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Tratamiento con acupuntura en un modelo murino de disfunción cognitiva inducida por hipoxia crónica

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65784
Automatic Translation
*1, *2,3, 4, 5,6, 3,5, 4,7, 2,3, 8, 5,6
1Heilongjiang University of Chinese Medicine, 2Hebei Provincial Key Laboratory of Luobing, 3Key Laboratory of State Administration of TCM (Cardio-Cerebral Vessel Collateral Disease), 4Hebei University of Chinese Medicine, 5Shijiazhuang Compound Traditional Chinese Medicine Technology Innovation Center, 6National Key Laboratory of Luobing Research and Innovative Chinese Medicine, 7Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Ltd, 8The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

En este trabajo se describe un protocolo para la implementación de un tratamiento con anestesia leve y acupuntura en un modelo murino de hipoxia crónica y la realización de pruebas conductuales para evaluar las alteraciones cognitivas post-tratamiento.

Abstract

El tratamiento de los trastornos del sistema nervioso central ha planteado constantemente importantes desafíos en el campo de la medicina. La acupuntura, una práctica no farmacológica arraigada en la medicina tradicional china, implica la inserción de agujas finas en puntos precisos del cuerpo y se emplea comúnmente para el manejo de diversas afecciones. Recientemente, la acupuntura ha surgido como una intervención terapéutica prometedora para una variedad de enfermedades neurológicas, incluida la ansiedad y los trastornos respiratorios. Sin embargo, aún no se ha explorado el potencial de la acupuntura en el tratamiento de la disfunción cognitiva inducida por la hipoxia crónica. Este artículo presenta un protocolo completo para establecer un modelo de ratón de deterioro cognitivo crónico inducido por hipoxia, administrar anestesia suave, realizar un tratamiento de acupuntura y evaluar los cambios de comportamiento y las habilidades de memoria utilizando pruebas de campo abierto y laberintos de agua. El protocolo paso a paso proporciona instrucciones detalladas sobre cómo localizar y posicionar con precisión los puntos de acupuntura y las agujas para mejorar la cognición. Al emplear este protocolo, los investigadores pueden realizar estudios sistemáticos para evaluar a fondo el potencial terapéutico de la acupuntura para la disfunción cognitiva.

Introduction

La población mundial se enfrenta actualmente a un problema crítico de envejecimiento, lo que resulta en un rápido aumento en la prevalencia de trastornos cognitivos. La incidencia mundial de deterioro cognitivo es de aproximadamente 53,97 por cada 1000 años-persona1. La hipoxia cerebral crónica causada por disfunción vascular o trastornos circulatorios/respiratorios sigue siendo uno de los principales factores de riesgo para la demencia relacionada con la edad2. Estudios previos han demostrado que la hipoxia cerebral puede aumentar el depósito de amiloide β mediante la modificación de la expresión de BACE13. Además, la hipoxia se ha asociado con la desregulación de las células gliales y la neuroinflamación 4,5. A pesar de la creciente magnitud de este problema, actualmente faltan medicamentos occidentales eficaces para prevenir el deterioro cognitivo crónico inducido por la hipoxia. La medicina tradicional china no farmacológica, en particular la acupuntura, se ha utilizado durante miles de años para tratar trastornos cognitivos y ha mostrado resultados prometedores en el alivio de enfermedades neurodegenerativas 6,7. Los puntos de acupuntura Baihui, Shenting y Zusanli son puntos efectivos para el tratamiento de la disfunción cognitiva 8,9. Los estudios clínicos han demostrado que la terapia de electroacupuntura mejora significativamente las puntuaciones de la Evaluación Cognitiva de Montreal (MoCA) y el Miniexamen del Estado Mental (MMSE) en pacientes con deterioro cognitivo vascular y mejora eficazmente la disfunción cognitiva8. Aunque los estudios han sugerido que la acupuntura puede mejorar significativamente la capacidad de memoria de las ratas con ligadura arterial, no hay informes sobre los efectos de la acupuntura en ningún modelo de roedor con trastornos cognitivos crónicos inducidos por hipoxia. La falta de investigación sobre el mecanismo ha impedido considerablemente su aplicación clínica.

Investigaciones anteriores han demostrado que someter a ratas a un ambiente hipóxico durante un período de 8 semanas puede elevar significativamente los niveles de estrés oxidativo e inflamación en el cerebro, lo que resulta en una disminución dela función de la memoria. El presente estudio tiene como objetivo investigar el impacto de la acupuntura en modelos de roedores con el fin de ampliar nuestra comprensión. Vale la pena señalar, sin embargo, que la anestesia generalmente se requiere durante el tratamiento de acupuntura en roedores debido a la posibilidad de agitación durante la estimulación repetida. La anestesia prolongada puede afectar significativamente la función cognitiva en ratones, ya que la mayoría de los fármacos anestésicos pueden suprimir la actividad neuronal e impedir el procesamiento de la información, lo que conduce a déficits conductuales12. Varios estudios han demostrado que la administración de sevoflurano al 2,5% durante 6 h puede perjudicar notablemente la memoria espacial, la capacidad de aprendizaje y la atención en ratones13. Además, la evidencia sugiere que altas dosis de anestesia pueden provocar la muerte neuronal o daño nervioso en ratones14. Por lo tanto, es imperativo identificar un enfoque adecuado para minimizar la cantidad total de anestesia utilizada. En este estudio, presentamos un método de acupuntura eficaz para tratar ratones con deterioro cognitivo, junto con pruebas de comportamiento para evaluar sus capacidades de memoria. Es importante destacar que presentamos una técnica de anestesia previa al tratamiento modificada que puede reducir eficazmente la dosis total de anestesia administrada durante el experimento.

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Protocol

Los experimentos con animales se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Investigación y Ética Animal del Instituto de Investigación Médica Yiling de Hebei (número de aprobación: N2022148). Los ratones machos C57BL/6J con un peso de 18-22 g (ver Tabla de materiales) se alojaron en el centro de evaluación de nuevos fármacos del Instituto de Investigación Médica de Hebei Yiling. Se les proporcionó comida normal y agua limpia y se les expuso a luz artificial durante 12 horas diarias. Las habitaciones mantuvieron un rango de temperatura controlado de 20-26 °C y una humedad relativa del 40%-70%.

1. Establecimiento de un modelo murino de hipoxia crónica (Figura 1)

  1. Antes de comenzar el experimento, prepare las jaulas de los animales bajo presión atmosférica normal y las jaulas con un ambiente continuo con poco oxígeno. Establezca un entorno continuo con bajo contenido de oxígeno mediante la utilización de un sistema automatizado de suministro de control de gas para enjuagar la cámara con una mezcla de oxígeno puro y nitrógeno.
    NOTA: Este sistema está programado para controlar el interruptor de la válvula electromagnética, lo que garantiza un suministro preciso de gas en términos de tiempo y concentración.
  2. Divida aleatoriamente a los ratones en tres grupos: un grupo de control (Con), un grupo modelo (CH) y un grupo de electroacupuntura (EA + CH). Coloque los ratones de control y de modelo/electroacupuntura por separado en las dos jaulas, con 10 ratones por jaula. Mantenga el ciclo de luz a 12 h/12 h (claro/oscuro).
    NOTA: No se induce tratamiento ni hipoxia en el grupo control (Con). El grupo modelo (CH) está formado por ratones con hipoxia crónica. El grupo de electroacupuntura (EA + CH) comprende ratones inducidos por hipoxia tratados con electroacupuntura.
  3. Para desarrollar hipoxia crónica, establezca los parámetros de la cámara de bajo oxígeno utilizando un medidor de oxígeno digital para regular el caudal de gas y mantener una concentración de oxígeno del 10%. Colocar a los animales dentro de la cámara de bajo oxígeno a las 9:00 am y retirarlos a las 5:00 pm, dando como resultado un total de 8 h de exposición ininterrumpida a bajo oxígeno por día durante 3 meses.
    NOTA: Al configurar el suministro de gas nitrógeno para reducir la concentración de oxígeno, se recomienda proceder lentamente para evitar una introducción excesiva de gas nitrógeno de una vez, ya que provocará la muerte de animales.
  4. Evaluar el modelo de disfunción cognitiva inducida por hipoxia crónica mediante examen histológico y pruebas conductuales: la prueba de campo abierto15 y la prueba del laberinto de agua16.

2. Anestesia (Figura 2)

  1. Prepare la máquina de anestesia para animales pequeños (consulte la tabla de materiales) y la almohadilla térmica de temperatura constante.
    NOTA: Durante la anestesia, los animales son susceptibles a la hipotermia, lo que subraya la necesidad de emplear una almohadilla térmica a temperatura constante para el aislamiento.
  2. Coloque el ratón en la caja de inducción de anestesia e induzca rápidamente con isoflurano al 2%-2,5% en oxígeno (ver Tabla de Materiales) durante aproximadamente 1 min.
    NOTA: Este pretratamiento a corto plazo es un paso crucial para garantizar que los ratones puedan prosperar bajo dosis de baja concentración durante un período prolongado de tiempo.
  3. Una vez que su excitabilidad disminuya, pellizca el dedo del pie del ratón para comprobar su reflejo. A continuación, transfiera el ratón a la almohadilla térmica de temperatura constante (37 °C).
  4. Ajuste el caudal de anestesia a una concentración de aproximadamente 0,5%. Conecte la máquina de anestesia a la boca y la nariz del ratón. Proceda con el tratamiento de electroacupuntura mientras se asegura el mantenimiento de la anestesia.
    NOTA: El efecto de la anestesia se confirmó cuando los ratones dejaron de parpadear. El efecto de la anestesia puede durar al menos 30 minutos.

3. Tratamiento de electroacupuntura

  1. Para mejorar eficazmente la disfunción cognitiva, seleccione puntos de acupuntura específicos, como Baihui (GV20), Shenting (GV24) y Zusanli bilateral (ST36), basándose en la teoría de la medicina tradicional china y la experiencia clínica (Figura 3). Administrar el tratamiento de electroacupuntura 2 semanas antes de la finalización del proceso de modelado.
    1. Localice el punto de acupuntura GV20 en la línea media de la frente, en el punto medio de una línea que conecta las puntas de las orejas7. La profundidad de inserción de la aguja de acupuntura debe ser de 2 mm.
    2. Localice el punto de acupuntura GV24 a 1,3 mm directamente por encima del punto medio de los ojos del ratón en la línea media de la frente17. La profundidad de inserción de la aguja de acupuntura debe ser de 2 mm.
    3. Localice el punto de acupuntura ST36 en la parte externa de la articulación de la rodilla, aproximadamente 2 mm por debajo de la cabeza del peroné18,19. La profundidad de inserción de la aguja de acupuntura debe ser de 3-4 mm.
  2. Prepare agujas de acupuntura desechables (ver Tabla de Materiales) y un dispositivo de electroacupuntura (ver Tabla de Materiales) para el procedimiento (Figura 4).
  3. Coloque al ratón en posición prona bajo anestesia suave con isoflurano al 0,5%, asegurándose de que sus cabezas y extremidades estén inmovilizadas. Sostenga una aguja de acero inoxidable (diámetro: 0,18 mm; longitud: 7 mm) con la mano derecha, usando el pulgar, el índice y el dedo medio.
  4. Realizar acupuntura en los puntos de acupuntura GV20 y GV24 transversalmente a 2 mm de profundidad, levantando la piel de la cabeza del ratón con la mano izquierda. Perfore el punto de acupuntura ST36 verticalmente a una profundidad de 3-4 mm tocando la cabeza del peroné en el lado lateral de la articulación de la rodilla del ratón y presionando la piel con el pulgar izquierdo.
    NOTA: Para los puntos de acupuntura localizados en la cabeza, es recomendable insertar las agujas en la secuencia de GV24 seguida de GV20. Este pedido facilita la comodidad operativa. Los puntos de acupuntura son ubicaciones anatómicas discretas en lugar de puntos estacionarios. En consecuencia, las ligeras desviaciones en el ángulo de inserción de la aguja no tienen ningún efecto sobre la eficacia terapéutica, lo que se observa de manera similar en pacientes que reciben tratamiento de electroacupuntura en entornos clínicos.
  5. Conecte el dispositivo electrónico de acupuntura a las agujas, con GV20 y el ST36 izquierdo conectados a un juego de electrodos y GV24 y el ST36 derecho conectados a otro (Figura 4). Seleccione el modo de onda continua, con una intensidad de corriente eléctrica de 2 mA y una frecuencia de 2 Hz20,21. Confirme el tratamiento ideal observando temblores leves locales en los puntos de acupuntura y tolerancia silenciosa por parte del ratón.
    1. Al conectar el instrumento de acupuntura eléctrica, conecte el extremo proximal de la aguja. Esto ayuda a minimizar el impacto causado por el peso de la línea de conexión y, en consecuencia, mejora la prevención del desprendimiento de la aguja. Si es necesario, utilice cinta adhesiva para asegurar la aguja insertada horizontalmente y la línea de conexión.
  6. Administrar el tratamiento diario durante 30 minutos cada día durante 6 días consecutivos, con un solo día de descanso entre cada ciclo de tratamiento.

4. Prueba de campo abierto (Figura 5)

NOTA: La prueba de campo abierto es un método convencional utilizado para evaluar el comportamiento autónomo, el comportamiento exploratorio, las habilidades cognitivas y el comportamiento de ansiedad de animales de experimentación en entornos nuevos y desconocidos22. Consta de una caja de reacción de campo abierto y un dispositivo de grabación.

  1. Para realizar la prueba, prepare un cubo de paredes blancas que mida 50 cm × 50 cm × 30 cm, con el fondo dividido en 25 cuadrados iguales que midan 10 cm × 10 cm.
  2. Coloque el mouse en el cuadro de reacción de campo abierto para aclimatarse. Permita que el ratón explore la sala de pruebas y se familiarice con el nuevo entorno durante el período de aclimatación. Realizar la prueba de campo abierto después de aclimatar al ratón al entorno experimental durante 1 h.
    NOTA: Esto garantiza la minimización de la ansiedad o el estrés inducido por alteraciones en el entorno, lo que permite obtener resultados más precisos durante las evaluaciones conductuales posteriores.
  3. Coloque el mouse en el centro de la caja y vigílelo durante 10 minutos después de permitir que el mouse se adapte al entorno durante 2 minutos.
    1. Utilice un sistema de seguimiento de video (ver Tabla de materiales) para registrar la trayectoria del movimiento del mouse, la distancia total recorrida, el tiempo de permanencia en el área central, la velocidad de cruce del área central y el número de entradas en el área central durante la prueba.
    2. Realice las operaciones pertinentes según las instrucciones del manual del producto del sistema de seguimiento de video. Cada ratón se somete a una única prueba y comienza a explorar desde el mismo lugar dentro de la caja.
    3. Después de cada prueba, limpie la caja de campo abierto con etanol al 75% para evitar resultados falsos causados por la interferencia de olores al usar un mouse.

5. Laberinto de agua (Figura 5)

NOTA: La prueba del laberinto de agua se emplea con frecuencia como una herramienta de evaluación del comportamiento en experimentos con ratones para evaluar sus capacidades de aprendizaje espacial y memoria23.

  1. Prepare un tanque de agua circular con un diámetro de 120 cm y una profundidad de 30 cm. Divide el tanque en cuatro cuadrantes iguales: I, II, III y IV. Si usa ratones negros en el experimento, use un tanque de agua blanca; Para los ratones blancos, use un tanque de agua negro.
  2. Coloque cortinas alrededor del tanque de agua circular para evitar que el ratón vea a los investigadores durante la prueba.
  3. Coloque diferentes marcadores en la superficie superior del tanque de agua como señales visuales para la orientación espacial. Asegúrese de que estos marcadores permanezcan estacionarios durante todo el experimento para mantener la coherencia.
  4. Coloque una plataforma circular con un diámetro de 10 cm en el cuadrante III del tanque de agua como el área objetivo designada. Asegúrese de que la plataforma se pueda mover y asegurar fácilmente en cualquier ubicación deseada.
  5. A lo largo del experimento, introduce agua en el tanque manteniendo un rango de temperatura de 22-24 °C.
    1. Asegúrese de que el nivel del agua permanezca constantemente a 1 cm por encima de la plataforma objetivo. Incluya una concentración del 20% de dióxido de titanio no tóxico en el agua para lograr un contraste distintivo entre los ratones negros y el fondo blanco. Este contraste facilita que la cámara registre los movimientos del ratón y los parámetros relevantes.
  6. Realice una prueba de exploración espacial continua de 5 días colocando secuencialmente cada ratón en los cuadrantes I, II, III y IV.
    1. Coloque el ratón mirando hacia la pared. Aléjese del laberinto para evitar que el ratón utilice la posición del experimentador como punto de referencia. Registre el tiempo que tarda el ratón en encontrar la plataforma.
    2. Si el ratón no localiza la plataforma submarina en un plazo de 90 s, guíe al ratón hasta la plataforma y proporcione un período de aprendizaje de 30 s. Además, registre el período de latencia como 90 s.
    3. Si el ratón localiza la plataforma subacuática dentro de los 90 s, déjela permanecer en la plataforma durante 10 s para aprender antes de sacarla del tanque de agua.
    4. Seca al ratón con una toalla y devuélvelo a su jaula.
    5. Gire la ubicación de cada ratón en cada cuadrante cada 20 minutos. Registre la distancia de natación de cada ratón, la velocidad y el tiempo que tarda en encontrar la plataforma (el período de latencia) utilizando el sistema de seguimiento de vídeo (consulte la tabla de materiales), realizando las operaciones pertinentes según las instrucciones del manual del producto.
    6. Coloque la plataforma a 1 cm por encima de la superficie del agua el día 1. Coloque la plataforma a una profundidad de 1 cm por debajo de la superficie del agua en los días 2-5.
  7. El día 6, retire la plataforma del cuadrante objetivo y realice una prueba de exploración espacial.
    1. Coloque el ratón en el cuadrante I para explorar libremente durante 90 s. La computadora registra la trayectoria de natación del mouse, el tiempo que pasa en el cuadrante objetivo y el número de veces que cruza la plataforma.
      NOTA: Con el fin de minimizar los errores experimentales causados por factores humanos, es importante mantener fija la posición del punto de referencia en el experimento del laberinto de agua. Además, el experimentador debe retirarse inmediatamente después de colocar al ratón en el agua. Una vez finalizado el experimento, los ratones deben secarse con una toalla y volver a colocarse en sus jaulas para mantener el calor.

6. Tinción de hematoxilina y eosina (HE) (Figura 6)

NOTA: El examen histológico de la región del hipocampo ayuda a evaluar el establecimiento del modelo de hipoxia y a determinar la eficacia del tratamiento con acupuntura.

  1. Después del experimento conductual, anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de 20 mg/kg de pentobarbital sódico y perfundirlo con una solución de paraformaldehído al 10% (ver Tabla de materiales) para asegurar una perfusión corporal completa. Aislar el tejido cerebral y sumergirlo en una solución de paraformaldehído al 10% a temperatura ambiente (RT) durante 3 días para lograr la fijación.
  2. Coloque las muestras de cerebro en una caja de inclusión. Posteriormente, lavar las muestras de cerebro procesadas con agua corriente durante 6 h.
  3. Emplee un procesador de tejidos automatizado para deshidratar las muestras utilizando una serie de soluciones de alcohol con concentraciones crecientes, a saber, etanol al 60% durante 1 h, etanol al 70% durante 1 h, etanol al 90% durante 1 h, etanol al 95% durante 2 h y, finalmente, etanol al 100% durante 2 h.
  4. Sumerja las muestras de tejido en xileno durante 2 h para lograr transparencia. Posteriormente, una vez finalizado el proceso de deshidratación, transferir las muestras permeabilizadas a cera de parafina calentada a 60 °C durante 3 h. Por último, insértelos en un procesador automático.
  5. Utilice una cortadora rotativa para obtener secciones de 4 μm. Posteriormente, someter las secciones a tinción con hematoxilina durante un período de 3-8 min, seguido de tinción con eosina durante 1-3 min.
  6. Transfiera secuencialmente las secciones teñidas a recipientes separados de alcohol puro y xileno. Luego, selle y asegure las secciones teñidas con goma neutra en preparación para el examen patológico bajo un microscopio óptico.
  7. Emplee un escáner de diapositivas (consulte la Tabla de materiales) para escanear los cortes. Posteriormente, utilice el software de visualización para obtener los resultados de la tinción HE para la región del hipocampo. Compara la disposición de las neuronas y la condensación de los núcleos neuronales.

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Representative Results

Caracterización de las trayectorias de locomoción del ratón en el experimento de campo abierto
El mapa de trayectoria revela que los ratones del grupo normal muestran una profunda inclinación por la exploración en entornos desconocidos. Sus trayectorias de actividad se concentran principalmente en las esquinas mientras cubren todo el campo abierto (panel izquierdo). Por el contrario, el grupo de ratones modelo de hipoxia a largo plazo muestra un deseo significativamente disminuido de explorar nuevos entornos. Predominantemente permanecen en las esquinas sin exhibir ningún comportamiento exploratorio hacia el centro del campo abierto (panel central). Después del tratamiento con acupuntura, la actividad exploratoria de los ratones inducidos por hipoxia muestra mejoría, y su comportamiento de aventurarse hacia el centro del campo abierto se restablece (panel derecho) (Figura 5A).

Caracterización del aprendizaje espacial y la memoria en ratones
En el grupo normal, los ratones pasaron una cantidad de tiempo relativamente más larga en el cuadrante objetivo y cruzaron la plataforma con más frecuencia, como se muestra en el mapa de trayectoria (panel izquierdo). El grupo de ratones modelo hipóxico a largo plazo demostró capacidades de memoria espacial debilitadas en comparación con el grupo normal, como lo indica su incapacidad para localizar el cuadrante objetivo dentro del tiempo especificado (panel central). Después del tratamiento de acupuntura, los ratones mostraron una mejora significativa en sus capacidades de memoria espacial inducida por hipoxia. Mostraron un comportamiento exploratorio más organizado y pasaron un tiempo notablemente más largo en el cuadrante objetivo (panel derecho) (Figura 5B).

Examen histológico del cerebro de ratón
En el grupo de control, la disposición de las neuronas en la región del hipocampo de los ratones (panel superior izquierdo) demostró regularidad, mientras que se interrumpió en el grupo modelo hipóxico a largo plazo (panel superior derecho). Por el contrario, el grupo de tratamiento mostró una mejora en la disposición de las neuronas (panel inferior). Además, el grupo modelo mostró una contracción exacerbada de los núcleos neuronales de ratón en comparación con el grupo de control, pero este efecto se alivió parcialmente en el grupo de tratamiento. (Figura 6).

Figure 1
Figura 1: Establecimiento de un modelo murino para el deterioro cognitivo inducido por hipoxia. Los ratones fueron expuestos a hipoxia desde el día 1 hasta el día 90. La terapia de acupuntura eléctrica se administró diariamente a partir del día 75, con una duración de 6 días cada ciclo de tratamiento y un total de 2 ciclos de tratamiento. Hubo un descanso de 1 día entre ciclos. Las pruebas de comportamiento se realizaron en el día 93. El examen histológico y las pruebas conductuales se pueden realizar en el día 65 para confirmar el establecimiento del modelo en la región del hipocampo. Abreviaturas: Lunes: mes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Pretratamiento anestésico previo a la electroacupuntura. Antes de someterse al tratamiento de electroacupuntura, los ratones fueron anestesiados con un dispositivo de anestesia (A). Luego, los ratones se colocaron en una caja de cámara (B) con (C) isoflurano al 2% en la cámara. (D) La duración del método de anestesia modificada fue más corta en comparación con el método de anestesia clásico. (E) Los ratones sometidos a anestesia leve conservan su reacción a la estimulación de los pies. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Estructura anatómica de los puntos de acupuntura en la cabeza del ratón. Esta figura muestra las posiciones anatómicas de GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) y ST36 (Zusanli) en ratones. (A) Una vista anatómica de la cabeza del ratón que muestra los huesos frontal y parietal. (B) Una vista anatómica de la pata del ratón que muestra la tibia, el peroné y la cabeza del peroné. (C) Ubicación de los puntos de acupuntura en la cabeza del ratón. (D) GV20 se encuentra en la línea media de la frente, en el punto medio entre las puntas de las orejas y directamente en la parte superior del hueso parietal. GV24 se encuentra en la línea media de la frente, justo antes de la unión de los huesos frontal y parietal. ST36 se encuentra en el lado exterior de la pata trasera, aproximadamente 2 mm por debajo de la cabeza del peroné. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Tratamiento de electroacupuntura. Los ratones se sometieron a estimulación con agujas en puntos específicos de GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) y ST36 bilateral (Zusanli) mientras estaban bajo anestesia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Resultados representativos de la prueba de campo abierto y la prueba de laberinto de agua después del tratamiento con electroacupuntura. (A) La prueba de campo abierto se llevó a cabo para evaluar los cambios de comportamiento en ratones sometidos a hipoxia crónica (HC) y acupuntura (EA). A partir de la prueba se generaron tres gráficos de trayectoria representativos. (B) La prueba del laberinto de agua se llevó a cabo para evaluar la memoria espacial de ratones sometidos a hipoxia crónica y tratamiento de acupuntura. A partir de la prueba se generaron tres gráficos de trayectoria representativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Examen histológico del cerebro de ratón después del tratamiento con electroacupuntura. Imágenes histológicas de los ratones del grupo de control (panel superior izquierdo), del grupo de hipoxia (panel superior derecho) y del grupo de tratamiento (panel inferior). Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La acupuntura, una práctica médica no farmacológica originaria de China hace más de 2.000 años, consiste en la inserción de agujas finas en puntos específicos del cuerpo conocidos como puntos de acupuntura. Se cree que estos puntos están conectados por canales o meridianos a través de loscuales fluye la energía vital del cuerpo, o "qi". Al estimular estos puntos, la acupuntura tiene como objetivo restaurar el equilibrio y la armonía del cuerpo. Se ha demostrado que trata eficazmente diversas afecciones, como el dolor crónico, la ansiedad/depresión, los problemas digestivos, los cólicos menstruales y los trastornos respiratorios 25,26,27,28,29. En los últimos años, la acupuntura ha surgido como una intervención terapéutica eficaz para las enfermedades neuronales, incluida la disfunción cognitiva. Múltiples estudios han demostrado su capacidad para modular los neurotransmisores, aumentar el flujo sanguíneo cerebral, reducir el estrés oxidativo y mejorar la neuroplasticidad 20,30,31,32. En consecuencia, se reconoce cada vez más como una opción de tratamiento segura y eficaz, especialmente cuando se utiliza junto con la atención médica convencional33. Sin embargo, a pesar de su larga historia y uso generalizado, el mecanismo de acción de la acupuntura sigue sin comprenderse por completo. Una teoría propone que la acupuntura estimula la liberación de endorfinas, los analgésicos naturales del cuerpo, aliviando así el dolor y promoviendo una sensación de bienestar34. Otra teoría sugiere que la acupuntura puede afectar el sistema nervioso autónomo, que regula varias funciones corporales involuntarias35,36. Aunque nuestra comprensión de los mecanismos de la acupuntura aún se está desarrollando, existe un creciente reconocimiento entre los científicos de que una metodología de laboratorio estandarizada para la acupuntura, especialmente utilizando modelos de roedores, es esencial para guiar la investigación en esta área.

La selección de un protocolo de anestesia apropiado es el paso inicial crucial en la realización de la acupuntura en un modelo de ratón. Los protocolos tradicionales a menudo implican anestesia continua de dosis altas, que puede tener efectos significativos en el sistema nervioso del ratón y puede dar lugar a resultados falsos negativos en las pruebas de comportamiento después del tratamiento de acupuntura. En este estudio, proponemos un protocolo mejorado que utiliza una caja de anestesia sellada para anestesiar con gas a los ratones hasta que pierdan el conocimiento. Posteriormente, se mantiene un estado estable utilizando un anestésico de baja dosis durante el tratamiento de acupuntura. Este método ayuda a minimizar las anomalías funcionales y conductuales causadas por la dosis excesiva de anestesia y mejora la precisión de los experimentos. Además, los investigadores pueden optar por el isoflurano en lugar de la ketamina y la xilacina, ya que ofrece un tiempo de recuperación más rápido y reduce los riesgos de toxicidad sistémica asociados con la ketamina y laxilacina. Sin embargo, es importante tener en cuenta que aún pueden producirse resultados falsos negativos causados por la anestesia. Incluso la anestesia leve que continúa durante 2 semanas consecutivas puede tener un impacto negativo en la cognición38. Con el fin de evaluar con mayor precisión la efectividad del tratamiento, los investigadores pueden incorporar un grupo adicional de ratones anestesiados que no reciben tratamiento para fines de comparación. Otro aspecto crítico del tratamiento de acupuntura en ratones es determinar la combinación de puntos de acupuntura. Los puntos de acupuntura comúnmente utilizados para las enfermedades del sistema nervioso central en humanos incluyen Baihui (GV20), Yintang (EX-HN3), Shenting (GV24) y Zusanli (ST36)39,40,41. En este estudio, nos enfocamos en la inclusión de Baihui (GV20), Shenting (GV24) y Zusanli (ST36) para el tratamiento. A pesar de los desafíos planteados por el pequeño tamaño de los ratones en la localización del punto de acupuntura, el posicionamiento articular basado en estructuras anatómicas demuestra ser un método eficaz. Por último, determinar la frecuencia e intensidad de estimulación adecuada es otro paso clave para realizar el tratamiento de acupuntura en ratones. En este estudio, se utilizó electroacupuntura de baja frecuencia a 2 Hz y una intensidad moderada de 2 mA. Aunque el resultado terapéutico de la acupuntura es evidente, se requiere una mayor exploración para comprender su mecanismo subyacente.

A pesar de las amplias aplicaciones potenciales de la acupuntura en el tratamiento de trastornos neurológicos, esta técnica tiene ciertas limitaciones. Una limitación es su alta dependencia de la experiencia del operador, lo que puede resultar en resultados subóptimos o daños para los sujetos experimentales cuando lo realizan operadores sin experiencia. Otra limitación es la necesidad de mejorar el tratamiento clínico de acupuntura para aumentar su efectividad. Actualmente, los investigadores están estudiando la combinación de la acupuntura con otras terapias, como las intervenciones farmacológicas y el entrenamiento cognitivo, con el fin de mejorar los resultados del tratamiento42. Además, los avances tecnológicos han llevado al desarrollo de nuevas técnicas, como la estimulación magnética transcraneal (EMT), que se puede utilizar junto con la acupuntura para mejorar aún más la función cognitiva43. A pesar de estas limitaciones, la acupuntura ha demostrado beneficios significativos en el tratamiento de diversos trastornos neurológicos y tiene un gran potencial para futuras aplicaciones, particularmente cuando se combina con otras terapias. Este artículo proporciona métodos detallados para construir un modelo de ratón de deterioro cognitivo crónico inducido por hipoxia, el proceso de tratamiento con acupuntura y métodos de pruebas conductuales. Estos métodos pueden ayudar a los investigadores a realizar estudios exhaustivos sobre la aplicación y el mecanismo de la acupuntura, promoviendo así el avance de la medicina tradicional china.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Programa de Ciencia y Tecnología de Hebei (No.E2020100001 y NO.22372502D), el Proyecto de Talento Empresarial y Innovación de Ciencia y Tecnología de Alto Nivel de Shijiazhuang (No. 07202203).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% paraformaldehyde solution Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd RL3234
ANY-maze Science  SA201 Video tracking system
C75BL/6J mice BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD No.110322220103041767 Gender: Male,  Weight: 18–22 g
Electroacupuncture device Great Wall KWD-808 I
Hwato acupuncture  needle Suzhou Medical Appliance Factory 2655519 
Isoflurane RWD Life Science Co.,Ltd R510-22
NanoZoomer Digital Pathology Hamamatsu Photonics K. K C9600-01
Small animal anesthesia machine RWD YL-LE-A106

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comportamiento Número 202 hipoxia crónica deterioro cognitivo anestesia leve medicina tradicional china no farmacológica
Tratamiento con acupuntura en un modelo murino de disfunción cognitiva inducida por hipoxia crónica
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Wan, F., Guo, Z., Wang, M., Hou, Y., Wang, L., Li, W., Kang, N., Zhu, P., Li, M. Acupuncture Treatment in a Mouse Model of Chronic Hypoxia-Induced Cognitive Dysfunction. J. Vis. Exp. (202), e65784, doi:10.3791/65784 (2023).

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