Summary
Burada, kronik hipoksi fare modelinde hafif anestezi ve akupunktur tedavisi uygulamak ve tedavi sonrası bilişsel değişiklikleri değerlendirmek için davranışsal testler yapmak için bir protokol açıklıyoruz.
Abstract
Merkezi sinir bozukluklarının tedavisi, tıp alanında sürekli olarak önemli zorluklar ortaya çıkarmıştır. Geleneksel Çin tıbbına dayanan farmakolojik olmayan bir uygulama olan akupunktur, ince iğnelerin vücuttaki kesin noktalara sokulmasını gerektirir ve çeşitli koşulların yönetimi için yaygın olarak kullanılır. Son zamanlarda, akupunktur, anksiyete ve solunum bozuklukları da dahil olmak üzere bir dizi nörolojik hastalık için umut verici bir terapötik müdahale olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, kronik hipoksinin neden olduğu bilişsel işlev bozukluğunun tedavisinde akupunkturun potansiyeli henüz araştırılmamıştır. Bu makale, kronik hipoksiye bağlı bilişsel bozukluğun bir fare modelini oluşturmak, hafif anestezi uygulamak, akupunktur tedavisi yapmak ve açık alan testleri ve su labirentleri kullanarak davranış değişikliklerini ve hafıza yeteneklerini değerlendirmek için kapsamlı bir protokol sunmaktadır. Adım adım protokol, bilişsel gelişim için akupunktur noktalarının ve iğnelerin doğru bir şekilde konumlandırılması ve konumlandırılması hakkında ayrıntılı talimatlar sağlar. Araştırmacılar, bu protokolü kullanarak, bilişsel işlev bozukluğu için akupunkturun terapötik potansiyelini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için sistematik çalışmalar yürütebilirler.
Introduction
Küresel nüfus şu anda kritik bir yaşlanma sorunuyla karşı karşıyadır ve bu da bilişsel bozuklukların prevalansında hızlı bir artışa neden olmaktadır. Dünya çapında bilişsel bozukluk insidansı 1000 kişi-yıl başına yaklaşık 53,97'dir1. Vasküler disfonksiyon veya dolaşım/solunum bozukluklarının neden olduğu kronik serebral hipoksi, yaşa bağlı demans için en önemli risk faktörlerinden biri olmaya devam etmektedir2. Önceki çalışmalar, serebral hipoksinin BACE1 ekspresyonunu3 değiştirerek amiloid β birikimini artırabileceğini göstermiştir. Ek olarak, hipoksi, glial hücre düzensizliği ve nöroinflamasyonile ilişkilendirilmiştir 4,5. Bu sorunun artan büyüklüğüne rağmen, kronik hipoksiye bağlı bilişsel gerilemeyi önlemek için etkili Batı ilaçları şu anda eksiktir. Farmakolojik olmayan geleneksel Çin tıbbı, özellikle akupunktur, bilişsel bozuklukları tedavi etmek için binlerce yıldır kullanılmaktadır ve nörodejeneratif hastalıkların hafifletilmesinde umut verici sonuçlar göstermiştir 6,7. Baihui, Shenting ve Zusanli akupunktur noktaları, bilişsel işlev bozukluğunu tedavi etmek için etkili noktalardır 8,9. Klinik çalışmalar, elektro-akupunktur tedavisinin vasküler bilişsel bozukluğu olan hastalarda Montreal Bilişsel Değerlendirme (MoCA) ve Mini Zihinsel Durum Muayenesi (MMSE) puanlarını önemli ölçüde iyileştirdiğini ve bilişsel işlev bozukluğunu etkili bir şekilde iyileştirdiğini göstermiştir8. Çalışmalar, akupunkturun arteriyel ligasyonlu sıçanların hafıza yeteneğini önemli ölçüde artırabileceğini öne sürse de - akut serebral hipoksi modelleri10, akut serebral hipoksi modeli, kronik hipoksi kaynaklı bilişsel bozuklukları olan herhangi bir kemirgen modelinde akupunkturun etkileri hakkında bir rapor yoktur. Mekanizma ile ilgili araştırma eksikliği, klinik uygulamasını önemli ölçüde engellemiştir.
Önceki araştırmalar, sıçanların 8 haftalık bir süre boyunca hipoksik bir ortama maruz bırakılmasının beyindeki oksidatif stres ve iltihaplanma düzeylerini önemli ölçüde artırabileceğini ve bunun da hafıza fonksiyonunda bir düşüşe neden olabileceğini göstermiştir11. Bu çalışma, anlayışımızı ilerletmek için akupunkturun kemirgen modelleri üzerindeki etkisini araştırmayı amaçlamaktadır. Bununla birlikte, tekrarlanan stimülasyon sırasında ajitasyon potansiyeli nedeniyle kemirgenlerde akupunktur tedavisi sırasında tipik olarak anestezinin gerekli olduğunu belirtmek gerekir. Uzun süreli anestezi, farelerde bilişsel işlevi önemli ölçüde etkileyebilir, çünkü çoğu anestezik ilaç nöral aktiviteyi baskılayabilir ve bilgi işlemeyi engelleyerek davranışsal eksikliklere yol açabilir12. Birkaç çalışma, 6 saatlik bir süre boyunca% 2.5 sevofluran uygulanmasının farelerde uzamsal hafızayı, öğrenme yeteneğini ve dikkati önemli ölçüde bozabileceğini göstermiştir13. Ayrıca, kanıtlar yüksek dozda anestezinin farelerde nöronal ölüme veya sinir hasarına neden olabileceğini düşündürmektedir14. Bu nedenle, kullanılan toplam anestezi miktarını en aza indirmek için uygun bir yaklaşım belirlemek zorunludur. Bu çalışmada, bilişsel bozukluğu olan fareleri tedavi etmek için etkili bir akupunktur yöntemi ve hafıza yeteneklerini değerlendirmek için davranışsal testler sunuyoruz. Daha da önemlisi, deney sırasında uygulanan toplam anestezi dozunu etkili bir şekilde azaltabilen modifiye edilmiş bir tedavi öncesi anestezi tekniği sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri, Hebei Yiling Tıbbi Araştırma Enstitüsü Hayvan Araştırmaları ve Etik Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir (onay numarası: N2022148). 18-22 g ağırlığındaki erkek C57BL / 6J fareleri (Malzeme Tablosuna bakınız) Hebei Yiling Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nün yeni ilaç değerlendirme merkezine yerleştirildi. Onlara normal yiyecek ve temiz su sağlandı ve günde 12 saat yapay ışığa maruz bırakıldı. Odalar, 20-26 °C kontrollü bir sıcaklık aralığını ve% 40 -% 70 bağıl nemi korudu.
1. Kronik hipoksi fare modelinin kurulması (Şekil 1)
- Deneye başlamadan önce, normal atmosferik basınç altında hayvan kafesleri ve sürekli düşük oksijenli bir ortama sahip kafesler hazırlayın. Odayı saf oksijen ve nitrojen karışımıyla yıkamak için otomatik bir gaz kontrol dağıtım sistemi kullanarak sürekli düşük oksijenli bir ortam oluşturun.
NOT: Bu sistem, elektromanyetik valf anahtarını kontrol etmek için programlanmıştır, böylece hem zaman hem de konsantrasyon açısından gazın hassas bir şekilde iletilmesini sağlar. - Fareleri rastgele üç gruba ayırın: bir kontrol grubu (Con), bir model grubu (CH) ve bir elektro-akupunktur grubu (EA + CH). Kontrol ve model/elektro-akupunktur farelerini, kafes başına 10 fare olacak şekilde iki kafese ayrı ayrı yerleştirin. Işık döngüsünü 12 saat/12 saatte (aydınlık/koyu) koruyun.
NOT: Kontrol grubunda (Con) herhangi bir tedavi veya hipoksi indüklenmez. Model grubu (CH), kronik hipoksisi olan farelerden oluşur. Elektro-akupunktur grubu (EA + CH), elektro-akupunktur ile tedavi edilen hipoksi kaynaklı fareleri içerir. - Kronik hipoksi geliştirmek için, gaz akış hızını düzenlemek ve% 10'luk bir oksijen konsantrasyonunu korumak için bir dijital oksijen ölçer kullanarak düşük oksijen odasının parametrelerini oluşturun. Hayvanları sabah 9:00'da düşük oksijen odasına yerleştirin ve akşam 5:00'te çıkarın, böylece 3 ay boyunca günde toplam 8 saat kesintisiz düşük oksijene maruz kalın.
NOT: Oksijen konsantrasyonunu azaltmak için nitrojen gazı dağıtımını ayarlarken, hayvan ölümlerine yol açacağından, bir kerede aşırı nitrojen gazı girişini önlemek için yavaş ilerlemeniz önerilir. - Histoloji muayenesi ve davranış testleri kullanarak kronik hipoksiye bağlı bilişsel işlev bozukluğu modelini değerlendirin: açık alan testi15 ve su labirenti testi16.
2. Anestezi (Şekil 2)
- Küçük hayvan anestezi makinesini hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve sabit sıcaklıklı ısıtma yastığı.
NOT: Anestezi sırasında hayvanlar hipotermiye karşı hassastır ve bu da yalıtım için sabit sıcaklıkta bir ısıtma yastığı kullanılması gerekliliğinin altını çizer. - Fareyi anestezi indüksiyon kutusuna yerleştirin ve yaklaşık 1 dakika boyunca oksijende% 2 -% 2.5 izofluran ile hızlı bir şekilde indükleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Bu kısa süreli ön işlem, farelerin düşük konsantrasyonlu dozaj altında uzun süre gelişebilmesini sağlamak için çok önemli bir adımdır. - Uyarılabilirlikleri azaldığında, refleksini kontrol etmek için farenin ayak parmağını sıkıştırın. Ardından, fareyi sabit sıcaklıktaki ısıtma yastığına (37 °C) aktarın.
- Anestezi akış hızını yaklaşık% 0,5 konsantrasyona ayarlayın. Anestezi makinesini farenin ağzına ve burnuna bağlayın. Anestezinin sürdürülmesini sağlarken elektro-akupunktur tedavisine devam edin.
NOT: Anestezinin etkisi, farelerin yanıp sönmesi durduğunda doğrulandı. Anestezinin etkisi en az 30 dakika sürebilir.
3. Elektro-akupunktur tedavisi
- Bilişsel işlev bozukluğunu etkili bir şekilde iyileştirmek için, geleneksel Çin tıbbı teorisine ve klinik deneyime dayanarak Baihui (GV20), Shenting (GV24) ve bilateral Zusanli (ST36) gibi spesifik akupunktur noktalarını seçin (Şekil 3). Modelleme işleminin tamamlanmasından 2 hafta önce elektro-akupunktur tedavisi uygulayın.
- GV20 akupunktur noktasını alnın orta hattında, kulak uçlarını birleştiren bir çizginin orta noktasındabulun 7. Akupunktur iğnesi batırma derinliği 2 mm olmalıdır.
- GV24 akupunktur noktasını, alnın 1.3 orta çizgisinde, farenin gözlerinin orta noktasının17 mm üzerine yerleştirin. Akupunktur iğnesi batırma derinliği 2 mm olmalıdır.
- ST36 akupunktur noktasını diz ekleminin dış tarafında, fibula18,19 başının yaklaşık 2 mm altına yerleştirin. Akupunktur iğnesi batırma derinliği 3-4 mm olmalıdır.
- Prosedür için tek kullanımlık akupunktur iğneleri (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bir elektro-akupunktur cihazı (Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın (Şekil 4).
- Fareyi hafif anestezi altında% 0.5 izofluran ile yüzüstü pozisyona getirin, başlarının ve uzuvlarının hareketsiz olduğundan emin olun. Başparmak, işaret parmağı ve orta parmağı kullanarak paslanmaz çelik bir iğneyi (çap: 0,18 mm; uzunluk: 7 mm) sağ elinizle tutun.
- GV20 ve GV24 akupunktur noktalarında 2 mm derinlik için enine akupunktur uygulayın ve farenin kafasındaki cildi sol elinizle kaldırın. ST36 akupunktur noktasını, farenin diz ekleminin yan tarafındaki fibula kafasına dokunarak ve sol başparmağınızla cilde bastırarak 3-4 mm derinlik için dikey olarak delin.
NOT: Kafada bulunan akupunktur noktaları için, iğnelerin GV24 ve ardından GV20 dizisine yerleştirilmesi tavsiye edilir. Bu sipariş operasyonel kolaylığı kolaylaştırır. Akupunktur noktaları, durağan noktalardan ziyade ayrı anatomik konumlardır. Sonuç olarak, iğne batırma açısındaki hafif sapmaların, klinik ortamlarda elektro-akupunktur tedavisi alan hastalarda benzer şekilde görülen terapötik etkinlik üzerinde hiçbir etkisi yoktur. - Elektronik akupunktur cihazını, GV20 ve sol ST36 bir elektrot setine bağlı ve GV24 ve sağ ST36 diğerine bağlı olacak şekilde iğnelere bağlayın (Şekil 4). 2 mA elektrik akımı yoğunluğu ve 2 Hz20,21 frekansı ile sürekli dalga modunu seçin. Akupunktur noktalarında lokal hafif titremeleri ve farenin sessiz toleransını gözlemleyerek ideal tedaviyi onaylayın.
- Elektrikli akupunktur aletini bağlarken, iğnenin proksimal ucunu bağlayın. Bu, bağlantı hattının ağırlığının neden olduğu etkiyi en aza indirmeye yardımcı olur ve sonuç olarak iğne ayrılmasının önlenmesini iyileştirir. Gerekirse, yatay olarak yerleştirilmiş iğneyi ve bağlantı hattını sabitlemek için yapışkan bant kullanın.
- Günlük tedaviyi art arda 6 gün boyunca her gün 30 dakika uygulayın ve her tedavi döngüsü arasında tek bir gün dinlenin.
4. Açık alan testi (Şekil 5)
NOT: Açık alan testi, deney hayvanlarının yeni ve alışılmadık ortamlarda özerk davranışlarını, keşif davranışlarını, bilişsel yeteneklerini ve kaygı davranışlarını değerlendirmek için kullanılan geleneksel bir yöntemdir22. Bir açık alan reaksiyon kutusu ve bir kayıt cihazından oluşur.
- Testi yapmak için, 50 cm × 50 cm × 30 cm ölçülerinde beyaz duvarlı bir küp hazırlayın, alt kısmı 10 cm × 10 cm ölçülerinde 25 eşit kareye bölünsün.
- Alıştırma için fareyi açık alan reaksiyon kutusuna yerleştirin. Farenin test odasını keşfetmesine ve alışma döneminde yeni ortama alışmasına izin verin. Fareyi 1 saat boyunca deney ortamına alıştırdıktan sonra açık alan testini yapın.
NOT: Bu, ortamdaki değişikliklerin neden olduğu kaygı veya stresin en aza indirilmesini garanti eder, böylece sonraki davranışsal değerlendirmeler sırasında daha kesin sonuçlar elde edilmesini sağlar. - Fareyi kutunun ortasına yerleştirin ve farenin 2 dakika boyunca ortama uyum sağlamasına izin verdikten sonra 10 dakika boyunca izleyin.
- Test sırasında farenin hareket yörüngesini, kat edilen toplam mesafeyi, orta alanda geçirilen süreyi, orta alandan geçme hızını ve orta alana giriş sayısını kaydetmek için bir video izleme sistemi (Malzeme Tablosuna bakın) kullanın.
- Video takip sisteminin ürün kılavuzunda belirtildiği şekilde ilgili işlemleri gerçekleştirin. Her fare tek bir teste tabi tutulur ve kutunun içindeki aynı konumdan keşfe başlar.
- Her testten sonra, fare kullanırken koku parazitinden kaynaklanan yanlış sonuçları önlemek için açık alan kutusunu %75 etanol ile temizleyin.
5. Su labirenti (Şekil 5)
NOT: Su labirenti testi, farelerin uzamsal öğrenme ve hafıza yeteneklerini değerlendirmek için yapılan deneylerde davranışsal bir değerlendirme aracı olarak sıklıkla kullanılmaktadır23.
- 120 cm çapında ve 30 cm derinliğinde dairesel bir su deposu hazırlayın. Tankı dört eşit çeyreğe bölün: I, II, III ve IV. Deneyde siyah fare kullanıyorsanız, beyaz bir su deposu kullanın; Beyaz fareler için siyah su deposu kullanın.
- Test sırasında farenin araştırmacıları görmesini önlemek için dairesel su deposunun etrafına perdeler yerleştirin.
- Uzamsal yönlendirme için görsel ipuçları olarak su deposunun üst yüzeyine farklı işaretler yerleştirin. Tutarlılığı korumak için bu belirteçlerin deney boyunca sabit kaldığından emin olun.
- Belirlenen hedef alan olarak su deposunun III. çeyreğine 10 cm çapında dairesel bir platform yerleştirin. Platformun istenen herhangi bir yere kolayca taşınabilmesini ve emniyete alınabilmesini sağlayın.
- Deney boyunca, 22-24 °C sıcaklık aralığını korurken tanka su verin.
- Su seviyesinin sürekli olarak hedef platformun 1 cm üzerinde kaldığından emin olun. Siyah fareler ve beyaz arka plan arasında belirgin bir kontrast elde etmek için suya% 20 toksik olmayan titanyum dioksit konsantrasyonu ekleyin. Bu kontrast, kameranın farenin hareketlerini ve ilgili parametreleri kaydetmesini kolaylaştırır.
- Her fareyi sırayla I, II, III ve IV kadranlarına yerleştirerek 5 günlük sürekli uzamsal keşif testi gerçekleştirin.
- Fareyi duvara bakacak şekilde konumlandırın. Farenin deneycinin konumunu referans noktası olarak kullanmasını önlemek için labirentten uzaklaşın. Farenin platformu bulması için geçen süreyi kaydedin.
- Fare 90 saniye içinde su altı platformunu bulamazsa, fareyi platforma yönlendirin ve 30 saniyelik bir öğrenme süresi sağlayın. Ayrıca, gecikme süresini 90 sn olarak kaydedin.
- Fare su altı platformunu 90 saniye içinde bulursa, su tankından çıkarmadan önce öğrenmesi için 10 saniye platformda kalmasına izin verin.
- Fareyi bir havluyla kurulayın ve kafesine geri koyun.
- Her farenin yerleşimini her 20 dakikada bir her çeyrekte bir döndürün. Video izleme sistemini kullanarak her farenin yüzme mesafesini, hızını ve platformu bulmak için geçen süreyi (gecikme süresi) kaydedin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ürün kılavuzunda belirtildiği gibi ilgili işlemleri gerçekleştirin.
- Platformu 1. günde su yüzeyinden 1 cm yükseğe yerleştirin. Platformu 2-5. günlerde su yüzeyinin 1 cm altına yerleştirin.
- 6. Günde, platformu hedef kadrandan kaldırın ve bir uzamsal keşif testi yapın.
- 90 saniye boyunca özgürce keşfetmek için fareyi Çeyrek I'e yerleştirin. Bilgisayar, farenin yüzme yörüngesini, hedef kadranda harcanan zamanı ve platformu kaç kez geçtiğini kaydeder.
NOT: İnsan faktörlerinden kaynaklanan deneysel hataları en aza indirmek için, su labirenti deneyinde referans noktasının konumunu sabit tutmak önemlidir. Ek olarak, deneyci fareyi suya yerleştirdikten hemen sonra geri çekilmelidir. Deney tamamlandıktan sonra, fareler bir havlu ile kurutulmalı ve sıcaklığı korumak için kafeslerine geri yerleştirilmelidir.
- 90 saniye boyunca özgürce keşfetmek için fareyi Çeyrek I'e yerleştirin. Bilgisayar, farenin yüzme yörüngesini, hedef kadranda harcanan zamanı ve platformu kaç kez geçtiğini kaydeder.
6. Hematoksilen ve eozin (HE) boyaması (Şekil 6)
NOT: Hipokampal bölgenin histolojik muayenesi, hipoksi modelinin kurulmasına ve akupunktur tedavisinin etkinliğinin belirlenmesine yardımcı olur.
- Davranışsal deneyden sonra, fareyi 20 mg / kg pentobarbital sodyum intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun ve tam vücut perfüzyonunu sağlamak için% 10 paraformaldehit çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ile perfüze edin. Beyin dokusunu izole edin ve fiksasyonu sağlamak için 3 gün boyunca oda sıcaklığında (RT) %10 paraformaldehit çözeltisine daldırın.
- Beyin örneklerini bir gömme kutusuna yerleştirin. Daha sonra, işlenmiş beyin örneklerini 6 saat boyunca akan su ile yıkayın.
- 1 saat boyunca %60 etanol, 1 saat boyunca %70 etanol, 1 saat boyunca %90 etanol, 1 saat boyunca %90 etanol, 2 saat boyunca %95 etanol ve son olarak 2 saat boyunca %100 etanol gibi artan konsantrasyonlara sahip bir dizi alkol çözeltisi kullanarak numuneleri kurutmak için otomatik bir doku işlemcisi kullanın.
- Şeffaflık elde etmek için doku örneklerini 2 saat boyunca ksilene daldırın. Daha sonra, dehidrasyon işleminin tamamlanmasını takiben, geçirgen numuneleri 3 saat boyunca 60 ° C'ye ısıtılmış parafin mumuna aktarın. Son olarak, bunları otomatik bir işlemciye gömün.
- 4 μm'lik kesitler elde etmek için döner bir dilimleyici kullanın. Daha sonra, bölümleri 3-8 dakika arasında değişen bir süre boyunca hematoksilen boyamaya, ardından 1-3 dakika boyunca eozin boyamaya tabi tutun.
- Lekeli bölümleri sırayla ayrı saf alkol ve ksilen kaplarına aktarın. Ardından, optik mikroskop altında patolojik incelemeye hazırlanırken lekeli bölümleri nötr sakızla kapatın ve sabitleyin.
- Dilimleri taramak için bir slayt tarayıcı kullanın (Malzeme Tablosuna bakın). Daha sonra, hipokampal bölge için HE boyama sonuçlarını elde etmek için görüntüleme yazılımını kullanın. Nöronların düzenini ve nöronal çekirdeklerin yoğunlaşmasını karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açık alan deneyinde fare hareket yörüngelerini karakterize etme
Yörünge haritası, normal gruptaki farelerin, alışılmadık ortamlarda keşif için derin bir eğilim sergilediğini ortaya koymaktadır. Aktivite yörüngeleri, tüm açık alanı kaplarken (sol panel) öncelikle köşelerde yoğunlaşmıştır. Buna karşılık, uzun vadeli hipoksi model fare grubu, yeni çevreyi keşfetmek için önemli ölçüde azalmış bir istek gösterir. Açık alanın merkezine (orta panel) doğru herhangi bir keşif davranışı sergilemeden ağırlıklı olarak köşelerde oyalanırlar. Akupunktur tedavisini takiben, hipoksi ile indüklenen farelerin keşif aktivitesi iyileşme gösterir ve açık alanın merkezine doğru girişim davranışları eski haline getirilir (sağ panel) (Şekil 5A).
Farelerde uzamsal öğrenme ve hafızanın karakterizasyonu
Normal grupta, fareler hedef kadranda nispeten daha uzun bir süre geçirdiler ve yörünge haritasında (sol panel) gösterildiği gibi platformu daha sık geçtiler. Uzun süreli hipoksik model fare grubu, belirtilen süre içinde (orta panel) hedef kadranı bulamamalarıyla gösterildiği gibi, normal gruba kıyasla zayıflamış uzamsal bellek yetenekleri gösterdi. Akupunktur tedavisini takiben, fareler hipoksi kaynaklı uzamsal hafıza yeteneklerinde önemli bir gelişme gösterdi. Daha organize keşif davranışı sergilediler ve hedef kadranda (sağ panel) gözle görülür şekilde daha uzun zaman geçirdiler (Şekil 5B).
Fare beyninin histolojik incelemesi
Kontrol grubunda, farelerin hipokampal bölgesindeki (sol üst panel) nöronların düzenlenmesi düzenlilik gösterirken, uzun süreli hipoksik model grubunda (sağ üst panel) bozuldu. Tersine, tedavi grubu nöronların düzenlenmesinde bir iyileşme gösterdi (alt panel). Ayrıca, model grubu, kontrol grubuna kıyasla fare nöronal çekirdeklerinin daha şiddetli büzülmesini gösterdi, ancak bu etki tedavi grubunda kısmen hafifletildi. (Şekil 6).
Şekil 1: Hipoksiye bağlı bilişsel bozukluk için bir fare modelinin oluşturulması. Fareler 1. günden 90. güne kadar hipoksiye maruz bırakıldı. Elektrik akupunktur tedavisi 75. günden itibaren günlük olarak uygulandı, her tedavi döngüsü 6 gün sürdü ve toplam 2 tedavi döngüsü oldu. Döngüler arasında 1 günlük bir ara verildi. Davranış testi 93. günde yapıldı. Hipokampal bölgede modelin kurulduğunu doğrulamak için 65. günde histolojik muayene ve davranış testi yapılabilir. Kısaltmalar: Pzt: ay. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Elektro-akupunktur öncesi anestezi ön tedavisi. Elektro-akupunktur tedavisine başlamadan önce, fareler bir (A) anestezi cihazı kullanılarak uyuşturuldu. Fareler daha sonra haznede (C)% 2 İzofluran bulunan bir (B) hazne kutusuna yerleştirildi. (D) Modifiye anestezi yönteminin süresi klasik anestezi yöntemine göre daha kısaydı. (E) Hafif anesteziye maruz kalan fareler, ayak stimülasyonuna tepkilerini korurlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fare kafasındaki akupunktur noktalarının anatomik yapısı. Bu şekil, farelerde GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) ve ST36'nın (Zusanli) anatomik konumlarını göstermektedir. (A) Frontal ve parietal kemikleri gösteren fare kafasının anatomik görünümü. (B) Tibia, fibula ve fibula başını gösteren fare bacağının anatomik görünümü. (C) Fare kafasındaki akupunktur noktalarının yerleri. (D) GV20, alnın orta hattında, kulak uçları arasındaki orta noktada ve doğrudan parietal kemiğin üstünde bulunur. GV24, alnın orta hattında, frontal ve parietal kemiklerin birleştiği yerin hemen önünde bulunur. ST36, arka bacağın dış tarafında, fibula başının yaklaşık 2 mm altında bulunur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Elektro-akupunktur tedavisi. Farelere anestezi altındayken GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) ve bilateral ST36 (Zusanli) üzerinde belirli noktalarda iğne stimülasyonu uygulandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Elektro-akupunktur tedavisinden sonra açık alan testi ve su labirent testinin temsili sonuçları. (A) Açık alan testi, kronik hipoksi (CH) ve akupunktur (EA) tedavisine tabi tutulan farelerde davranış değişikliklerini değerlendirmek için yapılmıştır. Testten üç temsili yörünge grafiği oluşturuldu. (B) Su labirenti testi, kronik hipoksi ve akupunktur tedavisine maruz kalan farelerin uzamsal hafızasını değerlendirmek için yapılmıştır. Testten üç temsili yörünge grafiği oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Elektro-akupunktur tedavisi sonrası fare beyninin histolojik incelemesi. Kontrol grubundaki (sol üst panel), hipoksi grubundaki (sağ üst panel) ve tedavi grubundaki (alt panel) farelerin histolojik resimleri. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
2.000 yıldan uzun bir süre önce Çin'de ortaya çıkan farmakolojik olmayan bir tıbbi uygulama olan akupunktur, akupunktur noktaları olarak bilinen vücuttaki belirli noktalara ince iğnelerin sokulmasını içerir. Bu noktaların, vücudun hayati enerjisinin veya "qi"nin aktığı kanallar veya meridyenlerle birbirine bağlandığına inanılıyor24. Akupunktur bu noktaları uyararak vücuda denge ve uyumu yeniden kazandırmayı amaçlar. Kronik ağrı, anksiyete/depresyon, sindirim sorunları, adet krampları ve solunum bozuklukları dahil olmak üzere çeşitli durumları etkili bir şekilde tedavi ettiği gösterilmiştir 25,26,27,28,29. Son yıllarda akupunktur, bilişsel işlev bozukluğu da dahil olmak üzere nöronal hastalıklar için etkili bir terapötik müdahale olarak ortaya çıkmıştır. Çok sayıda çalışma, nörotransmiterleri modüle etme, serebral kan akışını artırma, oksidatif stresi azaltma ve nöroplastisiteyi artırma yeteneğini göstermiştir 20,30,31,32. Sonuç olarak, özellikle geleneksel tıbbi bakımla birlikte kullanıldığında, güvenli ve etkili bir tedavi seçeneği olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir33. Bununla birlikte, uzun geçmişine ve yaygın kullanımına rağmen, akupunkturun etki mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır. Bir teori, akupunkturun vücudun doğal ağrı kesicileri olan endorfin salınımını uyardığını, böylece ağrıyı hafiflettiğini ve esenlik duygusunu teşvik ettiğini öne sürmektedir34. Başka bir teori, akupunkturun çeşitli istemsiz bedensel işlevleri düzenleyen otonom sinir sistemini etkileyebileceğini düşündürmektedir35,36. Akupunkturun mekanizmaları hakkındaki anlayışımız hala gelişmekte olsa da, bilim adamları arasında, özellikle kemirgen modellerini kullanan akupunktur için standartlaştırılmış bir laboratuvar metodolojisinin, bu alandaki araştırmalara rehberlik etmek için gerekli olduğu konusunda artan bir kabul vardır.
Uygun bir anestezi protokolünün seçimi, bir fare modelinde akupunktur yapmanın ilk önemli adımıdır. Geleneksel protokoller genellikle farenin sinir sistemi üzerinde önemli etkileri olabilen ve akupunktur tedavisinden sonra yanlış negatif davranışsal test sonuçlarına neden olabilen sürekli yüksek doz anesteziyi içerir. Bu çalışmada, fareleri bilinçlerini kaybedene kadar gazla uyuşturmak için kapalı bir anestezi kutusu kullanan gelişmiş bir protokol öneriyoruz. Daha sonra, akupunktur tedavisi sırasında düşük doz anestezik kullanılarak stabil bir durum korunur. Bu yöntem, aşırı anestezi dozunun neden olduğu fonksiyonel ve davranışsal anormallikleri en aza indirmeye yardımcı olur ve deneylerin doğruluğunu artırır. Ek olarak, araştırmacılar, daha hızlı iyileşme süresi sunduğu ve ketamin ve ksilazin ile ilişkili sistemik toksisite risklerini azalttığı için ketamin ve ksilazin yerine izofluranı tercih edebilirler37. Bununla birlikte, anestezinin neden olduğu yanlış negatif sonuçların yine de ortaya çıkabileceğini unutmamak önemlidir. Art arda 2 hafta devam eden hafif anestezi bile biliş üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir38. Tedavinin etkinliğini daha doğru bir şekilde değerlendirmek için araştırmacılar, karşılaştırma amacıyla tedavi görmeyen ek bir anestezi uygulanmış fare grubunu dahil edebilirler. Farelerde akupunktur tedavisinin bir diğer kritik yönü, akupunktur noktalarının kombinasyonunu belirlemektir. İnsanlarda merkezi sinir sistemi hastalıkları için yaygın olarak kullanılan akupunktur noktaları arasında Baihui (GV20), Yintang (EX-HN3), Shenting (GV24) ve Zusanli (ST36)39,40,41 bulunur. Bu çalışmada Baihui (GV20), Shenting (GV24) ve Zusanli'nin (ST36) tedaviye dahil edilmesine odaklandık. Akupunktur noktası lokalizasyonunda farelerin küçük boyutlarının yarattığı zorluklara rağmen, anatomik yapılara dayalı eklem konumlandırmanın etkili bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Son olarak, uygun stimülasyon sıklığını ve yoğunluğunu belirlemek, farelerde akupunktur tedavisinin gerçekleştirilmesinde bir diğer önemli adımdır. Bu çalışmada 2 Hz'de ve 2 mA orta yoğunlukta düşük frekanslı elektro-akupunktur kullanıldı. Akupunkturun terapötik sonucu belirgin olmasına rağmen, altta yatan mekanizmayı anlamak için daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir.
Nörolojik bozuklukların tedavisinde akupunkturun geniş potansiyel uygulamalarına rağmen, bu tekniğin bazı sınırlamaları vardır. Bir sınırlama, operatörün deneyimine yüksek bağımlılığıdır, bu da deneyimsiz operatörler tarafından gerçekleştirildiğinde optimal olmayan sonuçlara veya deneysel deneklere zarar verebilir. Diğer bir sınırlama, etkinliğini arttırmak için klinik akupunktur tedavisinde iyileştirme ihtiyacıdır. Şu anda, araştırmacılar tedavi sonuçlarını iyileştirmek için akupunkturun farmakolojik müdahaleler ve bilişsel eğitim gibi diğer tedavilerle kombinasyonunu inceliyorlar42. Ek olarak, teknolojik gelişmeler, bilişsel işlevi daha da geliştirmek için akupunktur ile birlikte kullanılabilen transkraniyal manyetik stimülasyon (TMS) gibi yeni tekniklerin geliştirilmesine yol açmıştır43. Bu sınırlamalara rağmen, akupunktur çeşitli nörolojik bozuklukların tedavisinde önemli faydalar göstermiştir ve özellikle diğer tedavilerle birleştirildiğinde gelecekteki uygulamalar için büyük bir potansiyele sahiptir. Bu makale, kronik hipoksiye bağlı bilişsel bozukluğun bir fare modelini oluşturmak için ayrıntılı yöntemler, akupunktur tedavisi süreci ve davranışsal test yöntemleri sunmaktadır. Bu yöntemler, araştırmacılara akupunkturun uygulanması ve mekanizması hakkında kapsamlı çalışmalar yapmalarında yardımcı olabilir ve böylece geleneksel Çin tıbbının ilerlemesini teşvik edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Hebei'nin S&T Programı (NO.E2020100001 ve NO.22372502D), Shijiazhuang'ın Üst Düzey S & T İnovasyon ve Girişimcilik Yetenek Projesi (No. 07202203) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% paraformaldehyde solution | Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd | RL3234 | |
| ANY-maze | Science | SA201 | Video tracking system |
| C75BL/6J mice | BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD | No.110322220103041767 | Gender: Male, Weight: 18–22 g |
| Electroacupuncture device | Great Wall | KWD-808 I | |
| Hwato acupuncture needle | Suzhou Medical Appliance Factory | 2655519 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22 | |
| NanoZoomer Digital Pathology | Hamamatsu Photonics K. K | C9600-01 | |
| Small animal anesthesia machine | RWD | YL-LE-A106 |
References
- Pais, R., Ruano, L., Carvalho, O. P., Barros, H. Global cognitive impairment prevalence and incidence in community dwelling older adults- A systemic review. Geriatrics. 5 (4), Basel, Switzerland. 84 (2020).
- Tian, Z., Ji, X., Liu, J. Neuroinflammation in vascular cognitive impairment and dementia: Current evidence, advances, and prospects. International Journal of Molecular Sciences. 23 (11), 6224 (2022).
- Yuan, Y., et al. Activation of ERK-Drp1 signaling promotes hypoxia-induced Aβ accumulation by upregulating mitochondrial fission and BACE1 activity. FEBS open bio. 11 (10), 2740-2755 (2021).
- Zhu, X., et al. NLRP3 deficiency protects against hypobaric hypoxia induced neuroinflammation and cognitive dysfunction. Ecotoxicology and Environmental Safety. 255, 114828 (2023).
- Li, B., Dasgupta, C., Huang, L., Meng, X., Zhang, L. MiRNA-210 induces microglial activation and regulates microglia-mediated neuroinflammation in neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Cellular & Molecular Immunology. 17 (9), 976-991 (2020).
- Cai, M., Lee, J. H., Yang, E. J. Electro-acupuncture attenuates cognition impairment via anti-neuroinflammation in an Alzheimer's disease animal model. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 264 (2019).
- Xie, L., et al. Electro-acupuncture improves M2 microglia polarization and glia anti-inflammation of hippocampus in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 689629 (2021).
- Huang, L., et al. Effects of acupuncture on vascular cognitive impairment with no dementia: A randomized controlled trial. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 81 (4), 1391-1401 (2021).
- Xi, L., Fang, F., Yuan, H., Wang, D. Transcutaneous electrical acupoint stimulation for postoperative cognitive dysfunction in geriatric patients with gastrointestinal tumor: a randomized controlled trial. Trials. 22 (1), 563 (2021).
- Du, S. Q., et al. Acupuncture inhibits TXNIP-associated oxidative stress and inflammation to attenuate cognitive impairment in vascular dementia rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24 (1), 39-46 (2018).
- Zhang, C. E., et al. Hypoxia-induced tau phosphorylation and memory deficit in rats. Neuro-Degenerative Diseases. 14 (3), 107-116 (2014).
- Liang, X., Zhang, R. Effects of minocycline on cognitive impairment, hippocampal inflammatory response, and hippocampal Alzheimer's related proteins in aged rats after propofol anesthesia. Disease Markers. 2022, 4709019 (2022).
- Lee, J. R., et al. Effect of dexmedetomidine on sevoflurane-induced neurodegeneration in neonatal rats. British Journal of Anaesthesia. 126 (5), 1009-1021 (2021).
- Matsumoto, Y., Fujino, Y., Furue, H. Anesthesia and surgery induce a functional decrease in excitatory synaptic transmission in prefrontal cortex neurons, and intraoperative administration of dexmedetomidine does not elicit the synaptic dysfunction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 572, 27-34 (2021).
- Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The open field test for measuring locomotor activity and anxiety-like behavior. Methods in Molecular Biology. 1916, Clifton, N.J. 99-103 (2019).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2920 (2011).
- Lin, W., et al. TNEA therapy promotes the autophagic degradation of NLRP3 inflammasome in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease via TFEB/TFE3 activation. Journal of Neuroinflammation. 20 (1), 21 (2023).
- Liu, S., et al. A neuroanatomical basis for electro-acupuncture to drive the vagal-adrenal axis. Nature. 598 (7882), 641-645 (2021).
- Jang, J. H., et al. Acupuncture inhibits neuroinflammation and gut microbial dysbiosis in a mouse model of Parkinson's disease. Brain, Behavior, and Immunity. 89, 641-655 (2020).
- Dong, W., et al. Electro-acupuncture improves synaptic function in SAMP8 mice probably via inhibition of the AMPK/eEF2K/eEF2 signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2019, 8260815 (2019).
- Han, Y. G., et al. Electro-acupuncture prevents cognitive impairment induced by lipopolysaccharide via inhibition of oxidative stress and neuroinflammation. Neuroscience Letters. 683, 190-195 (2018).
- Zhang, Q., et al. Electro-acupuncture pre-treatment ameliorates anesthesia and surgery-induced cognitive dysfunction via inhibiting mitochondrial injury and neuroapoptosis in aged rats. Neurochemical Research. 47 (6), 1751-1764 (2022).
- Zheng, X., et al. Electro-acupuncture ameliorates beta-amyloid pathology and cognitive impairment in Alzheimer disease via a novel mechanism involving activation of TFEB (transcription factor EB). Autophagy. 17 (11), 3833-3847 (2021).
- Zhou, W., Benharash, P. Effects and mechanisms of acupuncture based on the principle of meridians. Journal of Acupuncture and Meridian Studies. 7 (4), 190-193 (2014).
- Sun, Y., et al. Efficacy of Acupuncture For Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome : A Randomized Trial. Annals of Internal Medicine. 174 (10), 1357-1366 (2021).
- Jung, J., et al. Lipidomics reveals that acupuncture modulates the lipid metabolism and inflammatory interaction in a mouse model of depression. Brain, Behavior, and Immunity. 94, 424-436 (2021).
- Yang, N. N., et al. Electro-acupuncture ameliorates intestinal inflammation by activating α7nAChR-mediated JAK2/STAT3 signaling pathway in postoperative ileus. Theranostics. 11 (9), 4078-4089 (2021).
- Shetty, G. B., Shetty, B., Mooventhan, A. Efficacy of acupuncture in the management of primary dysmenorrhea: A randomized controlled trial. Journal of Acupuncture and Meridian Studies. 11 (4), 153-158 (2018).
- Nurwati, I., Purwanto, B., Mudigdo, A., Saputra, K., Prasetyo, D. H., Muthmainah, M. Improvement in inflammation and airway remodelling after acupuncture at BL13 and ST36 in a mouse model of chronic asthma. Acupuncture in Medicine. 37 (4), 228-236 (2019).
- Li, P., et al. Acupuncture can play an antidepressant role by regulating the intestinal microbes and neurotransmitters in a rat model of depression. Medical Science Monitor. 27, 929027 (2021).
- Ding, N., Jiang, J., Xu, A., Tang, Y., Li, Z. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 13, 37 (2019).
- Yang, J. W., Wang, X. R., Ma, S. M., Yang, N. N., Li, Q. Q., Liu, C. Z. Acupuncture attenuates cognitive impairment, oxidative stress and NF-κB activation in cerebral multi-infarct rats. Acupuncture in Medicine. 37 (5), 283-291 (2019).
- Li, X., et al. Traditional Chinese acupoint massage, acupuncture, and moxibustion for people with diabetic gastroparesis: A systematic review and meta-analysis. Medicine. 101 (48), 32058 (2022).
- Yang, X. Y., et al. Effect of combined acupuncture-medicine anesthesia in thyroid nodule ablation and its effect on serum β-endorphin. Acupuncture Research. 45 (12), 1006-1009 (2020).
- Uchida, C., et al. Effects of Acupuncture Sensations on Transient Heart Rate Reduction and Autonomic Nervous System Function During Acupuncture Stimulation. Medical Acupuncture. 31 (3), 176-184 (2019).
- Liang, C., Wang, K. Y., Gong, M. R., Li, Q., Yu, Z., Xu, B. Electro-acupuncture at ST37 and ST25 induce different effects on colonic motility via the enteric nervous system by affecting excitatory and inhibitory neurons. Neurogastroenterology and Motility. 30 (7), 13318 (2018).
- Michelson, N. J., Kozai, T. Isoflurane and ketamine differentially influence spontaneous and evoked laminar electrophysiology in mouse V1. Journal of Neurophysiology. 120 (5), 2232-2245 (2018).
- Yu, X., Zhang, F., Shi, J. Sevoflurane anesthesia impairs metabotropic glutamate receptor-dependent long-term depression and cognitive functions in senile mice. Geriatrics & Gerontology International. 19 (4), 357-362 (2019).
- Jeong, J. H., et al. Investigation of combined treatment of acupuncture and neurofeedback for improving cognitive function in mild neurocognitive disorder: A randomized, assessor-blind, pilot study. Medicine. 100 (37), 27218 (2021).
- Lin, Y. K., Liao, H. Y., Watson, K., Yeh, T. P., Chen, I. H. Acupressure improves cognition and quality of life among older adults with cognitive disorders in long-term care settings: A clustered randomized controlled trial. Journal of the American Medical Directors Association. 24 (4), 548-554 (2023).
- Wu, W. Z., et al. Effect of Tongdu Tiaoshen acupuncture on serum GABA and CORT levels in patients with chronic insomnia. Chinese Acupuncture & Moxibustion. 41 (7), 721-724 (2021).
- Zhuo, P. Y., et al. Efficacy and safety of acupuncture combined with rehabilitation training for poststroke cognitive impairment: A systematic review and meta-analysis. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 32 (9), 107231 (2023).
- Li, R. Y., Huang, R. J., Yu, Q. Comparison of different physical therapies combined with acupuncture for poststroke cognitive impairment: A network meta-analysis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2021, 1101101 (2021).
