Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Лечение иглоукалыванием на мышиной модели хронической когнитивной дисфункции, вызванной гипоксией

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65784
Automatic Translation
*1, *2,3, 4, 5,6, 3,5, 4,7, 2,3, 8, 5,6
1Heilongjiang University of Chinese Medicine, 2Hebei Provincial Key Laboratory of Luobing, 3Key Laboratory of State Administration of TCM (Cardio-Cerebral Vessel Collateral Disease), 4Hebei University of Chinese Medicine, 5Shijiazhuang Compound Traditional Chinese Medicine Technology Innovation Center, 6National Key Laboratory of Luobing Research and Innovative Chinese Medicine, 7Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Ltd, 8The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

В этой статье мы опишем протокол применения мягкой анестезии и иглоукалывания на мышиной модели с хронической гипоксией и проведения поведенческих тестов для оценки когнитивных изменений после лечения.

Abstract

Лечение центральных нервных расстройств неизменно ставит перед медициной серьезные задачи. Иглоукалывание, нефармакологическая практика, уходящая корнями в традиционную китайскую медицину, включает в себя введение тонких игл в точные точки на теле и обычно используется для лечения различных заболеваний. В последнее время иглоукалывание стало многообещающим терапевтическим вмешательством при ряде неврологических заболеваний, включая тревожные и респираторные расстройства. Тем не менее, потенциал иглоукалывания в лечении когнитивной дисфункции, вызванной хронической гипоксией, еще не изучен. В данной работе представлен комплексный протокол для создания мышиной модели хронических когнитивных нарушений, вызванных гипоксией, введения мягкой анестезии, проведения лечения иглоукалыванием и оценки поведенческих изменений и способностей памяти с использованием тестов в открытом поле и водных лабиринтов. Пошаговый протокол содержит подробные инструкции по точному нахождению и позиционированию акупунктурных точек и игл для улучшения когнитивных функций. Используя этот протокол, исследователи могут проводить систематические исследования для тщательной оценки терапевтического потенциала иглоукалывания при когнитивной дисфункции.

Introduction

В настоящее время население планеты сталкивается с серьезной проблемой старения, что приводит к быстрому росту распространенности когнитивных расстройств. Распространенность когнитивных нарушений во всем мире составляет приблизительно 53,97 на 1000 человеко-лет1. Хроническая церебральная гипоксия, вызванная сосудистой дисфункцией или нарушениями кровообращения/дыхания, остается одним из основных факторов риска возрастной деменции2. Предыдущие исследования показали, что церебральная гипоксия может увеличивать отложение амилоидных β путем модификации экспрессии BACE13. Кроме того, гипоксия ассоциировалась с дисрегуляцией глиальных клеток и нейровоспалением 4,5. Несмотря на растущие масштабы этой проблемы, эффективных западных лекарств для предотвращения хронического снижения когнитивных функций, вызванных гипоксией, в настоящее время не существует. Нефармакологическая традиционная китайская медицина, в частности иглоукалывание, использовалась на протяжении тысячелетий для лечения когнитивных расстройств и показала многообещающие результаты в облегчении нейродегенеративныхзаболеваний. Акупунктурные точки Байхуэй, Шэньтин и Цзусанли являются эффективными точками для лечения когнитивной дисфункции 8,9. Клинические исследования показали, что электроакупунктурная терапия значительно улучшает показатели Монреальского когнитивного теста (MoCA) и мини-обследования психического состояния (MMSE) у пациентов с сосудистыми когнитивными нарушениями и эффективно улучшает когнитивную дисфункцию8. Несмотря на то, что исследования показали, что иглоукалывание может значительно улучшить способность к запоминанию у крыс с артериальной перевязкой (острая церебральная гипоксия, модель острой церебральной гипоксии), нет никаких сообщений о влиянии иглоукалывания ни на одной модели грызунов с хроническими когнитивными расстройствами, вызванными гипоксией. Отсутствие исследований этого механизма значительно затруднило его клиническое применение.

Предыдущие исследования показали, что воздействие на крыс гипоксической среды в течение 8 недель может значительно повысить уровень окислительного стресса и воспаления в головном мозге, что приводит кснижению функции памяти. Настоящее исследование направлено на изучение влияния иглоукалывания на модели грызунов с целью углубления нашего понимания. Однако стоит отметить, что анестезия, как правило, требуется во время лечения иглоукалыванием у грызунов из-за возможности возбуждения при повторной стимуляции. Длительная анестезия может значительно повлиять на когнитивные функции у мышей, поскольку большинство анестетиков могут подавлять нейронную активность и препятствовать обработке информации, что приводит кповеденческим нарушениям. Несколько исследований показали, что введение 2,5% севофлурана в течение 6 часов может заметно ухудшить пространственную память, способность к обучению и внимание у мышей13. Кроме того, данные свидетельствуют о том, что высокие дозы анестезии могут привести к гибели нейронов или повреждению нервов у мышей14. Поэтому крайне важно определить подходящий подход, чтобы свести к минимуму общий объем используемой анестезии. В этом исследовании мы представляем эффективный метод иглоукалывания для лечения мышей с когнитивными нарушениями, а также поведенческие тесты для оценки их способностей к памяти. Важно отметить, что мы представляем модифицированную технику анестезии перед лечением, которая позволяет эффективно снизить общую дозу анестезии, вводимой во время эксперимента.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты на животных проводились с одобрения Комитета по исследованиям и этике на животных Хэбэйского медицинского научно-исследовательского института Илина (номер разрешения: N2022148). Самцы мышей C57BL/6J массой 18-22 г (см. таблицу материалов) были размещены в новом центре оценки лекарственных средств Хэбэйского медицинского научно-исследовательского института Илин. Их обеспечивали нормальной пищей и чистой водой и подвергали воздействию искусственного света в течение 12 часов ежедневно. В помещениях поддерживался контролируемый температурный режим 20-26 °C и относительная влажность 40%-70%.

1. Создание мышиной модели хронической гипоксии (рис. 1)

  1. Перед началом эксперимента подготовьте клетки для животных при нормальном атмосферном давлении и клетки с непрерывной средой с низким содержанием кислорода. Создайте непрерывную среду с низким содержанием кислорода, используя автоматизированную систему подачи газа для промывки камеры смесью чистого кислорода и азота.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта система запрограммирована на управление электромагнитным переключателем клапана, тем самым обеспечивая точную подачу газа как по времени, так и по концентрации.
  2. Случайным образом разделите мышей на три группы: контрольную группу (Con), модельную группу (CH) и группу электроакупунктуры (EA + CH). Поместите контрольных и модельных/электроакупунктурных мышей отдельно в две клетки, по 10 мышей в каждой клетке. Поддерживайте световой цикл на уровне 12 ч/12 ч (светлый/темный).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В контрольной группе лечение или гипоксия не индуцированы. Модельную группу (СГ) составляют мыши с хронической гипоксией. В группу электроакупунктуры (ЭА + СН) входят мыши, индуцированные гипоксией, получавшие электроакупунктуру.
  3. При развитии хронической гипоксии установите параметры камеры с низким содержанием кислорода с помощью цифрового кислородомера для регулирования расхода газа и поддержания концентрации кислорода на уровне 10%. Помещайте животных в камеру с низким содержанием кислорода в 9:00 утра и удаляйте их в 17:00, что приводит к непрерывному воздействию кислорода в общей сложности 8 часов непрерывного воздействия низкого содержания кислорода в день в течение 3 месяцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При настройке подачи газообразного азота для снижения концентрации кислорода рекомендуется действовать медленно, чтобы предотвратить чрезмерное введение газообразного азота сразу, так как это приведет к гибели животных.
  4. Оцените модель когнитивной дисфункции, вызванной хронической гипоксией, с помощью гистологического исследования и поведенческих тестов: тестаоткрытого поля 15 и теставодного лабиринта 16.

2. Анестезия (рисунок 2)

  1. Подготовьте наркозный аппарат для мелких животных (см. Таблицу материалов) и грелку с постоянной температурой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время анестезии животные восприимчивы к гипотермии, что подчеркивает необходимость использования грелки постоянной температуры для изоляции.
  2. Поместите мышь в индукционный бокс для анестезии и быстро индуцируйте 2%-2,5% изофлурана в кислороде (см. Таблицу материалов) примерно на 1 минуту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта краткосрочная предварительная обработка является важным шагом для обеспечения того, чтобы мыши могли процветать при низкой дозировке в течение длительного периода времени.
  3. Как только возбудимость мыши снизится, зажмите мышь за палец, чтобы проверить ее рефлекс. Затем перенесите мышь на грелку с постоянной температурой (37 °C).
  4. Отрегулируйте скорость потока анестезии примерно до 0,5% концентрации. Подключите наркозный аппарат ко рту и носу мыши. Приступайте к лечению электроакупунктурой, обеспечивая при этом поддержание анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффект анестезии был подтвержден, когда мыши перестали моргать. Эффект от анестезии может длиться не менее 30 минут.

3. Лечение электроакупунктурой

  1. Чтобы эффективно улучшить когнитивную дисфункцию, выберите определенные акупунктурные точки, такие как Байхуэй (GV20), Шэньтин (GV24) и двусторонний Цзусанли (ST36), основываясь на теории традиционной китайской медицины и клиническом опыте (Рисунок 3). Проводите лечение электроакупунктурой за 2 недели до завершения процесса моделирования.
    1. Расположите акупунктурную точку GV20 на средней линии лба, в средней точке линии, соединяющей кончики ушей7. Глубина введения акупунктурной иглы должна быть 2 мм.
    2. Расположите акупунктурную точку GV24 на расстоянии 1,3 мм непосредственно над средней точкой глаз мыши на средней линии лба17. Глубина введения акупунктурной иглы должна быть 2 мм.
    3. Найдите акупунктурную точку ST36 на внешней стороне коленного сустава, примерно на 2 мм ниже головки малоберцовой кости18,19. Глубина введения акупунктурной иглы должна составлять 3-4 мм.
  2. Подготовьте одноразовые акупунктурные иглы (см. Таблицу материалов) и устройство для электроакупунктуры (см. Таблицу материалов) для процедуры (Рисунок 4).
  3. Поместите мышь в положение лежа на животе под легкой анестезией с 0,5% изофлураном, убедившись, что ее головы и конечности обездвижены. Держите иглу из нержавеющей стали (диаметр: 0,18 мм; длина: 7 мм) правой рукой, используя большой, указательный и средний пальцы.
  4. Выполняйте иглоукалывание в акупунктурных точках GV20 и GV24 поперечно на глубину 2 мм, приподнимая кожу на голове мыши левой рукой. Проколите акупунктурную точку ST36 вертикально на глубину 3-4 мм, прикоснувшись к головке малоберцовой кости на боковой стороне коленного сустава мыши и надавливая на кожу большим пальцем левой руки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для акупунктурных точек, расположенных на голове, рекомендуется вводить иглы в последовательности GV24, а затем GV20. Такой порядок способствует удобству эксплуатации. Акупунктурные точки представляют собой дискретные анатомические точки, а не стационарные точки. Следовательно, незначительные отклонения в угле введения иглы не влияют на терапевтическую эффективность, как это наблюдается у пациентов, получающих лечение электроакупунктурой в клинических условиях.
  5. Подключите электронное устройство для акупунктуры к иглам, подключив GV20 и левый ST36 к одному набору электродов, а GV24 и правый ST36 — к другому (рис. 4). Выберите режим непрерывной волны, с силой электрического тока 2 мА и частотой 2 Гц20,21. Подтвердите идеальное лечение, наблюдая за локальным легким тремором в акупунктурных точках и спокойной переносимостью мышью.
    1. При подключении электрического акупунктурного инструмента подсоедините проксимальный конец иглы. Это помогает свести к минимуму удары, вызванные весом соединительной линии, и, следовательно, улучшает предотвращение отсоединения иглы. При необходимости используйте клейкую ленту, чтобы закрепить горизонтально вставленную иглу и соединительную линию.
  6. Проводите ежедневную процедуру по 30 минут каждый день в течение 6 дней подряд, с одним днем отдыха между циклами лечения.

4. Испытание в открытом поле (Рисунок 5)

ПРИМЕЧАНИЕ: Тест в открытом поле является традиционным методом, используемым для оценки автономного поведения, исследовательского поведения, когнитивных способностей и тревожного поведения экспериментальных животных в новых и незнакомых условиях22. Он состоит из реакционного бокса открытого поля и регистрирующего устройства.

  1. Для проведения теста подготовьте белостенный куб размером 50 см × 50 см × 30 см, с разделением дна на 25 равных квадратов размером 10 см × 10 см.
  2. Поместите мышь в реакционную коробку открытого поля для акклиматизации. Позвольте мышке исследовать испытательную комнату и ознакомиться с новой обстановкой в период акклиматизации. Тест в открытом поле проводят после акклиматизации мыши к экспериментальной среде в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это гарантирует минимизацию беспокойства или стресса, вызванных изменениями в окружающей среде, что позволяет получить более точные результаты при последующих поведенческих оценках.
  3. Поместите мышь в центр коробки и наблюдайте за ней в течение 10 минут, после чего дайте мыши адаптироваться к окружающей среде в течение 2 минут.
    1. Используйте систему видеослежения (см. Таблицу материалов) для записи траектории движения мыши, общего пройденного расстояния, времени, проведенного в центральной зоне, скорости пересечения центральной области и количества входов в центральную область во время теста.
    2. Выполните соответствующие операции, как указано в руководстве по эксплуатации системы видеонаблюдения. Каждая мышь проходит один тест и начинает исследование с одного и того же места в коробке.
    3. После каждого теста очищайте коробку с открытым полем 75% этанолом, чтобы предотвратить ложные результаты, вызванные помехами запаха при использовании мыши.

5. Водный лабиринт (Рисунок 5)

ПРИМЕЧАНИЕ: Тест на водный лабиринт часто используется в качестве инструмента оценки поведения в экспериментах с участием мышей для оценки их возможностей к пространственному обучению и памяти23.

  1. Подготовьте круглую емкость для воды диаметром 120 см и глубиной 30 см. Разделите аквариум на четыре равных квадранта: I, II, III и IV. Если в эксперименте используются черные мыши, используйте резервуар с белой водой; Для белых мышей используйте черный резервуар для воды.
  2. Разместите шторы вокруг круглого резервуара для воды, чтобы мышь не видела исследователей во время теста.
  3. Расположите различные маркеры на верхней поверхности резервуара для воды в качестве визуальных подсказок для пространственной ориентации. Убедитесь, что эти маркеры остаются неподвижными на протяжении всего эксперимента, чтобы поддерживать согласованность.
  4. Установите круглую платформу диаметром 10 см в квадранте III резервуара для воды в качестве обозначенной целевой зоны. Убедитесь, что платформа может быть легко перемещена и закреплена в любом желаемом месте.
  5. На протяжении всего эксперимента вводите воду в резервуар, поддерживая температурный режим 22-24 °C.
    1. Следите за тем, чтобы уровень воды оставался на 1 см выше целевой платформы. Добавьте в воду 20%-ную концентрацию нетоксичного диоксида титана, чтобы добиться четкого контраста между черными мышами и белым фоном. Этот контраст облегчает запись камерой движений мыши и соответствующих параметров.
  6. Проведите 5-дневный тест непрерывного пространственного исследования, последовательно поместив каждую мышь в квадранты I, II, III и IV.
    1. Расположите мышь лицом к стене. Отойдите от лабиринта, чтобы мышь не использовала положение экспериментатора в качестве ориентира. Запишите время, которое требуется мыши, чтобы найти платформу.
    2. Если мышь не может найти подводную платформу в течение 90 секунд, направьте мышь к платформе и обеспечьте 30-секундный период обучения. Кроме того, запишите период задержки равным 90 с.
    3. Если мышь найдет подводную платформу в течение 90 с, дайте ей оставаться на платформе в течение 10 секунд для обучения, прежде чем вынимать ее из резервуара для воды.
    4. Высушите мышь полотенцем и верните ее в клетку.
    5. Меняйте положение каждой мыши в каждом квадранте каждые 20 минут. Запишите расстояние, скорость и время, затраченное каждой мышью на поиск платформы (период задержки), с помощью системы видеослежения (см. Таблицу материалов), выполняя соответствующие операции в соответствии с инструкциями в руководстве по продукту.
    6. Установите платформу на 1 см выше поверхности воды в 1-й день. Размещайте платформу на глубине 1 см ниже поверхности воды на 2-5 день.
  7. На 6-й день удалите платформу из целевого квадранта и проведите тест на пространственное исследование.
    1. Поместите мышь в квадрант I, чтобы свободно исследовать ее в течение 90 секунд. Компьютер записывает траекторию плавания мыши, время, проведенное в целевом квадранте, и количество раз, когда она пересекает платформу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму ошибки эксперимента, вызванные человеческим фактором, важно сохранить положение опорной точки фиксированным в эксперименте с водным лабиринтом. Кроме того, экспериментатор должен немедленно отступить после помещения мыши в воду. После завершения эксперимента мышей следует высушить полотенцем и поместить обратно в клетки для сохранения тепла.

6. Окрашивание гематоксилином и эозином (ГЭ) (рис. 6)

ПРИМЕЧАНИЕ: Гистологическое исследование области гиппокампа помогает оценить установление модели гипоксии и определить эффективность лечения иглоукалыванием.

  1. После поведенческого эксперимента обезболивайте мышь внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия в дозе 20 мг/кг и перфузии 10% раствором параформальдегида (см. таблицу материалов) для обеспечения полной перфузии организма. Изолируют ткань мозга и погружают ее в 10% раствор параформальдегида при комнатной температуре (RT) на 3 дня для достижения фиксации.
  2. Поместите образцы мозга в коробку для встраивания. В последующем обработанные образцы мозга промывают проточной водой в течение 6 ч.
  3. Используйте автоматизированный тканевый процессор для обезвоживания образцов с помощью серии спиртовых растворов с возрастающими концентрациями, а именно: 60% этанола в течение 1 ч, 70% этанола в течение 1 ч, 90% этанола в течение 1 ч, 95% этанола в течение 2 ч и, наконец, 100% этанола в течение 2 ч.
  4. Образцы тканей погружают в ксилол на 2 ч до достижения прозрачности. Впоследствии, после завершения процесса обезвоживания, переносят пермеабилизированные образцы в парафин, нагретый до 60 °С, в течение 3 ч. Наконец, встройте их в автоматический процессор.
  5. Используйте ротационный слайсер для получения секций размером 4 мкм. Затем срезы подвергают окрашиванию гематоксилином в течение 3-8 мин с последующим окрашиванием эозином в течение 1-3 мин.
  6. Последовательно переложите окрашенные участки в отдельные емкости с чистым спиртом и ксилолом. Затем запечатайте и закрепите окрашенные участки нейтральной десной при подготовке к патологоанатомическому исследованию под оптическим микроскопом.
  7. Используйте сканер слайдов (см. Таблицу материалов) для сканирования срезов. Затем используйте программное обеспечение для просмотра для получения результатов окрашивания HE для области гиппокампа. Сравните расположение нейронов и конденсацию ядер нейронов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Характеристика траекторий передвижения мышей в эксперименте в открытом поле
Карта траектории показывает, что мыши в нормальной группе демонстрируют глубокую склонность к исследованиям в незнакомой среде. Траектории их активности в основном сосредоточены в углах, охватывая при этом все открытое поле (левая панель). Напротив, группа мышей с моделью длительной гипоксии демонстрирует значительно сниженное желание исследовать новое окружение. Они преимущественно задерживаются в углах, не проявляя никакого исследовательского поведения по направлению к центру открытого поля (средняя панель). После лечения иглоукалыванием исследовательская активность мышей, вызванных гипоксией, улучшилась, и их поведение, направленное на движение к центру открытого поля, восстановилось (правая панель) (рис. 5А).

Характеристика пространственного обучения и памяти у мышей
В нормальной группе мыши проводили относительно больше времени в целевом квадранте и чаще пересекали платформу, как показано на карте траектории (левая панель). В группе мышей с длительной гипоксией наблюдались ослабленные возможности пространственной памяти по сравнению с нормальной группой, на что указывала их неспособность локализовать целевой квадрант в течение заданного времени (средняя панель). После лечения иглоукалыванием у мышей наблюдалось значительное улучшение возможностей пространственной памяти, вызванных гипоксией. Они демонстрировали более организованное исследовательское поведение и проводили заметно больше времени в целевом квадранте (правая панель) (рис. 5B).

Гистологическое исследование головного мозга мыши
В контрольной группе расположение нейронов в области гиппокампа мышей (верхняя левая панель) демонстрировало регулярность, тогда как в группе модели длительной гипоксии (верхняя правая панель) оно было нарушено. И наоборот, в группе лечения наблюдалось улучшение расположения нейронов (нижняя панель). Кроме того, в модельной группе наблюдалось усущение ядер нейронов мышей по сравнению с контрольной группой, но этот эффект был частично смягчен в группе лечения. (Рисунок 6).

Figure 1
Рисунок 1: Создание мышиной модели когнитивных нарушений, вызванных гипоксией. Мышей подвергали воздействию гипоксии с 1-го по 90-й день. Электроакупунктурная терапия проводилась ежедневно, начиная с 75-го дня, при этом каждый цикл лечения длился 6 дней и в общей сложности состоял из 2 циклов лечения. Между циклами был перерыв в 1 день. Поведенческое тестирование проводилось на 93-й день. Гистологическое исследование и поведенческое тестирование могут быть проведены на 65-е сутки для подтверждения установления модели в области гиппокампа. Сокращения: Пн: месяц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Анестезия перед электроакупунктурой. Перед проведением лечения электроакупунктурой мышей обезболивали с помощью наркозного устройства (А). Затем мышей помещали в камеру (В) с (С) 2% изофлураном в камере. (D) Продолжительность модифицированного метода анестезии была короче по сравнению с классическим методом анестезии. (E) У мышей, подвергнутых мягкой анестезии, сохраняется реакция на стимуляцию стопы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Анатомическое строение акупунктурных точек на голове мыши. На этом рисунке изображены анатомические положения GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) и ST36 (Zusanli) у мышей. (А) Анатомический снимок головы мыши с изображением лобной и теменной костей. (B) Анатомическое изображение ноги мыши, показывающее большеберцовую, малоберцовую и малоберцовую головки. (C) Расположение акупунктурных точек на голове мыши. (D) GV20 расположен на средней линии лба, в средней точке между кончиками ушей и непосредственно над теменной костью. GV24 расположен по средней линии лба, чуть кпереди от соединения лобной и теменной костей. ST36 расположен на внешней стороне задней ноги, примерно на 2 мм ниже головки малоберцовой кости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Лечение электроакупунктурой. Во время анестезии мышам проводили игольчатую стимуляцию в определенных точках на GV20 (Байхуэй), GV24 (Шэньтин) и двустороннем ST36 (Зусанли). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативные результаты теста в открытом поле и теста в водном лабиринте после лечения электроакупунктурой. (A) Тест в открытом поле был проведен для оценки поведенческих изменений у мышей, подвергшихся лечению хронической гипоксией (ХГ) и иглоукалыванием (ЭА). В результате теста были построены три репрезентативных графика траекторий. (B) Тест «водный лабиринт» был проведен для оценки пространственной памяти мышей, подвергшихся лечению хронической гипоксией и иглоукалыванием. В результате теста были построены три репрезентативных графика траекторий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Гистологическое исследование головного мозга мыши после лечения электроакупунктурой. Гистологические картины мышей в контрольной группе (верхняя левая панель), группе гипоксии (верхняя правая панель) и группе лечения (нижняя панель). Масштабные линейки: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Иглоукалывание, нефармакологическая медицинская практика, возникшая в Китае более 2000 лет назад, включает в себя введение тонких игл в определенные точки на теле, известные как акупунктурные точки. Считается, что эти точки соединены каналами или меридианами, покоторым течет жизненная энергия тела, или «ци». Стимулируя эти точки, иглоукалывание направлено на восстановление баланса и гармонии в организме. Было показано, что он эффективно лечит различные состояния, включая хроническую боль, тревогу/депрессию, проблемы с пищеварением, менструальные спазмы и респираторные расстройства 25,26,27,28,29. В последние годы иглоукалывание стало эффективным терапевтическим вмешательством при заболеваниях нейронов, включая когнитивную дисфункцию. Многочисленные исследования продемонстрировали его способность модулировать нейротрансмиттеры, увеличивать мозговой кровоток, уменьшать окислительный стресс и повышать нейропластичность 20,30,31,32. Следовательно, он все чаще признается безопасным и эффективным вариантом лечения, особенно при использовании наряду с традиционной медицинской помощью33. Однако, несмотря на свою долгую историю и широкое применение, механизм действия иглоукалывания остается до конца не изученным. Одна из теорий предполагает, что иглоукалывание стимулирует высвобождение эндорфинов, естественных обезболивающих средств организма, тем самым облегчая боль и способствуя ощущениюблагополучия. Другая теория предполагает, что иглоукалывание может влиять на вегетативную нервную систему, которая регулирует различные непроизвольные функции организма35,36. Несмотря на то, что наше понимание механизмов акупунктуры все еще развивается, среди ученых растет понимание того, что стандартизированная лабораторная методология иглоукалывания, особенно с использованием моделей грызунов, имеет важное значение для руководства исследованиями в этой области.

Выбор подходящего протокола анестезии является начальным решающим шагом в проведении иглоукалывания на мышиной модели. Традиционные протоколы часто включают непрерывную высокодозную анестезию, которая может оказать значительное влияние на нервную систему мыши и может привести к ложноотрицательным результатам поведенческого теста после лечения иглоукалыванием. В этом исследовании мы предлагаем улучшенный протокол, который использует герметичный наркозный бокс для газовой анестезии мышей до тех пор, пока они не потеряют сознание. Впоследствии стабильное состояние поддерживается с помощью низкодозированного анестетика во время лечения иглоукалыванием. Этот метод помогает свести к минимуму функциональные и поведенческие отклонения, вызванные чрезмерным дозированием анестезии, и повышает точность экспериментов. Кроме того, исследователи могут выбрать изофлуран вместо кетамина и ксилазина, поскольку он обеспечивает более быстрое время восстановления и снижает риск системной токсичности, связанный с кетамином и ксилазином37. Тем не менее, важно отметить, что ложноотрицательные результаты, вызванные анестезией, все же могут возникнуть. Даже легкая анестезия, продолжающаяся в течение 2 недель подряд, может оказать негативное влияние на когнитивные способности38. Для того, чтобы более точно оценить эффективность лечения, исследователи могут включить дополнительную группу мышей под наркозом, которые не получали лечения, для целей сравнения. Еще одним важным аспектом лечения иглоукалыванием у мышей является определение комбинации акупунктурных точек. Обычно используемые акупунктурные точки при заболеваниях центральной нервной системы у людей включают Байхуэй (GV20), Иньтан (EX-HN3), Шэнтин (GV24) и Цзусанли (ST36)39,40,41. В этом исследовании мы сосредоточились на включении Baihui (GV20), Shenting (GV24) и Zusanli (ST36) для лечения. Несмотря на трудности, связанные с небольшими размерами мышей при локализации акупунктурных точек, позиционирование суставов на основе анатомических структур оказывается эффективным методом. Наконец, определение подходящей частоты и интенсивности стимуляции является еще одним ключевым шагом в проведении лечения иглоукалыванием у мышей. В этом исследовании мы использовали низкочастотную электроакупунктуру с частотой 2 Гц и умеренной интенсивностью 2 мА. Несмотря на то, что терапевтический результат иглоукалывания очевиден, необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять его основной механизм.

Несмотря на широкий потенциал применения иглоукалывания в лечении неврологических расстройств, эта методика имеет определенные ограничения. Одним из ограничений является его высокая зависимость от опыта оператора, что может привести к неоптимальным результатам или вреду для испытуемых при выполнении неопытными операторами. Еще одним ограничением является необходимость совершенствования клинического лечения иглоукалыванием для повышения его эффективности. В настоящее время исследователи изучают комбинацию иглоукалывания с другими методами лечения, такими как фармакологические вмешательства и когнитивная тренировка, с целью улучшения результатовлечения. Кроме того, технический прогресс привел к разработке новых методов, таких как транскраниальная магнитная стимуляция (ТМС), которые могут быть использованы в сочетании с иглоукалыванием для дальнейшего улучшения когнитивныхфункций. Несмотря на эти ограничения, иглоукалывание показало значительные преимущества в лечении различных неврологических расстройств и имеет большой потенциал для будущего применения, особенно в сочетании с другими методами лечения. В данной статье подробно описаны методы построения мышиной модели хронических когнитивных нарушений, вызванных гипоксией, процесс лечения иглоукалыванием и методы поведенческого тестирования. Эти методы могут помочь исследователям в проведении тщательных исследований по применению и механизму иглоукалывания, тем самым способствуя развитию традиционной китайской медицины.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Научно-технической программой провинции Хэбэй (No E2020100001 и No 22372502D), Проектом высокого уровня по инновациям в области науки и технологий и предпринимательству Шицзячжуана (No 07202203).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% paraformaldehyde solution Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd RL3234
ANY-maze Science  SA201 Video tracking system
C75BL/6J mice BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD No.110322220103041767 Gender: Male,  Weight: 18–22 g
Electroacupuncture device Great Wall KWD-808 I
Hwato acupuncture  needle Suzhou Medical Appliance Factory 2655519 
Isoflurane RWD Life Science Co.,Ltd R510-22
NanoZoomer Digital Pathology Hamamatsu Photonics K. K C9600-01
Small animal anesthesia machine RWD YL-LE-A106

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pais, R., Ruano, L., Carvalho, O. P., Barros, H. Global cognitive impairment prevalence and incidence in community dwelling older adults- A systemic review. Geriatrics. 5 (4), Basel, Switzerland. 84 (2020).
  2. Tian, Z., Ji, X., Liu, J. Neuroinflammation in vascular cognitive impairment and dementia: Current evidence, advances, and prospects. International Journal of Molecular Sciences. 23 (11), 6224 (2022).
  3. Yuan, Y., et al. Activation of ERK-Drp1 signaling promotes hypoxia-induced Aβ accumulation by upregulating mitochondrial fission and BACE1 activity. FEBS open bio. 11 (10), 2740-2755 (2021).
  4. Zhu, X., et al. NLRP3 deficiency protects against hypobaric hypoxia induced neuroinflammation and cognitive dysfunction. Ecotoxicology and Environmental Safety. 255, 114828 (2023).
  5. Li, B., Dasgupta, C., Huang, L., Meng, X., Zhang, L. MiRNA-210 induces microglial activation and regulates microglia-mediated neuroinflammation in neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Cellular & Molecular Immunology. 17 (9), 976-991 (2020).
  6. Cai, M., Lee, J. H., Yang, E. J. Electro-acupuncture attenuates cognition impairment via anti-neuroinflammation in an Alzheimer's disease animal model. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 264 (2019).
  7. Xie, L., et al. Electro-acupuncture improves M2 microglia polarization and glia anti-inflammation of hippocampus in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 689629 (2021).
  8. Huang, L., et al. Effects of acupuncture on vascular cognitive impairment with no dementia: A randomized controlled trial. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 81 (4), 1391-1401 (2021).
  9. Xi, L., Fang, F., Yuan, H., Wang, D. Transcutaneous electrical acupoint stimulation for postoperative cognitive dysfunction in geriatric patients with gastrointestinal tumor: a randomized controlled trial. Trials. 22 (1), 563 (2021).
  10. Du, S. Q., et al. Acupuncture inhibits TXNIP-associated oxidative stress and inflammation to attenuate cognitive impairment in vascular dementia rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24 (1), 39-46 (2018).
  11. Zhang, C. E., et al. Hypoxia-induced tau phosphorylation and memory deficit in rats. Neuro-Degenerative Diseases. 14 (3), 107-116 (2014).
  12. Liang, X., Zhang, R. Effects of minocycline on cognitive impairment, hippocampal inflammatory response, and hippocampal Alzheimer's related proteins in aged rats after propofol anesthesia. Disease Markers. 2022, 4709019 (2022).
  13. Lee, J. R., et al. Effect of dexmedetomidine on sevoflurane-induced neurodegeneration in neonatal rats. British Journal of Anaesthesia. 126 (5), 1009-1021 (2021).
  14. Matsumoto, Y., Fujino, Y., Furue, H. Anesthesia and surgery induce a functional decrease in excitatory synaptic transmission in prefrontal cortex neurons, and intraoperative administration of dexmedetomidine does not elicit the synaptic dysfunction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 572, 27-34 (2021).
  15. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The open field test for measuring locomotor activity and anxiety-like behavior. Methods in Molecular Biology. 1916, Clifton, N.J. 99-103 (2019).
  16. Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2920 (2011).
  17. Lin, W., et al. TNEA therapy promotes the autophagic degradation of NLRP3 inflammasome in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease via TFEB/TFE3 activation. Journal of Neuroinflammation. 20 (1), 21 (2023).
  18. Liu, S., et al. A neuroanatomical basis for electro-acupuncture to drive the vagal-adrenal axis. Nature. 598 (7882), 641-645 (2021).
  19. Jang, J. H., et al. Acupuncture inhibits neuroinflammation and gut microbial dysbiosis in a mouse model of Parkinson's disease. Brain, Behavior, and Immunity. 89, 641-655 (2020).
  20. Dong, W., et al. Electro-acupuncture improves synaptic function in SAMP8 mice probably via inhibition of the AMPK/eEF2K/eEF2 signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2019, 8260815 (2019).
  21. Han, Y. G., et al. Electro-acupuncture prevents cognitive impairment induced by lipopolysaccharide via inhibition of oxidative stress and neuroinflammation. Neuroscience Letters. 683, 190-195 (2018).
  22. Zhang, Q., et al. Electro-acupuncture pre-treatment ameliorates anesthesia and surgery-induced cognitive dysfunction via inhibiting mitochondrial injury and neuroapoptosis in aged rats. Neurochemical Research. 47 (6), 1751-1764 (2022).
  23. Zheng, X., et al. Electro-acupuncture ameliorates beta-amyloid pathology and cognitive impairment in Alzheimer disease via a novel mechanism involving activation of TFEB (transcription factor EB). Autophagy. 17 (11), 3833-3847 (2021).
  24. Zhou, W., Benharash, P. Effects and mechanisms of acupuncture based on the principle of meridians. Journal of Acupuncture and Meridian Studies. 7 (4), 190-193 (2014).
  25. Sun, Y., et al. Efficacy of Acupuncture For Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome : A Randomized Trial. Annals of Internal Medicine. 174 (10), 1357-1366 (2021).
  26. Jung, J., et al. Lipidomics reveals that acupuncture modulates the lipid metabolism and inflammatory interaction in a mouse model of depression. Brain, Behavior, and Immunity. 94, 424-436 (2021).
  27. Yang, N. N., et al. Electro-acupuncture ameliorates intestinal inflammation by activating α7nAChR-mediated JAK2/STAT3 signaling pathway in postoperative ileus. Theranostics. 11 (9), 4078-4089 (2021).
  28. Shetty, G. B., Shetty, B., Mooventhan, A. Efficacy of acupuncture in the management of primary dysmenorrhea: A randomized controlled trial. Journal of Acupuncture and Meridian Studies. 11 (4), 153-158 (2018).
  29. Nurwati, I., Purwanto, B., Mudigdo, A., Saputra, K., Prasetyo, D. H., Muthmainah, M. Improvement in inflammation and airway remodelling after acupuncture at BL13 and ST36 in a mouse model of chronic asthma. Acupuncture in Medicine. 37 (4), 228-236 (2019).
  30. Li, P., et al. Acupuncture can play an antidepressant role by regulating the intestinal microbes and neurotransmitters in a rat model of depression. Medical Science Monitor. 27, 929027 (2021).
  31. Ding, N., Jiang, J., Xu, A., Tang, Y., Li, Z. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 13, 37 (2019).
  32. Yang, J. W., Wang, X. R., Ma, S. M., Yang, N. N., Li, Q. Q., Liu, C. Z. Acupuncture attenuates cognitive impairment, oxidative stress and NF-κB activation in cerebral multi-infarct rats. Acupuncture in Medicine. 37 (5), 283-291 (2019).
  33. Li, X., et al. Traditional Chinese acupoint massage, acupuncture, and moxibustion for people with diabetic gastroparesis: A systematic review and meta-analysis. Medicine. 101 (48), 32058 (2022).
  34. Yang, X. Y., et al. Effect of combined acupuncture-medicine anesthesia in thyroid nodule ablation and its effect on serum β-endorphin. Acupuncture Research. 45 (12), 1006-1009 (2020).
  35. Uchida, C., et al. Effects of Acupuncture Sensations on Transient Heart Rate Reduction and Autonomic Nervous System Function During Acupuncture Stimulation. Medical Acupuncture. 31 (3), 176-184 (2019).
  36. Liang, C., Wang, K. Y., Gong, M. R., Li, Q., Yu, Z., Xu, B. Electro-acupuncture at ST37 and ST25 induce different effects on colonic motility via the enteric nervous system by affecting excitatory and inhibitory neurons. Neurogastroenterology and Motility. 30 (7), 13318 (2018).
  37. Michelson, N. J., Kozai, T. Isoflurane and ketamine differentially influence spontaneous and evoked laminar electrophysiology in mouse V1. Journal of Neurophysiology. 120 (5), 2232-2245 (2018).
  38. Yu, X., Zhang, F., Shi, J. Sevoflurane anesthesia impairs metabotropic glutamate receptor-dependent long-term depression and cognitive functions in senile mice. Geriatrics & Gerontology International. 19 (4), 357-362 (2019).
  39. Jeong, J. H., et al. Investigation of combined treatment of acupuncture and neurofeedback for improving cognitive function in mild neurocognitive disorder: A randomized, assessor-blind, pilot study. Medicine. 100 (37), 27218 (2021).
  40. Lin, Y. K., Liao, H. Y., Watson, K., Yeh, T. P., Chen, I. H. Acupressure improves cognition and quality of life among older adults with cognitive disorders in long-term care settings: A clustered randomized controlled trial. Journal of the American Medical Directors Association. 24 (4), 548-554 (2023).
  41. Wu, W. Z., et al. Effect of Tongdu Tiaoshen acupuncture on serum GABA and CORT levels in patients with chronic insomnia. Chinese Acupuncture & Moxibustion. 41 (7), 721-724 (2021).
  42. Zhuo, P. Y., et al. Efficacy and safety of acupuncture combined with rehabilitation training for poststroke cognitive impairment: A systematic review and meta-analysis. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 32 (9), 107231 (2023).
  43. Li, R. Y., Huang, R. J., Yu, Q. Comparison of different physical therapies combined with acupuncture for poststroke cognitive impairment: A network meta-analysis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2021, 1101101 (2021).

Tags

Поведение Выпуск 202 хроническая гипоксия когнитивные нарушения легкая анестезия нефармакологическая традиционная китайская медицина
Лечение иглоукалыванием на мышиной модели хронической когнитивной дисфункции, вызванной гипоксией
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wan, F., Guo, Z., Wang, M., Hou, Y., … More

Wan, F., Guo, Z., Wang, M., Hou, Y., Wang, L., Li, W., Kang, N., Zhu, P., Li, M. Acupuncture Treatment in a Mouse Model of Chronic Hypoxia-Induced Cognitive Dysfunction. J. Vis. Exp. (202), e65784, doi:10.3791/65784 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter