Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het implementeren van milde anesthesie- en acupunctuurbehandeling op een muismodel met chronische hypoxie en het uitvoeren van gedragstests om de cognitieve veranderingen na de behandeling te beoordelen.
Abstract
De behandeling van aandoeningen van het centrale zenuwstelsel heeft consequent aanzienlijke uitdagingen voor de medische wereld met zich meegebracht. Acupunctuur, een niet-farmacologische praktijk die geworteld is in de traditionele Chinese geneeskunde, omvat het inbrengen van fijne naalden op precieze punten op het lichaam en wordt vaak gebruikt voor de behandeling van verschillende aandoeningen. Onlangs is acupunctuur naar voren gekomen als een veelbelovende therapeutische interventie voor een reeks neurologische aandoeningen, waaronder angst en ademhalingsstoornissen. Het potentieel van acupunctuur bij de behandeling van cognitieve disfunctie veroorzaakt door chronische hypoxie is echter nog niet onderzocht. Dit artikel presenteert een uitgebreid protocol voor het opstellen van een muismodel van chronische hypoxie-geïnduceerde cognitieve stoornissen, het toedienen van milde anesthesie, het uitvoeren van acupunctuurbehandelingen en het beoordelen van gedragsveranderingen en geheugenvaardigheden met behulp van open veldtests en waterdoolhoven. Het stap-voor-stap protocol geeft gedetailleerde instructies voor het nauwkeurig lokaliseren en positioneren van acupunten en naalden voor cognitieve verbetering. Door dit protocol te gebruiken, kunnen onderzoekers systematische studies uitvoeren om het therapeutisch potentieel van acupunctuur voor cognitieve disfunctie grondig te evalueren.
Introduction
De wereldbevolking wordt momenteel geconfronteerd met een kritiek vergrijzingsprobleem, wat resulteert in een snelle toename van de prevalentie van cognitieve stoornissen. De wereldwijde incidentie van cognitieve stoornissen is ongeveer 53,97 per 1000 persoonsjaren1. Chronische cerebrale hypoxie veroorzaakt door vasculaire disfunctie of stoornissen in de bloedsomloop/luchtwegen blijft een van de belangrijkste risicofactoren voor ouderdomsdementie2. Eerdere studies hebben aangetoond dat cerebrale hypoxie de afzetting van amyloïde-β kan verhogen door de BACE1-expressie te wijzigen3. Bovendien is hypoxie in verband gebracht met ontregeling van gliacellen en neuro-inflammatie 4,5. Ondanks de groeiende omvang van dit probleem, ontbreken er momenteel effectieve westerse medicijnen voor het voorkomen van chronische hypoxie-geïnduceerde cognitieve achteruitgang. Niet-farmacologische traditionele Chinese geneeskunde, met name acupunctuur, wordt al duizenden jaren gebruikt om cognitieve stoornissen te behandelen en heeft veelbelovende resultaten opgeleverd bij het verlichten van neurodegeneratieve ziekten 6,7. De Baihui-, Shenting- en Zusanli-acupunten zijn effectieve punten voor de behandeling van cognitieve disfunctie 8,9. Klinische studies hebben aangetoond dat elektro-acupunctuurtherapie de Montreal Cognitive Assessment (MoCA) en Mini-Mental State Examination (MMSE)-scores bij patiënten met vasculaire cognitieve stoornissen aanzienlijk verbetert en cognitieve disfunctie effectief verbetert8. Hoewel studies hebben gesuggereerd dat acupunctuur het geheugenvermogen van ratten met arteriële ligatie aanzienlijk kan verbeteren - een acute cerebrale hypoxiemodellen10, een acuut cerebraal hypoxiemodel, is er geen rapport over de effecten van acupunctuur in een knaagdiermodel met chronische hypoxie-geïnduceerde cognitieve stoornissen. Het gebrek aan onderzoek naar het mechanisme heeft de klinische toepassing ervan aanzienlijk belemmerd.
Eerder onderzoek heeft aangetoond dat het onderwerpen van ratten aan een hypoxische omgeving gedurende een periode van 8 weken de niveaus van oxidatieve stress en ontsteking in de hersenen aanzienlijk kan verhogen, wat resulteert in een afname van de geheugenfunctie11. De huidige studie heeft tot doel de impact van acupunctuur op knaagdiermodellen te onderzoeken om ons begrip te vergroten. Het is echter vermeldenswaard dat anesthesie meestal vereist is tijdens acupunctuurbehandeling bij knaagdieren vanwege de kans op agitatie tijdens herhaalde stimulatie. Langdurige anesthesie kan de cognitieve functie bij muizen aanzienlijk beïnvloeden, aangezien de meeste anesthetica neurale activiteit kunnen onderdrukken en de informatieverwerking kunnen belemmeren, wat leidt tot gedragsstoornissen12. Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat het toedienen van 2,5% sevofluraan gedurende een duur van 6 uur het ruimtelijk geheugen, het leervermogen en de aandacht bij muizen aanzienlijk kan aantasten13. Bovendien zijn er aanwijzingen dat hoge doses anesthesie kunnen leiden tot neuronale dood of zenuwbeschadiging bij muizen14. Daarom is het absoluut noodzakelijk om een geschikte aanpak te vinden om de totale hoeveelheid gebruikte anesthesie te minimaliseren. In deze studie introduceren we een effectieve acupunctuurmethode voor de behandeling van muizen met cognitieve stoornissen, samen met gedragstests om hun geheugenvermogen te beoordelen. Belangrijk is dat we een aangepaste anesthesietechniek voor de behandeling presenteren die de totale dosering van anesthesie die tijdens het experiment wordt toegediend, effectief kan verminderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierproeven werden uitgevoerd met goedkeuring van de Commissie voor Dieronderzoek en Ethiek van het Hebei Yiling Medical Research Institute (erkenningsnummer: N2022148). Mannelijke C57BL/6J-muizen met een gewicht van 18-22 g (zie materiaaltabel) werden ondergebracht in het nieuwe geneesmiddelenevaluatiecentrum van het Hebei Yiling Medical Research Institute. Ze kregen normaal voedsel en schoon water en werden dagelijks 12 uur blootgesteld aan kunstlicht. De kamers handhaafden een gecontroleerd temperatuurbereik van 20-26 °C en een relatieve vochtigheid van 40%-70%.
1. Opstellen van een muismodel met chronische hypoxie (Figuur 1)
- Voordat u met het experiment begint, moeten de kooien van de dieren onder normale atmosferische druk en de kooien met een continue zuurstofarme omgeving worden voorbereid. Breng een continue zuurstofarme omgeving tot stand door gebruik te maken van een geautomatiseerd gasregelsysteem om de kamer te spoelen met een mengsel van zuivere zuurstof en stikstof.
NOTITIE: Dit systeem is geprogrammeerd om de elektromagnetische klepschakelaar te regelen, waardoor een nauwkeurige levering van gas wordt gegarandeerd, zowel in termen van tijd als concentratie. - Verdeel muizen willekeurig in drie groepen: een controlegroep (Con), een modelgroep (CH) en een elektro-acupunctuurgroep (EA + CH). Plaats controle- en model-/elektro-acupunctuurmuizen apart in de twee kooien, met 10 muizen per kooi. Houd de lichtcyclus aan op 12 uur/12 uur (licht/donker).
OPMERKING: Er wordt geen behandeling of hypoxie geïnduceerd in de controlegroep (Con). De modelgroep (CH) bestaat uit muizen met chronische hypoxie. De elektro-acupunctuurgroep (EA + CH) bestaat uit hypoxie-geïnduceerde muizen die worden behandeld met elektro-acupunctuur. - Voor het ontwikkelen van chronische hypoxie, stelt u de parameters van de zuurstofarme kamer vast door een digitale zuurstofmeter te gebruiken om het gasdebiet te regelen en een zuurstofconcentratie van 10% te handhaven. Plaats de dieren om 9.00 uur in de zuurstofarme kamer en verwijder ze om 17.00 uur, wat resulteert in een totaal van 8 uur ononderbroken blootstelling aan zuurstofarm per dag gedurende 3 maanden.
OPMERKING: Bij het instellen van de toevoer van stikstofgas om de zuurstofconcentratie te verlagen, wordt geadviseerd om langzaam te werk te gaan om een overmatige introductie van stikstofgas in één keer te voorkomen, aangezien dit zal leiden tot de dood van dieren. - Evalueer het chronische hypoxie-geïnduceerde cognitieve disfunctiemodel met behulp van histologieonderzoek en gedragstests: de open veldtest15 en de waterdoolhoftest16.
2. Anesthesie (Figuur 2)
- Bereid het anesthesieapparaat voor kleine dieren voor (zie Materiaaltabel) en het verwarmingskussen met constante temperatuur.
OPMERKING: Tijdens anesthesie zijn dieren vatbaar voor onderkoeling, wat de noodzaak onderstreept om een verwarmingskussen met constante temperatuur te gebruiken voor isolatie. - Plaats de muis in de anesthesie-inductiebox en induceer snel met 2%-2,5% isofluraan in zuurstof (zie Materiaaltabel) gedurende ongeveer 1 minuut.
OPMERKING: Deze kortdurende voorbehandeling is een cruciale stap om ervoor te zorgen dat muizen gedurende een langere periode kunnen gedijen onder een dosering met een lage concentratie. - Zodra hun prikkelbaarheid is afgenomen, knijpt u in de teen van de muis om zijn reflex te controleren. Breng vervolgens de muis over op het verwarmingskussen met constante temperatuur (37 °C).
- Pas het anesthesiedebiet aan op een concentratie van ongeveer 0.5%. Sluit het anesthesieapparaat aan op de mond en neus van de muis. Ga verder met een elektro-acupunctuurbehandeling terwijl u zorgt voor het behoud van de anesthesie.
OPMERKING: Het effect van anesthesie werd bevestigd toen de muizen stopten met knipperen. Het effect van anesthesie kan minstens 30 minuten aanhouden.
3. Elektro-acupunctuur behandeling
- Om cognitieve disfunctie effectief te verbeteren, selecteert u specifieke acupunten, zoals Baihui (GV20), Shenting (GV24) en bilaterale Zusanli (ST36), gebaseerd op de theorie van de traditionele Chinese geneeskunde en klinische ervaring (Figuur 3). Dien een elektro-acupunctuurbehandeling toe 2 weken voorafgaand aan de voltooiing van het modelleringsproces.
- Zoek het GV20-acupunt op de middellijn van het voorhoofd, in het midden van een lijn die de uiteinden van de oren verbindt7. De diepte van het inbrengen van de acupunctuurnaald moet 2 mm zijn.
- Plaats het GV24-acupunt 1.3 mm direct boven het middelpunt van de ogen van de muis op de middellijn van het voorhoofd17. De diepte van het inbrengen van de acupunctuurnaald moet 2 mm zijn.
- Zoek het ST36-acupunt aan de buitenkant van het kniegewricht, ongeveer 2 mm onder de kop van het kuitbeen18,19. De diepte van het inbrengen van de acupunctuurnaald moet 3-4 mm zijn.
- Bereid wegwerpacupunctuurnaalden (zie Materiaaltabel) en een elektro-acupunctuurapparaat (zie Materiaaltabel) voor op de procedure (Figuur 4).
- Plaats de muis in buikligging onder milde anesthesie met 0,5% isofluraan, zorg ervoor dat hun hoofd en ledematen geïmmobiliseerd zijn. Houd een roestvrijstalen naald (diameter: 0,18 mm; lengte: 7 mm) met de rechterhand vast met de duim, wijsvinger en middelvinger.
- Voer acupunctuur uit op de GV20- en GV24-acupunten dwars op een diepte van 2 mm, waarbij u met de linkerhand de huid op het hoofd van de muis optilt. Prik het ST36-acupunt verticaal voor een diepte van 3-4 mm door de fibulaire kop aan de laterale zijde van het kniegewricht van de muis aan te raken en met de linkerduim op de huid te drukken.
OPMERKING: Voor de acupunten op het hoofd is het raadzaam om de naalden in de volgorde van GV24 gevolgd door GV20 in te brengen. Deze bestelling vergemakkelijkt het bedieningsgemak. Acupunctuurpunten zijn discrete anatomische locaties in plaats van stationaire punten. Bijgevolg hebben kleine afwijkingen in de hoek van het inbrengen van de naald geen effect op de therapeutische effectiviteit, zoals ook wordt gezien bij patiënten die een elektro-acupunctuurbehandeling krijgen in een klinische setting. - Sluit het elektronische acupunctuurapparaat aan op de naalden, met GV20 en de linker ST36 aangesloten op de ene elektrodeset en GV24 en de rechter ST36 aangesloten op een andere (Figuur 4). Selecteer de continue golfmodus, met een elektrische stroomintensiteit van 2 mA en een frequentie van 2 Hz20,21. Bevestig de ideale behandeling door lokale milde tremoren op acupunten en stille tolerantie door de muis te observeren.
- Sluit bij het aansluiten van het elektrische acupunctuurinstrument het proximale uiteinde van de naald aan. Dit helpt de impact veroorzaakt door het gewicht van de verbindingslijn te minimaliseren en verbetert bijgevolg het voorkomen van het losraken van de naald. Gebruik indien nodig plakband om de horizontaal ingebrachte naald en de verbindingslijn vast te zetten.
- Dien de dagelijkse behandeling gedurende 30 minuten elke dag toe gedurende 6 opeenvolgende dagen, met één rustdag tussen elke behandelingscyclus.
4. Open veldtest (Figuur 5)
OPMERKING: De open veldtest is een conventionele methode die wordt gebruikt om het autonome gedrag, het verkennende gedrag, de cognitieve vaardigheden en het angstgedrag van proefdieren in nieuwe en onbekende omgevingen te beoordelen. Het bestaat uit een reactiebox in het open veld en een opnameapparaat.
- Om de test uit te voeren, bereidt u een kubus met witte wanden voor van 50 cm × 50 cm × 30 cm, waarbij de bodem is verdeeld in 25 gelijke vierkanten van 10 cm × 10 cm.
- Plaats de muis in de reactiebox in het open veld om te acclimatiseren. Laat de muis de testruimte verkennen en vertrouwd raken met de nieuwe omgeving tijdens de acclimatisatieperiode. Voer de openveldtest uit nadat de muis gedurende 1 uur aan de experimentele omgeving is geacclimatiseerd.
OPMERKING: Dit garandeert de minimalisering van angst of stress veroorzaakt door veranderingen in de omgeving, waardoor nauwkeurigere resultaten mogelijk zijn tijdens de daaropvolgende gedragsbeoordelingen. - Plaats de muis in het midden van de doos en houd deze gedurende 10 minuten in de gaten nadat u de muis 2 minuten aan de omgeving hebt laten wennen.
- Gebruik een videovolgsysteem (zie Materiaaltabel) om het bewegingstraject van de muis, de totale afgelegde afstand, de tijd die in het centrale gebied wordt doorgebracht, de snelheid waarmee het centrale gebied wordt overgestoken en het aantal ingangen in het centrale gebied tijdens de test vast te leggen.
- Voer de relevante handelingen uit volgens de instructies in de producthandleiding van het videovolgsysteem. Elke muis ondergaat een enkele test en begint met verkennen vanaf dezelfde locatie in de doos.
- Reinig na elke test de open veldbox met 75% ethanol om valse resultaten te voorkomen die worden veroorzaakt door geurinterferentie bij het gebruik van een muis.
5. Waterdoolhof (Figuur 5)
OPMERKING: De waterdoolhoftest wordt vaak gebruikt als een instrument voor gedragsbeoordeling in experimenten met muizen om hun ruimtelijk leer- en geheugenvermogen te evalueren23.
- Maak een rond waterreservoir met een diameter van 120 cm en een diepte van 30 cm. Verdeel de tank in vier gelijke kwadranten: I, II, III en IV. Als u zwarte muizen in het experiment gebruikt, gebruik dan een witwatertank; Gebruik voor witte muizen een zwartwatertank.
- Plaats gordijnen rond het ronde waterreservoir om te voorkomen dat de muis de onderzoekers tijdens de test ziet.
- Plaats verschillende markeringen op het bovenoppervlak van het waterreservoir als visuele aanwijzingen voor ruimtelijke oriëntatie. Zorg ervoor dat deze markers tijdens het experiment stationair blijven om de consistentie te behouden.
- Plaats een cirkelvormig platform met een diameter van 10 cm in kwadrant III van de watertank als het aangewezen doelgebied. Zorg ervoor dat het platform gemakkelijk kan worden verplaatst en op elke gewenste locatie kan worden vastgezet.
- Breng tijdens het experiment water in de tank met behoud van een temperatuurbereik van 22-24 °C.
- Zorg ervoor dat het waterniveau constant 1 cm boven het doelplatform blijft. Voeg een concentratie van 20% niet-giftig titaniumdioxide toe aan het water om een duidelijk contrast te bereiken tussen de zwarte muizen en de witte achtergrond. Dit contrast vergemakkelijkt de registratie door de camera van de bewegingen van de muis en relevante parameters.
- Voer een 5-daagse continue ruimtelijke verkenningstest uit door elke muis achtereenvolgens in kwadranten I, II, III en IV te plaatsen.
- Plaats de muis met het gezicht naar de muur. Ga weg van het doolhof om te voorkomen dat de muis de positie van de onderzoeker als referentiepunt gebruikt. Noteer de tijd die de muis nodig heeft om het platform te vinden.
- Als de muis er niet in slaagt het onderwaterplatform binnen 90 seconden te lokaliseren, leidt u de muis naar het platform en zorgt u voor een leerperiode van 30 seconden. Noteer bovendien de latentieperiode als 90 s.
- Als de muis het onderwaterplatform binnen 90 s lokaliseert, laat het dan 10 s op het platform blijven om te leren voordat u het uit het waterreservoir haalt.
- Droog de muis af met een handdoek en plaats hem terug in zijn kooi.
- Draai de plaatsing van elke muis in elk kwadrant elke 20 minuten. Noteer de zwemafstand, snelheid en tijd die elke muis nodig heeft om het platform te vinden (de latentieperiode) met behulp van het videovolgsysteem (zie Materiaaltabel), waarbij u de relevante bewerkingen uitvoert volgens de instructies in de producthandleiding.
- Zet het platform op dag 1 1 cm boven het wateroppervlak. Plaats het platform op dag 2-5 op een diepte van 1 cm onder het wateroppervlak.
- Verwijder op dag 6 het platform uit het doelkwadrant en voer een ruimtelijke verkenningstest uit.
- Plaats de muis in kwadrant I om 90 seconden lang vrij te verkennen. De computer registreert de zwembaan van de muis, de tijd die in het doelkwadrant wordt doorgebracht en het aantal keren dat de muis het platform passeert.
OPMERKING: Om experimentele fouten veroorzaakt door menselijke factoren tot een minimum te beperken, is het belangrijk om de positie van het referentiepunt in het waterdoolhofexperiment vast te houden. Bovendien moet de onderzoeker zich onmiddellijk terugtrekken nadat hij de muis in het water heeft geplaatst. Nadat het experiment is voltooid, moeten de muizen worden afgedroogd met een handdoek en terug in hun kooien worden geplaatst om de warmte vast te houden.
- Plaats de muis in kwadrant I om 90 seconden lang vrij te verkennen. De computer registreert de zwembaan van de muis, de tijd die in het doelkwadrant wordt doorgebracht en het aantal keren dat de muis het platform passeert.
6. Hematoxyline- en eosine (HE)-kleuring (Figuur 6)
OPMERKING: Histologisch onderzoek van het hippocampusgebied helpt bij het beoordelen van de vaststelling van het hypoxiemodel en het bepalen van de werkzaamheid van acupunctuurbehandeling.
- Verdoof de muis na het gedragsexperiment met een intraperitoneale injectie van 20 mg/kg pentobarbitalnatrium en doordrenk deze met 10% paraformaldehyde-oplossing (zie Materiaaltabel) om volledige lichaamsperfusie te garanderen. Isoleer het hersenweefsel en dompel het gedurende 3 dagen onder in 10% paraformaldehyde-oplossing bij kamertemperatuur (RT) om fixatie te bereiken.
- Plaats de hersenmonsters in een inbeddingsdoos. Was vervolgens de verwerkte hersenmonsters gedurende 6 uur met stromend water.
- Gebruik een geautomatiseerde weefselverwerker om de monsters te dehydrateren met behulp van een reeks alcoholoplossingen met toenemende concentraties, namelijk 60% ethanol gedurende 1 uur, 70% ethanol gedurende 1 uur, 90% ethanol gedurende 1 uur, 95% ethanol gedurende 2 uur en ten slotte 100% ethanol gedurende 2 uur.
- Dompel de weefselmonsters gedurende 2 uur onder in xyleen om transparantie te bereiken. Breng vervolgens, na voltooiing van het dehydratatieproces, de doormeabiliseerde monsters over naar paraffinewas die gedurende 3 uur tot 60 °C is verwarmd. Integreer ze ten slotte in een automatische processor.
- Gebruik een roterende snijmachine om secties van 4 μm te verkrijgen. Onderwerp vervolgens de secties aan hematoxylinekleuring gedurende een duur van 3-8 minuten, gevolgd door eosinekleuring gedurende 1-3 minuten.
- Breng de gekleurde delen achtereenvolgens over naar aparte containers met pure alcohol en xyleen. Verzegel en zet vervolgens de gekleurde delen vast met neutrale gom ter voorbereiding op pathologisch onderzoek onder een optische microscoop.
- Gebruik een diascanner (zie Tabel met materialen) om de plakjes te scannen. Gebruik vervolgens de weergavesoftware om de HE-kleuringsresultaten voor het hippocampusgebied te verkrijgen. Vergelijk de rangschikking van neuronen en de condensatie van neuronale kernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakteriseren van de bewegingstrajecten van muizen in het open veld experiment
De trajectkaart laat zien dat muizen in de normale groep een sterke neiging vertonen tot verkenning in onbekende omgevingen. Hun activiteitstrajecten zijn voornamelijk geconcentreerd in de hoeken en bestrijken het hele open veld (linkerpaneel). Daarentegen vertoont de langdurige hypoxie-modelgroep van muizen een significant verminderd verlangen om een nieuwe omgeving te verkennen. Ze blijven overwegend in de hoeken hangen zonder enig verkennend gedrag te vertonen naar het midden van het open veld (middenpaneel). Na acupunctuurbehandeling vertoont de verkennende activiteit van door hypoxie geïnduceerde muizen verbetering en wordt hun gedrag om zich naar het midden van het open veld te wagen hersteld (rechterpaneel) (Figuur 5A).
Karakterisering van ruimtelijk leren en geheugen bij muizen
In de normale groep brachten muizen relatief meer tijd door in het doelkwadrant en staken ze vaker het platform over, zoals weergegeven in de trajectkaart (linkerpaneel). De hypoxische modelgroep van muizen op lange termijn vertoonde een verzwakt ruimtelijk geheugen in vergelijking met de normale groep, zoals blijkt uit hun onvermogen om het doelkwadrant binnen de gespecificeerde tijd te lokaliseren (middelste paneel). Na acupunctuurbehandeling vertoonden de muizen een significante verbetering in hun door hypoxie geïnduceerde ruimtelijke geheugencapaciteiten. Ze vertoonden meer georganiseerd verkennend gedrag en brachten een merkbaar langere tijd door in het doelkwadrant (rechterpaneel) (Figuur 5B).
Histologisch onderzoek van muizenhersenen
In de controlegroep vertoonde de rangschikking van neuronen in het hippocampusgebied van muizen (paneel linksboven) regelmaat, terwijl het verstoord was in de groep met hypoxische modellen op lange termijn (paneel rechtsboven). Omgekeerd vertoonde de behandelingsgroep een verbetering in de rangschikking van neuronen (onderste paneel). Bovendien vertoonde de modelgroep een verergerde krimp van neuronale kernen van muizen in vergelijking met de controlegroep, maar dit effect werd gedeeltelijk verlicht in de behandelingsgroep. (Figuur 6).
Figuur 1: Opstellen van een muismodel voor hypoxie-geïnduceerde cognitieve stoornissen. De muizen werden van dag 1 tot dag 90 blootgesteld aan hypoxie. Vanaf dag 75 werd dagelijks elektrische acupunctuurtherapie toegediend, waarbij elke behandelingscyclus 6 dagen duurde en in totaal 2 behandelingscycli. Er was een pauze van 1 dag tussen de cycli. Gedragstesten werden uitgevoerd op dag 93. Histologisch onderzoek en gedragstesten kunnen op dag 65 worden uitgevoerd om de vestiging van het model in de hippocampus te bevestigen. Afkortingen: ma: maand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Anesthesievoorbehandeling voorafgaand aan elektro-acupunctuur. Voordat ze een elektro-acupunctuurbehandeling ondergingen, werden de muizen verdoofd met behulp van een (A) anesthesieapparaat. De muizen werden vervolgens in een (B) kamerdoos geplaatst met (C) 2% isofluraan in de kamer. (D) De duur van de aangepaste anesthesiemethode was korter in vergelijking met de klassieke anesthesiemethode. (E) Muizen die aan milde anesthesie worden onderworpen, behouden hun reactie op voetstimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Anatomische structuur van acupunctuurpunten op het hoofd van de muis. Deze figuur toont de anatomische posities van GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) en ST36 (Zusanli) bij muizen. (A) Een anatomische weergave van de muizenkop met de voorhoofds- en pariëtale botten. (B) Een anatomische weergave van de muispoot met het scheenbeen, het kuitbeen en de fibulaire kop. (C) Locaties van acupunctuurpunten op het hoofd van de muis. (D) GV20 bevindt zich op de middellijn van het voorhoofd, in het midden tussen de toppen van de oren en direct bovenop het pariëtale bot. GV24 bevindt zich op de middellijn van het voorhoofd, net voor de kruising van de frontale en pariëtale botten. ST36 bevindt zich aan de buitenkant van de achterpoot, ongeveer 2 mm onder de fibulaire kop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Elektro-acupunctuur behandeling. De muizen ondergingen naaldstimulatie op specifieke punten op GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) en bilaterale ST36 (Zusanli) terwijl ze onder narcose waren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve resultaten van de openveldtest en waterdoolhoftest na elektro-acupunctuurbehandeling. (A) De open veldtest werd uitgevoerd om de gedragsveranderingen te evalueren bij muizen die werden onderworpen aan chronische hypoxie (CH) en acupunctuur (EA) behandeling. Uit de test werden drie representatieve trajectplots gegenereerd. (B) De waterdoolhoftest werd uitgevoerd om het ruimtelijk geheugen te evalueren van muizen die werden onderworpen aan chronische hypoxie en acupunctuurbehandeling. Uit de test werden drie representatieve trajectplots gegenereerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Histologisch onderzoek van muizenhersenen na elektro-acupunctuurbehandeling. Histologische foto's van de muizen in de controlegroep (paneel linksboven), de hypoxiegroep (paneel rechtsboven) en de behandelingsgroep (paneel onder). Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Acupunctuur, een niet-farmacologische medische praktijk die meer dan 2,000 jaar geleden in China is ontstaan, omvat het inbrengen van dunne naalden op specifieke punten op het lichaam die bekend staan als acupunctuurpunten. Aangenomen wordt dat deze punten met elkaar verbonden zijn door kanalen of meridianen waardoor de vitale energie van het lichaam, of 'qi', stroomt. Door deze punten te stimuleren, heeft acupunctuur tot doel het evenwicht en de harmonie in het lichaam te herstellen. Het is aangetoond dat het verschillende aandoeningen effectief behandelt, waaronder chronische pijn, angst/depressie, spijsverteringsproblemen, menstruatiekrampen en ademhalingsstoornissen 25,26,27,28,29. In de afgelopen jaren is acupunctuur naar voren gekomen als een effectieve therapeutische interventie voor neuronale aandoeningen, waaronder cognitieve disfunctie. Meerdere onderzoeken hebben aangetoond dat het in staat is om neurotransmitters te moduleren, de cerebrale bloedstroom te verhogen, oxidatieve stress te verminderen en de neuroplasticiteit te verbeteren 20,30,31,32. Bijgevolg wordt het steeds meer erkend als een veilige en effectieve behandelingsoptie, vooral wanneer het naast conventionele medische zorg wordt gebruikt33. Ondanks de lange geschiedenis en het wijdverbreide gebruik ervan, blijft het werkingsmechanisme van acupunctuur echter onvolledig begrepen. Eén theorie stelt dat acupunctuur de afgifte van endorfines stimuleert, de natuurlijke pijnstillers van het lichaam, waardoor pijn wordt verlicht en een gevoel van welzijn wordt bevorderd34. Een andere theorie suggereert dat acupunctuur het autonome zenuwstelsel kan beïnvloeden, dat verschillende onwillekeurige lichaamsfuncties reguleert35,36. Hoewel ons begrip van de mechanismen van acupunctuur nog in ontwikkeling is, is er een groeiende erkenning onder wetenschappers dat een gestandaardiseerde laboratoriummethodologie voor acupunctuur, met name met behulp van knaagdiermodellen, essentieel is om onderzoek op dit gebied te begeleiden.
De selectie van een geschikt anesthesieprotocol is de eerste cruciale stap bij het uitvoeren van acupunctuur in een muismodel. Traditionele protocollen omvatten vaak continue hoge dosis anesthesie, die aanzienlijke effecten kan hebben op het zenuwstelsel van de muis en kan resulteren in vals-negatieve gedragstestresultaten na acupunctuurbehandeling. In deze studie stellen we een verbeterd protocol voor dat gebruik maakt van een verzegelde anesthesiedoos om de muizen te verdoezelen totdat ze het bewustzijn verliezen. Vervolgens wordt een stabiele toestand gehandhaafd met behulp van een lage dosis verdoving tijdens de acupunctuurbehandeling. Deze methode helpt functionele en gedragsafwijkingen veroorzaakt door overmatige dosering van anesthesie te minimaliseren en verbetert de nauwkeurigheid van de experimenten. Bovendien kunnen onderzoekers kiezen voor isofluraan in plaats van ketamine en xylazine, omdat het een snellere hersteltijd biedt en de systemische toxiciteitsrisico's van ketamine en xylazinevermindert37. Het is echter belangrijk op te merken dat vals-negatieve resultaten veroorzaakt door anesthesie nog steeds kunnen optreden. Zelfs milde anesthesie die 2 opeenvolgende weken aanhoudt, kan een negatieve invloed hebben op de cognitie38. Om de effectiviteit van de behandeling nauwkeuriger te evalueren, kunnen onderzoekers een extra groep verdoofde muizen opnemen die geen behandeling krijgen voor vergelijkingsdoeleinden. Een ander cruciaal aspect van acupunctuurbehandeling bij muizen is het bepalen van de combinatie van acupunten. Veelgebruikte acupunten voor ziekten van het centrale zenuwstelsel bij mensen zijn Baihui (GV20), Yintang (EX-HN3), Shenting (GV24) en Zusanli (ST36)39,40,41. In deze studie concentreerden we ons op de opname van Baihui (GV20), Shenting (GV24) en Zusanli (ST36) voor de behandeling. Ondanks de uitdagingen die de kleine omvang van muizen bij acupuntlokalisatie met zich meebrengt, blijkt gewrichtspositionering op basis van anatomische structuren een effectieve methode te zijn. Ten slotte is het bepalen van de juiste stimulatiefrequentie en -intensiteit een andere belangrijke stap bij het uitvoeren van acupunctuurbehandelingen bij muizen. In deze studie gebruikten we laagfrequente elektro-acupunctuur bij 2 Hz en een matige intensiteit van 2 mA. Hoewel het therapeutische resultaat van acupunctuur duidelijk is, is verder onderzoek nodig om het onderliggende mechanisme te begrijpen.
Ondanks de brede mogelijke toepassingen van acupunctuur bij de behandeling van neurologische aandoeningen, heeft deze techniek bepaalde beperkingen. Een beperking is de grote afhankelijkheid van de ervaring van de operator, wat kan leiden tot suboptimale resultaten of schade aan proefpersonen wanneer deze wordt uitgevoerd door onervaren operators. Een andere beperking is de noodzaak van verbetering van de klinische acupunctuurbehandeling om de effectiviteit ervan te vergroten. Momenteel bestuderen onderzoekers de combinatie van acupunctuur met andere therapieën, zoals farmacologische interventies en cognitieve training, om de behandelresultaten te verbeteren. Bovendien heeft technologische vooruitgang geleid tot de ontwikkeling van nieuwe technieken, zoals transcraniële magnetische stimulatie (TMS), die in combinatie met acupunctuur kunnen worden gebruikt om de cognitieve functie verder te verbeteren. Ondanks deze beperkingen heeft acupunctuur aanzienlijke voordelen aangetoond bij de behandeling van verschillende neurologische aandoeningen en heeft het een groot potentieel voor toekomstige toepassingen, vooral in combinatie met andere therapieën. Dit artikel biedt gedetailleerde methoden voor het construeren van een muismodel van chronische hypoxie-geïnduceerde cognitieve stoornissen, het proces van acupunctuurbehandeling en gedragstestmethoden. Deze methoden kunnen onderzoekers helpen bij het uitvoeren van grondige studies naar de toepassing en het mechanisme van acupunctuur, waardoor de vooruitgang van de traditionele Chinese geneeskunde wordt bevorderd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het W&T-programma van Hebei (nr. E2020100001 en nr. 22372502D), het W&T-talentproject op hoog niveau van Shijiazhuang (nr. 07202203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% paraformaldehyde solution | Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd | RL3234 | |
| ANY-maze | Science | SA201 | Video tracking system |
| C75BL/6J mice | BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD | No.110322220103041767 | Gender: Male, Weight: 18–22 g |
| Electroacupuncture device | Great Wall | KWD-808 I | |
| Hwato acupuncture needle | Suzhou Medical Appliance Factory | 2655519 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22 | |
| NanoZoomer Digital Pathology | Hamamatsu Photonics K. K | C9600-01 | |
| Small animal anesthesia machine | RWD | YL-LE-A106 |
References
- Pais, R., Ruano, L., Carvalho, O. P., Barros, H. Global cognitive impairment prevalence and incidence in community dwelling older adults- A systemic review. Geriatrics. 5 (4), Basel, Switzerland. 84 (2020).
- Tian, Z., Ji, X., Liu, J. Neuroinflammation in vascular cognitive impairment and dementia: Current evidence, advances, and prospects. International Journal of Molecular Sciences. 23 (11), 6224 (2022).
- Yuan, Y., et al. Activation of ERK-Drp1 signaling promotes hypoxia-induced Aβ accumulation by upregulating mitochondrial fission and BACE1 activity. FEBS open bio. 11 (10), 2740-2755 (2021).
- Zhu, X., et al. NLRP3 deficiency protects against hypobaric hypoxia induced neuroinflammation and cognitive dysfunction. Ecotoxicology and Environmental Safety. 255, 114828 (2023).
- Li, B., Dasgupta, C., Huang, L., Meng, X., Zhang, L. MiRNA-210 induces microglial activation and regulates microglia-mediated neuroinflammation in neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Cellular & Molecular Immunology. 17 (9), 976-991 (2020).
- Cai, M., Lee, J. H., Yang, E. J. Electro-acupuncture attenuates cognition impairment via anti-neuroinflammation in an Alzheimer's disease animal model. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 264 (2019).
- Xie, L., et al. Electro-acupuncture improves M2 microglia polarization and glia anti-inflammation of hippocampus in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 689629 (2021).
- Huang, L., et al. Effects of acupuncture on vascular cognitive impairment with no dementia: A randomized controlled trial. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 81 (4), 1391-1401 (2021).
- Xi, L., Fang, F., Yuan, H., Wang, D. Transcutaneous electrical acupoint stimulation for postoperative cognitive dysfunction in geriatric patients with gastrointestinal tumor: a randomized controlled trial. Trials. 22 (1), 563 (2021).
- Du, S. Q., et al. Acupuncture inhibits TXNIP-associated oxidative stress and inflammation to attenuate cognitive impairment in vascular dementia rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24 (1), 39-46 (2018).
- Zhang, C. E., et al. Hypoxia-induced tau phosphorylation and memory deficit in rats. Neuro-Degenerative Diseases. 14 (3), 107-116 (2014).
- Liang, X., Zhang, R. Effects of minocycline on cognitive impairment, hippocampal inflammatory response, and hippocampal Alzheimer's related proteins in aged rats after propofol anesthesia. Disease Markers. 2022, 4709019 (2022).
- Lee, J. R., et al. Effect of dexmedetomidine on sevoflurane-induced neurodegeneration in neonatal rats. British Journal of Anaesthesia. 126 (5), 1009-1021 (2021).
- Matsumoto, Y., Fujino, Y., Furue, H. Anesthesia and surgery induce a functional decrease in excitatory synaptic transmission in prefrontal cortex neurons, and intraoperative administration of dexmedetomidine does not elicit the synaptic dysfunction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 572, 27-34 (2021).
- Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The open field test for measuring locomotor activity and anxiety-like behavior. Methods in Molecular Biology. 1916, Clifton, N.J. 99-103 (2019).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2920 (2011).
- Lin, W., et al. TNEA therapy promotes the autophagic degradation of NLRP3 inflammasome in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease via TFEB/TFE3 activation. Journal of Neuroinflammation. 20 (1), 21 (2023).
- Liu, S., et al. A neuroanatomical basis for electro-acupuncture to drive the vagal-adrenal axis. Nature. 598 (7882), 641-645 (2021).
- Jang, J. H., et al. Acupuncture inhibits neuroinflammation and gut microbial dysbiosis in a mouse model of Parkinson's disease. Brain, Behavior, and Immunity. 89, 641-655 (2020).
- Dong, W., et al. Electro-acupuncture improves synaptic function in SAMP8 mice probably via inhibition of the AMPK/eEF2K/eEF2 signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2019, 8260815 (2019).
- Han, Y. G., et al. Electro-acupuncture prevents cognitive impairment induced by lipopolysaccharide via inhibition of oxidative stress and neuroinflammation. Neuroscience Letters. 683, 190-195 (2018).
- Zhang, Q., et al. Electro-acupuncture pre-treatment ameliorates anesthesia and surgery-induced cognitive dysfunction via inhibiting mitochondrial injury and neuroapoptosis in aged rats. Neurochemical Research. 47 (6), 1751-1764 (2022).
- Zheng, X., et al. Electro-acupuncture ameliorates beta-amyloid pathology and cognitive impairment in Alzheimer disease via a novel mechanism involving activation of TFEB (transcription factor EB). Autophagy. 17 (11), 3833-3847 (2021).
- Zhou, W., Benharash, P. Effects and mechanisms of acupuncture based on the principle of meridians. Journal of Acupuncture and Meridian Studies. 7 (4), 190-193 (2014).
- Sun, Y., et al. Efficacy of Acupuncture For Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome : A Randomized Trial. Annals of Internal Medicine. 174 (10), 1357-1366 (2021).
- Jung, J., et al. Lipidomics reveals that acupuncture modulates the lipid metabolism and inflammatory interaction in a mouse model of depression. Brain, Behavior, and Immunity. 94, 424-436 (2021).
- Yang, N. N., et al. Electro-acupuncture ameliorates intestinal inflammation by activating α7nAChR-mediated JAK2/STAT3 signaling pathway in postoperative ileus. Theranostics. 11 (9), 4078-4089 (2021).
- Shetty, G. B., Shetty, B., Mooventhan, A. Efficacy of acupuncture in the management of primary dysmenorrhea: A randomized controlled trial. Journal of Acupuncture and Meridian Studies. 11 (4), 153-158 (2018).
- Nurwati, I., Purwanto, B., Mudigdo, A., Saputra, K., Prasetyo, D. H., Muthmainah, M. Improvement in inflammation and airway remodelling after acupuncture at BL13 and ST36 in a mouse model of chronic asthma. Acupuncture in Medicine. 37 (4), 228-236 (2019).
- Li, P., et al. Acupuncture can play an antidepressant role by regulating the intestinal microbes and neurotransmitters in a rat model of depression. Medical Science Monitor. 27, 929027 (2021).
- Ding, N., Jiang, J., Xu, A., Tang, Y., Li, Z. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 13, 37 (2019).
- Yang, J. W., Wang, X. R., Ma, S. M., Yang, N. N., Li, Q. Q., Liu, C. Z. Acupuncture attenuates cognitive impairment, oxidative stress and NF-κB activation in cerebral multi-infarct rats. Acupuncture in Medicine. 37 (5), 283-291 (2019).
- Li, X., et al. Traditional Chinese acupoint massage, acupuncture, and moxibustion for people with diabetic gastroparesis: A systematic review and meta-analysis. Medicine. 101 (48), 32058 (2022).
- Yang, X. Y., et al. Effect of combined acupuncture-medicine anesthesia in thyroid nodule ablation and its effect on serum β-endorphin. Acupuncture Research. 45 (12), 1006-1009 (2020).
- Uchida, C., et al. Effects of Acupuncture Sensations on Transient Heart Rate Reduction and Autonomic Nervous System Function During Acupuncture Stimulation. Medical Acupuncture. 31 (3), 176-184 (2019).
- Liang, C., Wang, K. Y., Gong, M. R., Li, Q., Yu, Z., Xu, B. Electro-acupuncture at ST37 and ST25 induce different effects on colonic motility via the enteric nervous system by affecting excitatory and inhibitory neurons. Neurogastroenterology and Motility. 30 (7), 13318 (2018).
- Michelson, N. J., Kozai, T. Isoflurane and ketamine differentially influence spontaneous and evoked laminar electrophysiology in mouse V1. Journal of Neurophysiology. 120 (5), 2232-2245 (2018).
- Yu, X., Zhang, F., Shi, J. Sevoflurane anesthesia impairs metabotropic glutamate receptor-dependent long-term depression and cognitive functions in senile mice. Geriatrics & Gerontology International. 19 (4), 357-362 (2019).
- Jeong, J. H., et al. Investigation of combined treatment of acupuncture and neurofeedback for improving cognitive function in mild neurocognitive disorder: A randomized, assessor-blind, pilot study. Medicine. 100 (37), 27218 (2021).
- Lin, Y. K., Liao, H. Y., Watson, K., Yeh, T. P., Chen, I. H. Acupressure improves cognition and quality of life among older adults with cognitive disorders in long-term care settings: A clustered randomized controlled trial. Journal of the American Medical Directors Association. 24 (4), 548-554 (2023).
- Wu, W. Z., et al. Effect of Tongdu Tiaoshen acupuncture on serum GABA and CORT levels in patients with chronic insomnia. Chinese Acupuncture & Moxibustion. 41 (7), 721-724 (2021).
- Zhuo, P. Y., et al. Efficacy and safety of acupuncture combined with rehabilitation training for poststroke cognitive impairment: A systematic review and meta-analysis. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 32 (9), 107231 (2023).
- Li, R. Y., Huang, R. J., Yu, Q. Comparison of different physical therapies combined with acupuncture for poststroke cognitive impairment: A network meta-analysis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2021, 1101101 (2021).
