stål (diameter: 0,18 mm; lengde: 7 mm) med høyre hånd med tommelen, pekefingeren og langfingeren.
  4. Utfør akupunktur ved GV20 og GV24 akupunkter på tvers for 2 mm dybde, løft huden på musens hode med venstre hånd. Punkter ST36 acupoint vertikalt for 3-4 mm dybde ved å berøre det fibulære hodet på den laterale siden av musens kneledd og trykke på huden med venstre tommel.
    MERK: For akupunktene på hodet, anbefales det å sette nålene i rekkefølgen GV24 etterfulgt av GV20. Denne ordren letter operasjonell bekvemmelighet. Akupunkturpunkter er diskrete anatomiske steder i stedet for stasjonære punkter. Følgelig har små avvik i vinkelen for innsetting ingen effekt på terapeutisk effekt, tilsvarende sett hos pasienter som får elektroakupunkturbehandling i kliniske omgivelser.
  5. Koble det elektroniske akupunkturapparatet til nålene, med GV20 og venstre ST36 koblet til ett elektrodesett og GV24 og høyre ST36 koblet til et annet (figur 4). Velg kontinuerlig bølgemodus, med en elektrisk strømintensitet på 2 mA og en frekvens på 2 Hz20,21. Bekreft den ideelle behandlingen ved å observere lokale milde skjelvinger ved akupunkter og stille toleranse av musen.
    1. Når du kobler til det elektriske akupunkturinstrumentet, kobler du den proksimale enden av nålen. Dette bidrar til å minimere påvirkningen forårsaket av vekten av tilkoblingsledningen og forbedrer dermed forebyggingen av nåleløsningen. Hvis nødvendig, bruk tape for å sikre den horisontalt innsatte nålen og tilkoblingslinjen.
  6. Administrer den daglige behandlingen i 30 minutter hver dag i 6 påfølgende dager, med en enkelt hviledag mellom hver behandlingssyklus.

4. Test av åpent felt (figur 5)

MERK: Open Field-testen er en konvensjonell metode som brukes til å vurdere autonom oppførsel, utforskende oppførsel, kognitive evner og angstadferd hos eksperimentelle dyr i nye og ukjente miljøer22. Den består av en reaksjonsboks med åpent felt og en opptaksenhet.

  1. For å gjennomføre testen, lag en hvitvegget terning som måler 50 cm × 50 cm × 30 cm, med bunnen delt inn i 25 like firkanter som måler 10 cm × 10 cm.
  2. Plasser musen i reaksjonsboksen i det åpne feltet for akklimatisering. La musen utforske testrommet og bli kjent med det nye miljøet under akklimatiseringsperioden. Utfør åpen felttest etter å ha akklimatisert musen til det eksperimentelle miljøet i 1 time.
    MERK: Dette garanterer minimering av angst eller stress indusert av endringer i miljøet, og muliggjør dermed mer presise utfall under de påfølgende atferdsvurderingene.
  3. Plasser musen i midten av esken og overvåk den i 10 min etter å ha latt musen tilpasse seg miljøet i 2 minutter.
    1. Bruk et videosporingssystem (se Materialfortegnelse) til å registrere musens bevegelsesbane, total tilbakelagt avstand, tid brukt i det sentrale området, hastigheten på å krysse det sentrale området og antall oppføringer i det sentrale området under testen.
    2. Utfør de relevante operasjonene som beskrevet i produkthåndboken til videosporingssystemet. Hver mus gjennomgår en enkelt test og begynner å utforske fra samme sted i boksen.
    3. Etter hver test, rengjør den åpne feltboksen med 75% etanol for å forhindre falske resultater forårsaket av luktforstyrrelser når du bruker en mus.

5. Vannlabyrint (figur 5)

MERK: Vannlabyrinttesten brukes ofte som et atferdsvurderingsverktøy i eksperimenter som involverer mus for å evaluere deres romlige lærings- og minneevner23.

  1. Forbered en sirkulær vanntank med en diameter på 120 cm og en dybde på 30 cm. Del tanken i fire like kvadranter: I, II, III og IV. Hvis du bruker svarte mus i forsøket, bruk en hvit vanntank; For hvite mus, bruk en svart vanntank.
  2. Plasser gardiner rundt den sirkulære vanntanken for å hindre musen i å se forskerne under testen.
  3. Plasser forskjellige markører på den øverste overflaten av vanntanken som visuelle signaler for romlig orientering. Sørg for at disse markørene står stille gjennom hele eksperimentet for å opprettholde konsekvens.
  4. Plasser en sirkulær plattform med en diameter på 10 cm i kvadrant III av vanntanken som utpekt målområde. Sørg for at plattformen enkelt kan flyttes og sikres på ønsket sted.
  5. Gjennom hele forsøket, introduser vann i tanken mens du opprettholder et temperaturområde på 22-24 ° C.
    1. Sørg for at vannstanden holder seg konsekvent 1 cm over målplattformen. Inkluder en 20% konsentrasjon av giftfri titandioksid i vannet for å oppnå en tydelig kontrast mellom de svarte musene og den hvite bakgrunnen. Denne kontrasten letter kameraets opptak av musens bevegelser og relevante parametere.
  6. Gjennomfør en 5-dagers kontinuerlig romlig letetest ved sekvensielt å plassere hver mus i kvadranter I, II, III og IV.
    1. Plasser musen mot veggen. Flytt deg bort fra labyrinten for å forhindre at musen bruker eksperimentørens posisjon som referansepunkt. Registrer tiden musen tar for å finne plattformen.
    2. Hvis musen ikke klarer å finne undervannsplattformen innen 90 s, før musen til plattformen og gi en 30-s læringsperiode. I tillegg registrerer du latensperioden som 90 s.
    3. Hvis musen finner undervannsplattformen innen 90 s, la den forbli på plattformen i 10 s for læring før du fjerner den fra vanntanken.
    4. Tørk musen med et håndkle og sett den tilbake i buret.
    5. Roter plasseringen av hver mus i hver kvadrant hvert 20. minutt. Registrer hver muss svømmeavstand, hastighet og tid det tok å finne plattformen (latensperioden) ved hjelp av videosporingssystemet (se materialfortegnelsen), og utfør de relevante operasjonene som beskrevet i produkthåndboken.
    6. Sett plattformen 1 cm over vannoverflaten på dag 1. Plasser plattformen på en dybde på 1 cm under vannoverflaten på dag 2-5.
  7. På dag 6 fjerner du plattformen fra målkvadranten og gjennomfører en romlig letetest.
    1. Plasser musen i kvadrant I for å utforske fritt i 90 s. Datamaskinen registrerer musens svømmebane, tiden brukt i målkvadranten og antall ganger den krysser plattformen.
      MERK: For å minimere eksperimentelle feil forårsaket av menneskelige faktorer, er det viktig å holde posisjonen til referansepunktet fast i vannlabyrinteksperimentet. I tillegg bør eksperimentøren umiddelbart trekke seg tilbake etter å ha plassert musen i vannet. Etter at forsøket er fullført, bør musene tørkes med et håndkle og plasseres tilbake i burene for å opprettholde varmen.

6. Farging av hematoksylin og eosin (HE) (figur 6)

MERK: Histologisk undersøkelse av hippocampus-regionen hjelper til med å vurdere etableringen av hypoksimodellen og bestemme effekten av akupunkturbehandling.

  1. Etter atferdseksperimentet, bedøv musen med en intraperitoneal injeksjon av 20 mg / kg pentobarbitalnatrium og perfuser den med 10% paraformaldehydoppløsning (se materialfortegnelse) for å sikre fullstendig kroppsperfusjon. Isoler hjernevævet og senk det i 10% paraformaldehydoppløsning ved romtemperatur (RT) i 3 dager for å oppnå fiksering.
  2. Plasser hjerneprøvene i en innebyggingsboks. Deretter vaskes de behandlede hjerneprøvene med rennende vann i 6 timer.
  3. Bruk en automatisert vevsprosessor for å dehydrere prøvene ved hjelp av en serie alkoholløsninger med økende konsentrasjoner, nemlig 60% etanol i 1 time, 70% etanol i 1 time, 90% etanol i 1 time, 95% etanol i 2 timer og til slutt 100% etanol i 2 timer.
  4. Dypp vevsprøvene i xylen i 2 timer for å oppnå gjennomsiktighet. Deretter, etter fullføring av dehydreringsprosessen, overfør de permeabiliserte prøvene til parafinvoks oppvarmet til 60 ° C i 3 timer. Til slutt legger du dem inn i en automatisk prosessor.
  5. Bruk en roterende slicer for å oppnå 4 μm seksjoner. Deretter utsettes seksjonene for hematoksylinfarging i en varighet fra 3-8 minutter, etterfulgt av eosinfarging i 1-3 minutter.
  6. Overfør de fargede seksjonene i rekkefølge til separate beholdere med ren alkohol og xylen. Deretter forsegler og sikrer du de fargede seksjonene med nøytral tannkjøtt som forberedelse til patologisk undersøkelse under et optisk mikroskop.
  7. Bruk en lysbildeskanner (se Materialfortegnelse) til å skanne stykkene. Deretter bruker du visningsprogramvaren for å oppnå HE-fargeresultatene for hippocampus-regionen. Sammenlign arrangementet av nevroner og kondensering av nevronkjerner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Karakterisering av musebevegelsesbaner i frifelteksperimentet
Banekartet avslører at mus i normalgruppen viser en dyp tilbøyelighet til leting i ukjente miljøer. Deres aktivitetsbaner er primært konsentrert i hjørnene mens de dekker hele det åpne feltet (venstre panel). I motsetning til dette viser den langsiktige hypoksimodellgruppen av mus et betydelig redusert ønske om å utforske nye omgivelser. De henger overveiende i hjørnene uten å vise noen utforskende oppførsel mot midten av det åpne feltet (midtpanelet). Etter akupunkturbehandling viser den utforskende aktiviteten til hypoksiinduserte mus forbedring, og deres oppførsel av å våge seg mot midten av det åpne feltet blir gjenopprettet (høyre panel) (figur 5A).

Karakterisering av romlig læring og minne hos mus
I normalgruppen tilbrakte mus relativt lengre tid i målkvadranten og krysset plattformen oftere, som vist på banekartet (venstre panel). Den langsiktige hypoksiske modellgruppen av mus viste svekkede romlige minneevner sammenlignet med den normale gruppen, som indikert av deres manglende evne til å lokalisere målkvadranten innen den angitte tiden (midtpanelet). Etter akupunkturbehandling viste musene signifikant forbedring i deres hypoksi-induserte romlige minneegenskaper. De viste mer organisert utforskende atferd og tilbrakte merkbart lengre tid i målkvadranten (høyre panel) (figur 5B).

Histologisk undersøkelse av musehjerne
I kontrollgruppen viste arrangementet av nevroner i hippocampus-regionen av mus (øverst til venstre panel) regelmessighet, mens det ble forstyrret i den langsiktige hypoksiske modellgruppen (øverst til høyre). Omvendt viste behandlingsgruppen en forbedring i arrangementet av nevroner (nedre panel). Videre viste modellgruppen forverret krymping av musenevronkjerner sammenlignet med kontrollgruppen, men denne effekten ble delvis lindret i behandlingsgruppen. (Figur 6).

Figure 1
Figur 1 Etablering av musemodell for hypoksiindusert kognitiv svikt. Musene ble utsatt for hypoksi fra dag 1 til dag 90. Elektrisk akupunkturbehandling ble gitt daglig fra dag 75, hver behandlingssyklus varte i 6 dager og totalt 2 behandlingssykluser. Det var en 1-dagers pause mellom sykluser. Atferdstesting ble gjennomført dag 93. Histologisk undersøkelse og atferdstesting kan utføres på dag 65 for å bekrefte etableringen av modellen i hippocampus-regionen. Forkortelser: Man: måned. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Forbehandling av anestesi før elektroakupunktur. Før de gjennomgikk elektroakupunkturbehandling, ble musene bedøvet ved hjelp av en (A) anestesienhet. Musene ble deretter plassert i en (B) kammerboks med (C) 2% isofluran i kammeret. (D) Varigheten av den modifiserte anestesimetoden var kortere sammenlignet med den klassiske anestesimetoden. (E) Mus utsatt for mild anestesi beholder sin reaksjon på fotstimulering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Anatomisk struktur av akupunkturpunkter på musehodet. Denne figuren viser de anatomiske posisjonene til GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) og ST36 (Zusanli) hos mus. (A) Et anatomisk bilde av musehodet som viser frontale og parietale bein. (B) Et anatomisk bilde av musebenet som viser tibia, fibula og fibulært hode. (C) Plassering av akupunkturpunkter på musehodet. (D) GV20 er plassert på midtlinjen av pannen, midt mellom ørene, og direkte på toppen av parietalbenet. GV24 ligger på midtlinjen av pannen, like foran krysset mellom frontal- og parietalbenene. ST36 er plassert på utsiden av bakbenet, ca. 2 mm under det fibulære hodet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Elektroakupunkturbehandling. Musene gjennomgikk nålstimulering på bestemte punkter på GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) og bilateral ST36 (Zusanli) mens de var under anestesi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative resultater fra åpen felttest og vannlabyrinttest etter elektroakupunkturbehandling. (A) Den åpne felttesten ble utført for å evaluere atferdsendringer hos mus utsatt for kronisk hypoksi (CH) og akupunktur (EA) behandling. Tre representative baneplott ble generert fra testen. (B) Vannlabyrinttesten ble utført for å evaluere det romlige minnet til mus utsatt for kronisk hypoksi og akupunkturbehandling. Tre representative baneplott ble generert fra testen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6 Histologisk undersøkelse av musehjerne etter elektroakupunkturbehandling. Histologiske bilder av musene i kontrollgruppen (øverst til venstre), hypoksigruppen (øverst til høyre) og behandlingsgruppen (nedre panel). Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Akupunktur, en ikke-farmakologisk medisinsk praksis med opprinnelse i Kina for over 2000 år siden, innebærer innsetting av tynne nåler i bestemte punkter på kroppen kjent som akupunkturpunkter. Disse punktene antas å være forbundet med kanaler eller meridianer gjennom hvilke kroppens vitale energi, eller "qi", strømmer24. Ved å stimulere disse punktene, har akupunktur som mål å gjenopprette balanse og harmoni i kroppen. Det har vist seg å effektivt behandle ulike forhold, inkludert kronisk smerte, angst / depresjon, fordøyelsesproblemer, menstruasjonssmerter og luftveissykdommer 25,26,27,28,29. I de senere år har akupunktur dukket opp som en effektiv terapeutisk inngrep for nevronale sykdommer, inkludert kognitiv dysfunksjon. Flere studier har vist sin evne til å modulere nevrotransmittere, øke cerebral blodstrøm, redusere oksidativt stress og forbedre nevroplastisiteten 20,30,31,32. Følgelig blir det i økende grad anerkjent som et trygt og effektivt behandlingsalternativ, spesielt når det brukes sammen med konvensjonell medisinsk behandling33. Til tross for sin lange historie og utbredt bruk forblir virkningsmekanismen for akupunktur imidlertid ufullstendig forstått. En teori foreslår at akupunktur stimulerer frigivelsen av endorfiner, kroppens naturlige smertestillende midler, og dermed lindrer smerte og fremmer en følelse av velvære34. En annen teori antyder at akupunktur kan påvirke det autonome nervesystemet, som regulerer ulike ufrivillige kroppsfunksjoner35,36. Selv om vår forståelse av akupunkturens mekanismer fortsatt utvikler seg, er det økende anerkjennelse blant forskere at en standardisert laboratoriemetodikk for akupunktur, spesielt ved bruk av gnagermodeller, er avgjørende for å veilede forskning på dette området.

Valget av en passende anestesiprotokoll er det første avgjørende trinnet i å gjennomføre akupunktur i en musemodell. Tradisjonelle protokoller involverer ofte kontinuerlig høydosebedøvelse, noe som kan ha betydelige effekter på musens nervesystem og kan resultere i falske negative atferdstestresultater etter akupunkturbehandling. I denne studien foreslår vi en forbedret protokoll som bruker en forseglet anestesiboks for å gassbedøve musene til de mister bevisstheten. Deretter opprettholdes en stabil tilstand ved bruk av en lavdosebedøvelse under akupunkturbehandlingen. Denne metoden bidrar til å minimere funksjonelle og atferdsmessige abnormiteter forårsaket av overdreven anestesidosering og forbedrer nøyaktigheten av forsøkene. I tillegg kan forskere velge isofluran i stedet for ketamin og xylazin, da det gir raskere utvinningstid og reduserer systemisk toksisitetsrisiko forbundet med ketamin og xylazin37. Det er imidlertid viktig å merke seg at falske negative resultater forårsaket av anestesi fortsatt kan forekomme. Selv mild anestesi som fortsetter i 2 sammenhengende uker kan ha en negativ innvirkning på kognisjon38. For å mer nøyaktig evaluere effektiviteten av behandlingen, kan forskere innlemme en ekstra gruppe bedøvede mus som ikke får behandling for sammenligningsformål. Et annet kritisk aspekt ved akupunkturbehandling hos mus er å bestemme kombinasjonen av akupunkturer. Vanlige akupunkter for sykdommer i sentralnervesystemet hos mennesker inkluderer Baihui (GV20), Yintang (EX-HN3), Shenting (GV24) og Zusanli (ST36) 39,40,41. I denne studien fokuserte vi på inklusjon av Baihui (GV20), Shenting (GV24) og Zusanli (ST36) for behandlingen. Til tross for utfordringene fra den lille størrelsen på mus i akupunktlokalisering, viser leddposisjonering basert på anatomiske strukturer seg å være en effektiv metode. Til slutt er bestemmelse av riktig stimuleringsfrekvens og intensitet et annet viktig skritt i å utføre akupunkturbehandling hos mus. I denne studien benyttet vi lavfrekvent elektroakupunktur ved 2 Hz og en moderat intensitet på 2 mA. Selv om det terapeutiske resultatet av akupunktur er tydelig, er det nødvendig med ytterligere utforskning for å forstå den underliggende mekanismen.

Til tross for de brede potensielle anvendelsene av akupunktur i behandlingen av nevrologiske lidelser, har denne teknikken visse begrensninger. En begrensning er dens høye avhengighet av operatørens erfaring, noe som kan resultere i suboptimale resultater eller skade på eksperimentelle når de utføres av uerfarne operatører. En annen begrensning er behovet for forbedring i klinisk akupunkturbehandling for å forbedre effektiviteten. For tiden studerer forskere kombinasjonen av akupunktur med andre terapier, for eksempel farmakologiske inngrep og kognitiv trening, for å forbedre behandlingsresultatene42. I tillegg har teknologiske fremskritt ført til utvikling av nye teknikker, som transkraniell magnetisk stimulering (TMS), som kan brukes sammen med akupunktur for ytterligere å forbedre kognitiv funksjon43. Til tross for disse begrensningene har akupunktur vist betydelige fordeler ved behandling av ulike nevrologiske lidelser og har stort potensial for fremtidige applikasjoner, spesielt i kombinasjon med andre terapier. Denne artikkelen gir detaljerte metoder for å konstruere en musemodell av kronisk hypoksi-indusert kognitiv svekkelse, prosessen med akupunkturbehandling og atferdstestmetoder. Disse metodene kan hjelpe forskere i å gjennomføre grundige studier på anvendelse og mekanisme for akupunktur, og dermed fremme fremme av tradisjonell kinesisk medisin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av S &T Program of Hebei (NO.E2020100001 og NO.22372502D), High-level S &; T Innovation and Entrepreneurship Talent Project of Shijiazhuang (nr. 07202203).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% paraformaldehyde solution Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd RL3234
ANY-maze Science  SA201 Video tracking system
C75BL/6J mice BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD No.110322220103041767 Gender: Male,  Weight: 18–22 g
Electroacupuncture device Great Wall KWD-808 I
Hwato acupuncture  needle Suzhou Medical Appliance Factory 2655519 
Isoflurane RWD Life Science Co.,Ltd R510-22
NanoZoomer Digital Pathology Hamamatsu Photonics K. K C9600-01
Small animal anesthesia machine RWD YL-LE-A106

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pais, R., Ruano, L., Carvalho, O. P., Barros, H. Global cognitive impairment prevalence and incidence in community dwelling older adults- A systemic review. Geriatrics. 5 (4), Basel, Switzerland. 84 (2020).
  2. Tian, Z., Ji, X., Liu, J. Neuroinflammation in vascular cognitive impairment and dementia: Current evidence, advances, and prospects. International Journal of Molecular Sciences. 23 (11), 6224 (2022).
  3. Yuan, Y., et al. Activation of ERK-Drp1 signaling promotes hypoxia-induced Aβ accumulation by upregulating mitochondrial fission and BACE1 activity. FEBS open bio. 11 (10), 2740-2755 (2021).
  4. Zhu, X., et al. NLRP3 deficiency protects against hypobaric hypoxia induced neuroinflammation and cognitive dysfunction. Ecotoxicology and Environmental Safety. 255, 114828 (2023).
  5. Li, B., Dasgupta, C., Huang, L., Meng, X., Zhang, L. MiRNA-210 induces microglial activation and regulates microglia-mediated neuroinflammation in neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Cellular & Molecular Immunology. 17 (9), 976-991 (2020).
  6. Cai, M., Lee, J. H., Yang, E. J. Electro-acupuncture attenuates cognition impairment via anti-neuroinflammation in an Alzheimer's disease animal model. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 264 (2019).
  7. Xie, L., et al. Electro-acupuncture improves M2 microglia polarization and glia anti-inflammation of hippocampus in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 689629 (2021).
  8. Huang, L., et al. Effects of acupuncture on vascular cognitive impairment with no dementia: A randomized controlled trial. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 81 (4), 1391-1401 (2021).
  9. Xi, L., Fang, F., Yuan, H., Wang, D. Transcutaneous electrical acupoint stimulation for postoperative cognitive dysfunction in geriatric patients with gastrointestinal tumor: a randomized controlled trial. Trials. 22 (1), 563 (2021).
  10. Du, S. Q., et al. Acupuncture inhibits TXNIP-associated oxidative stress and inflammation to attenuate cognitive impairment in vascular dementia rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24 (1), 39-46 (2018).
  11. Zhang, C. E., et al. Hypoxia-induced tau phosphorylation and memory deficit in rats. Neuro-Degenerative Diseases. 14 (3), 107-116 (2014).
  12. Liang, X., Zhang, R. Effects of minocycline on cognitive impairment, hippocampal inflammatory response, and hippocampal Alzheimer's related proteins in aged rats after propofol anesthesia. Disease Markers. 2022, 4709019 (2022).
  13. Lee, J. R., et al. Effect of dexmedetomidine on sevoflurane-induced neurodegeneration in neonatal rats. British Journal of Anaesthesia. 126 (5), 1009-1021 (2021).
  14. Matsumoto, Y., Fujino, Y., Furue, H. Anesthesia and surgery induce a functional decrease in excitatory synaptic transmission in prefrontal cortex neurons, and intraoperative administration of dexmedetomidine does not elicit the synaptic dysfunction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 572, 27-34 (2021).
  15. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The open field test for measuring locomotor activity and anxiety-like behavior. Methods in Molecular Biology. 1916, Clifton, N.J. 99-103 (2019).
  16. Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2920 (2011).
  17. Lin, W., et al. TNEA therapy promotes the autophagic degradation of NLRP3 inflammasome in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease via TFEB/TFE3 activation. Journal of Neuroinflammation. 20 (1), 21 (2023).
  18. Liu, S., et al. A neuroanatomical basis for electro-acupuncture to drive the vagal-adrenal axis. Nature. 598 (7882), 641-645 (2021).
  19. Jang, J. H., et al. Acupuncture inhibits neuroinflammation and gut microbial dysbiosis in a mouse model of Parkinson's disease. Brain, Behavior, and Immunity. 89, 641-655 (2020).
  20. Dong, W., et al. Electro-acupuncture improves synaptic function in SAMP8 mice probably via inhibition of the AMPK/eEF2K/eEF2 signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2019, 8260815 (2019).
  21. Han, Y. G., et al. Electro-acupuncture prevents cognitive impairment induced by lipopolysaccharide via inhibition of oxidative stress and neuroinflammation. Neuroscience Letters. 683, 190-195 (2018).
  22. Zhang, Q., et al. Electro-acupuncture pre-treatment ameliorates anesthesia and surgery-induced cognitive dysfunction via inhibiting mitochondrial injury and neuroapoptosis in aged rats. Neurochemical Research. 47 (6), 1751-1764 (2022).
  23. Zheng, X., et al. Electro-acupuncture ameliorates beta-amyloid pathology and cognitive impairment in Alzheimer disease via a novel mechanism involving activation of TFEB (transcription factor EB). Autophagy. 17 (11), 3833-3847 (2021).
  24. Zhou, W., Benharash, P. Effects and mechanisms of acupuncture based on the principle of meridians. Journal of Acupuncture and Meridian Studies. 7 (4), 190-193 (2014).
  25. Sun, Y., et al. Efficacy of Acupuncture For Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome : A Randomized Trial. Annals of Internal Medicine. 174 (10), 1357-1366 (2021).
  26. Jung, J., et al. Lipidomics reveals that acupuncture modulates the lipid metabolism and inflammatory interaction in a mouse model of depression. Brain, Behavior, and Immunity. 94, 424-436 (2021).
  27. Yang, N. N., et al. Electro-acupuncture ameliorates intestinal inflammation by activating α7nAChR-mediated JAK2/STAT3 signaling pathway in postoperative ileus. Theranostics. 11 (9), 4078-4089 (2021).
  28. Shetty, G. B., Shetty, B., Mooventhan, A. Efficacy of acupuncture in the management of primary dysmenorrhea: A randomized controlled trial. Journal of Acupuncture and Meridian Studies. 11 (4), 153-158 (2018).
  29. Nurwati, I., Purwanto, B., Mudigdo, A., Saputra, K., Prasetyo, D. H., Muthmainah, M. Improvement in inflammation and airway remodelling after acupuncture at BL13 and ST36 in a mouse model of chronic asthma. Acupuncture in Medicine. 37 (4), 228-236 (2019).
  30. Li, P., et al. Acupuncture can play an antidepressant role by regulating the intestinal microbes and neurotransmitters in a rat model of depression. Medical Science Monitor. 27, 929027 (2021).
  31. Ding, N., Jiang, J., Xu, A., Tang, Y., Li, Z. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 13, 37 (2019).
  32. Yang, J. W., Wang, X. R., Ma, S. M., Yang, N. N., Li, Q. Q., Liu, C. Z. Acupuncture attenuates cognitive impairment, oxidative stress and NF-κB activation in cerebral multi-infarct rats. Acupuncture in Medicine. 37 (5), 283-291 (2019).
  33. Li, X., et al. Traditional Chinese acupoint massage, acupuncture, and moxibustion for people with diabetic gastroparesis: A systematic review and meta-analysis. Medicine. 101 (48), 32058 (2022).
  34. Yang, X. Y., et al. Effect of combined acupuncture-medicine anesthesia in thyroid nodule ablation and its effect on serum β-endorphin. Acupuncture Research. 45 (12), 1006-1009 (2020).
  35. Uchida, C., et al. Effects of Acupuncture Sensations on Transient Heart Rate Reduction and Autonomic Nervous System Function During Acupuncture Stimulation. Medical Acupuncture. 31 (3), 176-184 (2019).
  36. Liang, C., Wang, K. Y., Gong, M. R., Li, Q., Yu, Z., Xu, B. Electro-acupuncture at ST37 and ST25 induce different effects on colonic motility via the enteric nervous system by affecting excitatory and inhibitory neurons. Neurogastroenterology and Motility. 30 (7), 13318 (2018).
  37. Michelson, N. J., Kozai, T. Isoflurane and ketamine differentially influence spontaneous and evoked laminar electrophysiology in mouse V1. Journal of Neurophysiology. 120 (5), 2232-2245 (2018).
  38. Yu, X., Zhang, F., Shi, J. Sevoflurane anesthesia impairs metabotropic glutamate receptor-dependent long-term depression and cognitive functions in senile mice. Geriatrics & Gerontology International. 19 (4), 357-362 (2019).
  39. Jeong, J. H., et al. Investigation of combined treatment of acupuncture and neurofeedback for improving cognitive function in mild neurocognitive disorder: A randomized, assessor-blind, pilot study. Medicine. 100 (37), 27218 (2021).
  40. Lin, Y. K., Liao, H. Y., Watson, K., Yeh, T. P., Chen, I. H. Acupressure improves cognition and quality of life among older adults with cognitive disorders in long-term care settings: A clustered randomized controlled trial. Journal of the American Medical Directors Association. 24 (4), 548-554 (2023).
  41. Wu, W. Z., et al. Effect of Tongdu Tiaoshen acupuncture on serum GABA and CORT levels in patients with chronic insomnia. Chinese Acupuncture & Moxibustion. 41 (7), 721-724 (2021).
  42. Zhuo, P. Y., et al. Efficacy and safety of acupuncture combined with rehabilitation training for poststroke cognitive impairment: A systematic review and meta-analysis. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 32 (9), 107231 (2023).
  43. Li, R. Y., Huang, R. J., Yu, Q. Comparison of different physical therapies combined with acupuncture for poststroke cognitive impairment: A network meta-analysis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2021, 1101101 (2021).

Tags

Atferd utgave 202 kronisk hypoksi kognitiv svekkelse mild anestesi ikke-farmakologisk tradisjonell kinesisk medisin
Akupunkturbehandling i en musemodell av kronisk hypoksi-indusert kognitiv dysfunksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wan, F., Guo, Z., Wang, M., Hou, Y., … More

Wan, F., Guo, Z., Wang, M., Hou, Y., Wang, L., Li, W., Kang, N., Zhu, P., Li, M. Acupuncture Treatment in a Mouse Model of Chronic Hypoxia-Induced Cognitive Dysfunction. J. Vis. Exp. (202), e65784, doi:10.3791/65784 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter