Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Reprogrammierung von duktalen Adenokarzinomen der Bauchspeicheldrüse (PDAC) und normalen duktalen Epithelzellen der Bauchspeicheldrüse in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs). Wir bieten ein optimiertes und detailliertes Schritt-für-Schritt-Verfahren, von der Vorbereitung des Lentivirus bis zur Etablierung stabiler iPSC-Linien.
Abstract
Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung von Transkriptionsfaktoren wurde aus fast jedem differenzierten Zelltyp erreicht und hat sich für Forschung und klinische Anwendungen als sehr wertvoll erwiesen. Interessanterweise hat sich gezeigt, dass die iPSC-Reprogrammierung von Krebszellen, wie z. B. dem duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC), den invasiven PDAC-Phänotyp umkehrt und das Krebsepigenom außer Kraft setzt. Die Differenzierung von PDAC-abgeleiteten iPSCs kann die PDAC-Progression von ihrem frühen Pankreas-Intraepithelneoplasie-Vorläufer (PanIN) rekapitulieren und die molekularen und zellulären Veränderungen aufdecken, die früh während der PDAC-Progression auftreten. Daher können PDAC-abgeleitete iPSCs verwendet werden, um die frühesten Stadien von PDAC für die Entdeckung von diagnostischen Markern für die Früherkennung zu modellieren. Dies ist besonders wichtig für PDAC-Patienten, die in der Regel in den späten metastasierenden Stadien diagnostiziert werden, da es an zuverlässigen Biomarkern für die früheren PanIN-Stadien mangelt. Die Reprogrammierung von Krebszelllinien, einschließlich PDAC, in Pluripotenz bleibt jedoch eine Herausforderung, arbeitsintensiv und variiert stark zwischen verschiedenen Linien. Hier beschreiben wir ein konsistenteres Protokoll zur Erzeugung von iPSCs aus verschiedenen humanen PDAC-Zelllinien unter Verwendung von bicistronischen lentiviralen Vektoren. Die resultierenden iPSC-Linien sind stabil und zeigen keine Abhängigkeit von der exogenen Expression von Reprogrammierungsfaktoren oder induzierbaren Medikamenten. Insgesamt erleichtert dieses Protokoll die Generierung einer breiten Palette von PDAC-abgeleiteten iPSCs, was für die Entdeckung früher Biomarker, die spezifischer und repräsentativer für PDAC-Fälle sind, unerlässlich ist.
Introduction
Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist eine der tödlichsten Malignome, und eine frühzeitige Diagnose bleibt aufgrund der asymptomatischen Natur der Krankheit eine Herausforderung. Die Mehrheit der PDAC-Patienten wird im fortgeschrittenen metastasierenden Stadium diagnostiziert, wenn nur sehr begrenzte Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung stehen 1,2. Dies ist hauptsächlich auf den Mangel an zuverlässigen Biomarkern für die früheren Stadien zurückzuführen, z. B. solche, die bequem als Proteine nachgewiesen werden könnten, die in den Blutkreislauf freigesetzt werden.
PDAC kann sich sehr früh während seines Fortschreitens ausbreiten, und eine bessere Prognose wurde mit der Krebsfrüherkennung in Verbindung gebracht, wenn PDAC in der Bauchspeicheldrüse lokalisiert ist3. Bei weniger als einem Zehntel der PDAC-Patienten wird jedoch eine günstige Prognose diagnostiziert, die eine chirurgische Resektion ermöglicht. Nichtsdestotrotz sind die wenigen mit resezierbaren Tumoren auch anfällig für ein Wiederauftreten des Tumors innerhalb von 12 Monaten4.
In den letzten fünf Jahrzehnten wurden bemerkenswerte Verbesserungen bei den Operationstechniken, der Patientenversorgung und den Behandlungsmodalitäten erzielt 5,6. Die 5-Jahres-Überlebensrate bei chirurgisch resezierten PDAC-Patienten ist jedoch kaum auf 17% gestiegen. Dies ist jedoch immer noch besser als bei nicht resezierten Patienten, die nahezu unverändert geblieben sind (0,9 %)4,7. Die Chemotherapie ist die einzige andere alternative PDAC-Behandlung. Diese Option ist jedoch sehr begrenzt, da die große Mehrheit der PDAC-Patienten eine starke Resistenz gegen Chemotherapeutika wie Gemcitabinaufweist 7,8. Andere Medikamente, wie Erlotinib, stehen nur einer kleinen Gruppe von PDAC-Patienten mit spezifischen Mutationen zur Verfügung, von denen die meisten eine Erlotinib-Resistenz aufweisen9. Die unerwünschten Nebenwirkungen, die mit der Chemotherapie bei den meisten PDAC-Patienten verbunden sind, sind ein weiterer Nachteil dieser Behandlung10. In jüngster Zeit haben vielversprechende Strategien gezeigt, dass Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs) und niedermolekulare Kinase-Inhibitoren (SMKIs) bei der Behandlung von PDAC wirksam sein können, aber ein dauerhaftes Ansprechen auf diese zielgerichteten Therapien bleibt auf eine Minderheit der Patienten beschränkt11,12. Insgesamt kann die Entdeckung von PDAC-spezifischen frühen Biomarkern neue Wege für eine frühzeitige Diagnose und Behandlung ebnen.
PDAC entwickelt sich aus Vorläuferläsionen von intraepithelialen Pankreasneoplasien (PanIN), die aus nicht-invasiven Epithelproliferationen des Pankreasgangs resultieren13,14. Während die Bildung von PanIN durch Onkogenmutationen wie KRAS initiiert wird, sind für die Progression zu PDAC zusätzliche genetische und epigenetische Veränderungen erforderlich. Es wurde prognostiziert, dass das Fortschreiten von PanIN durch die verschiedenen Stadien in die invasive PDAC etwa 10 Jahre dauert 13,15,16,17. Dieser Zeitrahmen bietet eine großartige Gelegenheit, von einer frühen PDAC-Diagnose zu profitieren. Daher wurden umfangreiche Forschungen durchgeführt, um Tumor-Xenotransplantat-Tiermodelle und Organoidkulturen zur Untersuchung der PDAC-Progression zu etablieren 18,19,20,21. Diese Modelle waren sehr nützlich für die Untersuchung der invasiven Stadien der PDAC, wenn auch nicht für den Übergang von den frühen PanIN-Phasen. Es ist daher wichtig, experimentelle Modelle zu entwickeln, die den frühen Verlauf von PanIN-Stadien rekapitulieren können, um die Entdeckung von Biomarkern zur Früherkennung zu ermöglichen.
Die Reprogrammierung somatischer Zellen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung der vier Transkriptionsfaktoren OCT4, SOX2, KLF4 und c-MYC (OSKM) hat das Ausmaß der zellulären Plastizität veranschaulicht22. Die Plastizität von Krebszellen ist gut dokumentiert, und die Reprogrammierung menschlicher Krebszellen in iPSCs wurde erfolgreich eingesetzt, um Zellen in ihren ursprünglichen zellulären Zustand zurückzusetzen und viele der epigenetischen Beleidigungen zu entfernen, die sich während des Fortschreitens der Krebserkrankung angesammelt haben 23,24,25,26,27,28,29. Die Möglichkeit, diese Reprogrammierungsstrategie zur Manipulation der Krebszellidentität zu nutzen, ist daher bei der Behandlung von Krebs vielversprechend30,31. In der Tat haben wir bereits gezeigt, dass die Differenzierung von iPSCs, die von PDACs abgeleitet sind, die PDAC-Progression durch die frühen PanIN-Stadien rekapitulieren kann32. Durch die Identifizierung von Genen und Signalwegen, die für die frühen bis mittleren Stadien der PDAC spezifisch sind, wurden Kandidaten-Biomarker identifiziert, die klinisch für die frühe PDAC-Diagnose verwendet werden können32,33. Die Biomarker, die mit einer einzigen iPSC-Linie entdeckt wurden, zeigten jedoch bei der Mehrheit der PDAC-Patienten eine begrenzte Abdeckung32. Die Herausforderungen bei der Generierung von iPSC-Linien von anderen PDAC-Patienten haben die Entdeckung zuverlässigerer Biomarker verhindert. Dies ist auf viele technische Faktoren zurückzuführen, einschließlich der Heterogenität der OSKM-Verabreichung, da nur ein kleiner Teil der menschlichen primären PDAC-Zellen alle vier Faktoren enthielt und erfolgreich auf die Reprogrammierung reagierte. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Reprogrammierung primärer PDAC-Zellen unter Verwendung einer effizienteren und konsistenteren dualen lentiviralen Verabreichung von OSKM vorgestellt.
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Protocol
Alle Versuchsprotokolle wurden vom OHSU Institutional Review Board genehmigt. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Alle Tierarbeiten für PDX-Tumoren wurden mit Genehmigung des OHSU Institutional Animal Use and Care Committee (IACUC) durchgeführt. Dieses Protokoll wurde an primären PDAC-Zellen aus patientenabgeleitetem Xenotransplantat (PDX), BxPc3-Zelllinie mit Epithelmorphologie, die aus dem Bauchspeicheldrüsengewebe einer 61-jährigen Patientin mit Adenokarzinom isoliert wurde, der H6C7-immortalisierten Epithelzelllinie, die aus normalem menschlichem Pankreasgangepithel stammt, und primären menschlichen Fibroblasten aus Hautbiopsien gesunder Personen getestet. Menschliche PDAC-Proben wurden im Rahmen der Oregon Pancreas Tissue Registry-Studie (IRB00003609) gewonnen. Von allen Probanden wurde eine informierte Zustimmung eingeholt. Humane primäre Fibroblasten wurden in RBiomedical, Edinburgh, UK, aus Hautproben von anonymen Spendern gewonnen, die sich mit deren Zustimmung und ethischer Genehmigung einer Routineoperation an der Edinburgh Royal Infirmary, Little France, UK, unterzogen haben (09/MRE00/91). Alle Lentivirus-Arbeiten wurden im Rahmen der Forschungstätigkeit der Klasse 2 (GM207/16.6) durchgeführt und von der Abteilung für Gesundheit und Sicherheit der Universität Edinburgh genehmigt und der zuständigen HSE-Behörde der schottischen Regierung gemeldet. Alle Reprogrammierungsexperimente mit menschlichen Pankreaszellen wurden unter ethischer Genehmigung der Ethikkommission der School of Biological Sciences an der University of Edinburgh durchgeführt (Referenz # asoufi-0002).
1. Herstellung von Lentiviren
- Für die Lentivirus-Herstellung hochwertige Verpackungs- und Expressionsplasmide (endotoxinfrei) mit Konzentrationen zwischen 1-2 μg/μl einschließlich psPAX2, pMDG34 und zwei RES-haltigen bicistronischen Vektoren herstellen; die pSIN4-EF1a-O2S-Kodierung für die OCT4- und SOX2-Expression, die durch den EF-1α-Promotor angetrieben wird, und pSIN4-CMV-K2M für die KLF4- und c-MYC-Expression unter dem CMV-Enhancer/Promotor35 (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie außerdem das pWPT-GFP-Plasmid vor, das als Transfektionskontrolle verwendet werden soll.
- Auftauen der humanen embryonalen Nierenzelllinie (293T) und Kultur in Glasgows Minimum Essential Medium (GMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS), 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 1 mM Glutamin bei (siehe Materialtabelle) 37 °C und 5 % CO2.
HINWEIS: Es wird empfohlen, 293T-Zellen innerhalb von vier Durchgängen nach dem Auftauen zu verwenden. - 293T bei einer Dichte von 3 Millionen Zellen pro 15-cm-Schale, 24 h vor der Transfektion aussäen. Insgesamt werden drei Gerichte benötigt. Es ist vorzuziehen, die Zellen später am Nachmittag ~16:00 Uhr zu säen.
- Am nächsten Tag (~16:00 Uhr), wenn die Zellen ~40%-50% Konfluenz erreichen, bereiten Sie Folgendes für drei Transfektionsreaktionen vor:
HINWEIS: Berücksichtigen Sie Pipettierfehler immer, indem Sie 10 % Volumen hinzufügen.- Markieren Sie drei 15-ml-Kunststoffröhrchen mit dem entsprechenden Lentivirus-Namen (pSIN4-EF1a-O2S, pSIN4-CMV-K2M und pwPT-GFP-Kontrolle). Geben Sie 1,710 ml reduziertes Serummedium (siehe Materialtabelle) in jedes Röhrchen.
- 90 μl Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle) in 1,710 ml reduziertem Serummedium verdünnen, 2 s lang vertexen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Mischen Sie die Verpackungsvektoren; 5,1 μg psPAX2 und 2,4 μg pMDG (7,5 μg insgesamt).
- Die Verpackungsvektormischung in das Transfektionsmedium geben (aus Schritt 1.4.2) und 2 s vortexen.
- 7,5 μg jedes Reprogrammierungsvektors: pSIN4-EF1a-O2S und pSIN4-CMV-K2M und die pwPT-GFP-Kontrolle werden dem Transfektionsgemisch aus Schritt (1.4.4) zugegeben und 2 s lang vortext.
HINWEIS: Verwenden Sie den Ausdruck vector: viral vector im Verhältnis 1:1.
- Inkubieren Sie die Transfektionsröhrchen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Transfizieren Sie die 293T-Zellen mit jedem Lentivirus, indem Sie das Transfektions-DNA-Gemisch aus Schritt (1.4.5) tropfenweise direkt in das Medium geben. Schwenken Sie die Schale, um eine gleichmäßige Verteilung über die gesamte Oberfläche zu gewährleisten.
- Inkubieren Sie die transfizierten Zellen über Nacht in einem 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator.
HINWEIS: Verwenden Sie virenspezifischen Abfall, einen Metallentsorgungseimer, einen Doppelbeutel mit Autoklavenbeuteln und nehmen Sie einen Behälter für flüssige Abfälle für Viren und fügen Sie eine Desinfektionstablette hinzu. Entsorgen Sie alle Pipetten, Spitzen und Röhrchen in einem Metalleimer. Entsorgen Sie alte Medien in einem Behälter für flüssige Viren. Vermeiden Sie die Verwendung von Glaspipetten und Glaswaren, um eine versehentliche Viruskontamination zu vermeiden. - Ersetzen Sie das Medium nach 14-16 Stunden nach der Transfektion durch 30 ml frisches 293T-Medium.
- Inkubieren Sie die transfizierten Zellen bei 37 °C, 5% CO2 für 60-72 Stunden nach dem Mediumwechsel. Beobachten Sie die Zellen täglich und überprüfen Sie die Transfektionseffizienz durch GFP-Fluoreszenz.
HINWEIS: Idealerweise sollte die Transfektionseffizienz bei GFP >90% betragen. Bei den anderen Viren sollte man deutliche morphologische Veränderungen der 293T-Zellen beobachten, da sie bei der Produktion von Viruspartikeln dazu neigen, runder zu werden. - Sammeln Sie das Medium aus jeder Virustransfektionskultur in 50-ml-Röhrchen und schleudern Sie es herunter, um Zelltrümmer bei 1932 x g für 10 Minuten bei 4 °C zu entfernen.
- Filtern Sie jeden Lentivirus-Überstand durch einen 0,45-μM-Spritzenvorsatzfilter, um kleinere Ablagerungen zu entfernen, und sammeln Sie sie in neuen 50-ml-Röhrchen.
- Teilen Sie jeden Lentivirus-Überstand in 6 ml-Aliquots und frieren Sie sie jeweils in flüssigem Stickstoff ein.
- Lagern Sie die Lentivirus-Aliquots bis zur Verwendung bei -80 °C.
2. Reprogrammierung der Lentivirus-Transduktion
- Auftauen Sie primäre PDAC-Zellen und -Kulturen in vollständig definiertem Keratinozyten-Serum-freiem Medium (KSFM), ergänzt mit Rinderhypophysenextrakt (BPE), humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) bei 5 ng/ml und Choleratoxin bei 50 ng/ml in einem 37 °C, 5 % CO2 und 5 % O2 (Hypoxie) Inkubator (siehe Materialtabelle).
- Auftauen von BxPc3, einer duktalen Adenokarzinom-Zelllinie der Plattenepitheldrüse, und Kultur in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) bei 37 °C und 5 % CO2.
- Auftauen von H6C7-Zellen, duktalen Epithelzellen der Bauchspeicheldrüse und Kultur in KSFM, ergänzt mit BPE und EGF bei 5 ng/ml, bei 37 °C und 5 % CO2.
- Auftauen von humanen Fibroblasten (hFib) und Kultur in Glasgows Minimum Essential Medium (GMEM), ergänzt mit 10 % FCS, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 1 mM Glutamin sowie 0,05 mM (endgültigem) Beta-Mercaptoethanol bei 37 °C und 5 % CO2.
- Bereiten Sie einen Tag vor der Lentivirus-Transduktion (vorzugsweise am späten Nachmittag) zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte vor, die jeweils 100.000 Zellen von PDAC-, BxPc3-, H6C7- und hFib-Zellen pro Vertiefung enthält. Infizieren Sie eine Mulde mit OSKM-Lentiviren und verwenden Sie die zweite als nicht infizierte Bekämpfung.
HINWEIS: Verwenden Sie für jeden Zellentyp eine separate Platte. - Stellen Sie am nächsten Tag, am Nachmittag (ca. 24 Stunden später), sicher, dass die Zellkonfluenz mindestens 70% erreicht, bevor Sie mit dem nächsten Schritt der Lentivirusinfektion fortfahren.
3. Lentivirus-Transduktion von PDAC
- 5 ml jedes Lentivirus-Überstands in einem 37 °C Virus-Inkubator auftauen.
- Bereiten Sie zwei 15-ml-Röhrchen vor, die jeweils 2 ml vorgewärmtes PDAC-Kulturmedium enthalten.
- In das erste Röhrchen geben Sie 6 ml jedes Reprogrammierungs-Lentivirus (pSIN4-CMV-K2M und pSIN4-EF1a-O2S) und 12 μl 4,5 mg/ml Polybren (endgültige 4,5 μg/ml, siehe Materialtabelle) und mischen.
- In das zweite Röhrchen 2 μl 4,5 mg/ml Polybren (letzte 4,5 μg/ml) geben.
- Entsorgen Sie das Medium aus jeder Vertiefung und waschen Sie es einmal mit PBS bei Raumtemperatur.
- Geben Sie das Reprogrammierungsinfektionsmedium (Rohr 1) in die erste Vertiefung.
- Die Mischung aus Rohr 2 in die zweite Vertiefung geben. Dies ist das nicht infizierte Steuerelement.
- Inkubieren Sie die PDAC-Zellen über Nacht in einem Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 und 5 % O2 (Hypoxie).
- Am nächsten Tag, am Nachmittag, entsorgen Sie das Medium aus beiden Vertiefungen und ersetzen Sie es durch frisches PDAC-Kulturmedium.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO2 und 5 % O2 (Hypoxie) für 48 h.
4. Lentivirus-Transduktion von BxPc3-Zellen
- 3 ml jedes Lentivirus-Überstands in einem 37 °C Virus-Inkubator auftauen.
- Bereiten Sie zwei 15-ml-Röhrchen vor, die jeweils 2 ml BxPc3-Nährmedium enthalten.
- In das erste Röhrchen 3 ml jedes Reprogrammierungslentivirus (pSIN4-CMV-K2M und pSIN4-EF1a-O2S) und 6 μl 4,5 mg/ml Polybren (endgültige 4,5 μg/ml) geben und mischen.
- In das zweite Röhrchen 2 μl 4,5 mg/ml Polybren (letzte 4,5 μg/ml) geben.
- Entsorgen Sie das Medium aus jeder Vertiefung und waschen Sie es einmal mit PBS.
- Geben Sie das Reprogrammierungsinfektionsmedium (Rohr 1) in die erste Vertiefung.
- Die Mischung aus Rohr 2 in die zweite Vertiefung geben. Dies ist das nicht infizierte Steuerelement.
- Inkubieren Sie die infizierten BxPc3-Zellen über Nacht bei 37 °C Virus und 5 % CO2 .
- Am nächsten Tag, am Nachmittag, entsorgen Sie das Medium aus beiden Vertiefungen und ersetzen Sie es durch frisches BxPc3-Kulturmedium.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 für 48 h.
5. Lentivirus-Transduktion der H6c7-Zellinfektion
- Tauen Sie 4 ml jedes Lentivirus-Überstands in einem 37 °C-Virusinkubator auf.
- Bereiten Sie zwei 15-ml-Röhrchen vor, die jeweils 2 ml H6c7-Nährmedium enthalten.
- In das erste Röhrchen geben Sie 4 ml jedes Reprogrammierungs-Lentivirus (pSIN4-CMV-K2M und pSIN4-EF1a-O2S) und 8 μl 4,5 mg/ml Polybren (endgültige 4,5 μg/ml) und mischen Sie.
- In das zweite Röhrchen 2 μl 4,5 mg/ml Polybren (letzte 4,5 μg/ml) geben.
- Entsorgen Sie das Medium aus beiden Vertiefungen und waschen Sie es einmal mit PBS.
- Geben Sie das Reprogrammierungsinfektionsmedium (Rohr 1) in die erste Vertiefung.
- Die Mischung aus Rohr 2 in die zweite Vertiefung geben. Dies ist das nicht infizierte Steuerelement.
- Inkubieren Sie die infizierten H6C7-Zellen über Nacht bei 37 °C Virus und 5 % CO2 .
- Am nächsten Tag, am Nachmittag, entsorgen Sie die Medien aus beiden Vertiefungen und ersetzen Sie sie durch ein frisches H6c7-Kulturmedium.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 für 48 h.
6. Lentivirus-Transduktion von hFib-Zellen
- Tauen Sie 2 ml jedes Lentivirus-Überstands in einem 37 °C-Virusinkubator auf.
- Bereiten Sie zwei 15-ml-Röhrchen vor, die jeweils 2 ml hFib-Nährmedium enthalten.
- In das erste Röhrchen geben Sie jeweils 2 ml Reprogrammierungsviren (pSIN4-CMV-K2M und pSIN4-EF1a-O2S) und fügen Sie 4 μl 4,5 mg/ml Polybren (endgültige 4,5 μg/ml) hinzu und mischen Sie.
- In das zweite Röhrchen 2 μl 4,5 mg/ml Polybren (endgültige 4,5 μg/ml) geben und mischen.
- Entsorgen Sie das Medium aus jeder Vertiefung und waschen Sie es einmal mit PBS.
- Geben Sie das Reprogrammierungsinfektionsmedium (Rohr 1) in die erste Vertiefung.
- Die Mischung aus Rohr 2 in die zweite Vertiefung geben. Dies ist das nicht infizierte Steuerelement.
- Inkubieren Sie die infizierten hFib-Zellen über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 .
- Am nächsten Tag, am Nachmittag, entsorgen Sie das Medium aus beiden Vertiefungen und ersetzen Sie es durch frisches hFib-Kulturmedium.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 für weitere 48 h.
HINWEIS: Für eine effiziente Lentivirus-Transduktion titern Sie die Lentivirus-Menge vorsichtig, da diese zwischen den verschiedenen Zelltypen stark variiert. Für einige Zelltypen können mehrere Lentivirus-Transduktionen erforderlich sein. PDAC-Zelllinien benötigen bis zu drei Dosen, während eine Dosis für die Reprogrammierung von BxPc3-, H6C7- und hFib-Linien ausreichte.
7. Vorbereitung der iMEF-Feederzellen
- Bereiten Sie 40 ml 0,2% ige Gelatinelösung vor, indem Sie 1% ige Gelatine-Stammlösung mit PBS verdünnen.
- Beschichten Sie vier 6-Well-Platten, indem Sie jede Well mit 2 ml 0,2%iger Gelatinelösung bedecken.
- Die mit Gelatine überzogenen Platten bei 37 °C und 5 % CO2 mindestens 30 min inkubieren.
- Die überschüssige Gelatinelösung ansaugen und die Platten unter der Strömungshaube trocknen lassen.
- Tauen Sie zwei Fläschchen (~ 4 Millionen Zellen pro Fläschchen) bestrahlter embryonaler Mausfibroblasten (iMEFs) auf, indem Sie sie in einem 37 °C warmen Wasserbad schwenken.
Anmerkungen: Um die Möglichkeit einer Kontamination zu verringern, achten Sie darauf, dass kein Wasser in die Nähe der Kappenöffnung spritzt. Trocknen Sie die Durchstechflasche mit einem Papiertuch und besprühen Sie sie mit 70% Ethanol. - Pipettieren Sie in der Gewebekulturhaube den Inhalt jedes aufgetauten iMEF-Fläschchens tropfenweise in ein 15-ml-Röhrchen mit 10 ml vorgewärmtem hFib-Kulturmedium und mischen Sie es gut, indem Sie das Röhrchen vorsichtig umdrehen.
- Die Zellsuspension bei 309 x g 3 min bei Raumtemperatur herunterschleudern und den Überstand aus jedem Röhrchen entfernen. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 12 ml hFib-Medium.
- Platte 2 ml der Zellsuspension pro Vertiefung der gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig, indem Sie die Platten vorsichtig in alle Richtungen schütteln.
- Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C und 5 % CO2 über Nacht.
HINWEIS: Bereiten Sie frische iMEF-Platten 24 Stunden vor der Verwendung für das Reprogrammierungsexperiment vor.
8. Übertragung der infizierten Zellen auf die iMEF-Feeder-Schicht
- Verwerfen Sie Medien aus den infizierten und nicht infizierten PDAC-, BxPc3-, H6c7- und hFib-Zellen. Waschen Sie jedes Mal gut mit PBS bei Raumtemperatur.
- Trennen Sie die Zellen von der Platte, indem Sie 0,5 ml Trypsin in jede Vertiefung geben. Inkubieren Sie PDAC-Zellen 15 Minuten lang in einem Inkubator mit 37 °C, 5 % CO2 und 5 % O2 (Hypoxie).
- BxPc3-Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 5 min inkubieren.
- H6c7- und hFib-Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 4 min inkubieren.
- Die dissoziierte Zellsuspension aus jeder Vertiefung in 15-ml-Röhrchen überführen, die entsprechend als infiziert oder nicht infiziert gekennzeichnet sind.
- Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation wie folgt: Für PDAC schleudern Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 300 x g ; für BxPc3 die Zellsuspension bei 120 x g für 5 min schleudern; für H6C7 die Zellsuspension 4 Minuten lang bei 112 x g schleudern; Für hFib die Zellsuspension 3 Minuten lang bei 161 x g schleudern. Führen Sie alle Zentrifugen bei Raumtemperatur durch.
- Resuspendieren Sie jedes Zelltyp-Pellet in 1 ml des entsprechenden Nährmediums.
- Waschen Sie die in Schritt 7 vorbereiteten iMEF-Platten zweimal mit jedem Zelltyp-Kulturmedium. dh waschen Sie eine Platte mit PDAC-Medien, eine mit BxPc3-Medien, eine mit H6C7-Medium und die andere mit hFib-Medium.
- Platte 50.000 infizierte Zellen pro Well in fünf Wells der iMEF 6-Well-Platte. Platte 50.000 nicht infizierte Kontrollzellen in der verbleibenden Vertiefung der iMEF 6-Well-Platte.
HINWEIS: Optimieren Sie die Anzahl der zu plattierenden infizierten Zellen von 1.000 auf 50.000 Zellen pro Well. - Inkubieren Sie PDAC-Zellen über Nacht bei 37 °C, 5 % CO2 und 5 % O2 (Hypoxie).
- BxPc3-, H6C7- und hFib-Zellen über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Bereiten Sie am nächsten Tag das Reprogrammierungsmedium wie folgt vor: Fügen Sie 100 ml Knockout-Serumersatz (25% endgültig), 5 ml 200 mM Glutamin (1 mM endgültig), 5 ml 100x nicht-essentielle Aminosäuren (100 μM endgültig), 1,5 ml Beta-Mercaptoethanol (0,1 mM endgültig) zu 400 ml modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) hinzu.
- Lagern Sie die Reprogrammierungsmedien in 100-ml-Aliquots bei 4 °C für bis zu 4 Wochen oder bei -20 °C für länger.
- Bei gebrauchsfertiger Anwendung 100 μl 10 mg/ml basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) (10 ng/ml endgültig) in ein 100-ml-Reprogrammierungsmedien-Aliquot geben.
- Erwärmen Sie die Umprogrammiermedien in einem 37 °C warmen Wasserbad.
- Waschen Sie die Zellen, die auf iMEF-Feedern wachsen, zweimal mit vorgewärmten Reprogrammierungsmedien.
Geben Sie 2 ml Reprogrammierungsmedium in jede Vertiefung. - Die Reprogrammierplatten werden in einen 37 °C, 5 % CO2und 3 % O2 (Hypoxie) Inkubator überführt.
HINWEIS: Der Tag, an dem Medien neu programmiert werden, gilt als Tag 1 der Neuprogrammierung. - Füttern Sie die Zellen täglich mit frischem Reprogrammierungsmedium, bis iPSC-Kolonien erscheinen.
HINWEIS: Identifizieren Sie iPSC-Kolonien anhand ihrer ESC-ähnlichen Morphologie (kompakte Kolonien mit gut definierten Rändern und bestehend aus Zellen mit einem hohen Zellkern/Zytoplasma-Verhältnis). - Überwachen Sie die iPSC-Kolonien täglich und leiten Sie sie, nachdem eine ausreichende Anzahl gebildet wurde, als Pool weiter.
HINWEIS: Achten Sie darauf, dass sich die iPSC-Kolonien nicht berühren, da dies zu einer Differenzierung führen und ihre Langzeitstabilität beeinträchtigen würde. - Um klonale Linien zu etablieren, passieren Sie den iPSC-Pool etwa 5 Mal und wählen Sie dann robuste Kolonien aus, die ihre ESC-ähnliche Morphologie beibehalten.
- Um vollständig reprogrammierte iPSC-Kolonien zu identifizieren, führen Sie eine Lebendfärbung mit TRA-160 durch (siehe Materialtabelle) und ernten Sie RNA aus iPSC-Kolonien zur Charakterisierung der Genexpression.
9. Passieren von iPS-Kolonien
- Bereiten Sie 24 Stunden vor dem Passieren der iPSC-Kolonien genügend iMEF-Feederplatten vor, wie in Schritt 7 beschrieben.
- Waschen Sie die iMEF-Einzugsplatten zweimal mit vorgewärmten Umprogrammiermedien.
- 2 ml Reprogrammierungsmedien, ergänzt mit ROCK-Inhibitor (Y2) (10 μM), in jede Vertiefung der iMEF-Platte geben.
- Inkubieren Sie die iMEF-Platten in einem Inkubator mit 37 °C, 5 % CO2 und 3 % O2 , bis sie einsatzbereit sind.
- Ethylendiamintetraessigsäure/phosphatgepufferte Kochsalzlösung (EDTA/PBS) durch Verdünnen von 0,5 M EDTA 1:1000 in PBS (0,5 mM endgültig) herstellen.
- Ersetzen Sie die Reprogrammierungskulturmedien durch 0,5 ml EDTA/PBS in jeder Vertiefung.
- Inkubieren Sie je nach Zelltyp in einem Inkubator mit 37 °C, 5 % CO2 und 3 % O2 oder bei Raumtemperatur. BxPc3- und PDAC-iPS-Zellen benötigen eine 15-minütige Inkubation bei 37 °C. H6C7- und hFib-iPSCs müssen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert werden.
- Überprüfen Sie die iPS-Zellen unter dem Mikroskop, bis sie beginnen, sich gleichmäßig von der Futterschicht in der gesamten Kolonie zu lösen.
- Sammeln Sie die dissoziierte iPSC-Zellsuspension in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur herunterschleudern.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Reprogrammierungsmedium, das mit Y2 (10 μM) ergänzt wird.
- Plattieren Sie die Zellen auf der iMEF-Feeder-Schicht, indem Sie jeweils 1 ml iPSC-Zellsuspension in drei Wells der iMEF-Platte übertragen.
HINWEIS: Das Aufteilungsverhältnis kann je nach Anzahl der geernteten iPSC-Kolonien variieren. - Inkubation in einem 37 °C, 5 % CO2 und 3 % O2 -Inkubator.
10. Lebendfärbung von iPS-Kolonien mit TRA-1-60
- Bereiten Sie 0,5 ml pro Well mit 4 μg/ml TRA-1-60-Antikörper in Reprogrammierungsmedien vor.
- Entsorgen Sie das Reprogrammierungsmedium und ersetzen Sie es durch eine 0,5-ml-Antikörpermischung in jeder Vertiefung. In einem 37 °C, 5 % CO2 und 3 % O2 -Inkubator 30 min inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit dem Reprogrammierungsmedium.
- Nehmen Sie Fluoreszenzbilder mit einem Zellbildgebungssystem mit dem GFP-Filter auf.
- Überprüfen Sie die Bildqualität unter Berücksichtigung des negativen Steuerkanals.
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Representative Results
Repräsentative Bilder, die die Morphologie von iPSC-Kolonien zeigen, die von PDAC-, BXPc3-, H6C7- und hFib-Zellen abgeleitet sind, sind in Abbildung 1 dargestellt. PDAC-iPSC-Kolonien begannen sich am 25. Tag der Reprogrammierung zu bilden. Robuste iPSC-Kolonien mit einer etablierteren ESC-ähnlichen Morphologie wurden am Tag 40 der Reprogrammierung identifiziert (Abbildung 1). In ähnlicher Weise begann die Bildung von BxPc3-iPSCs am 23. Tag und etablierte sich bis zum 35. Tag. Die H6C7-iPSC-Bildung war ähnlich wie bei PDAC-iPSCs und begann sich an Tag 45 zu etablieren. hFib-iPSC-Kolonien begannen sich am 15. Tag der Reprogrammierung zu bilden.
Abbildung 1: Repräsentative Bilder von iPSC-Kolonien. Die Bilder zeigen eine etablierte hESC-ähnliche Morphologie, die von (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 und (D) hFib abgeleitet ist. Die Tage der Umprogrammierung sind über jedem Bild angegeben. Maßstabsleisten = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Klonale iPSC-Linien wurden aus jeder Reprogrammierung von PDAC-, BxPc3-, H6C7- und hFib-Zellen etabliert. Alle etablierten iPSC-Linien wurden positiv auf TRA-1-60, einen undifferenzierten hESC-Zelloberflächenmarker, gefärbt, was ihre Reprogrammierung zur Pluripotenz bestätigt (Abbildung 2).
Abbildung 2: Repräsentative Bilder klonaler iPSC-Linien. Die Bilder stammen von (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 und (D) hFib und zeigen eine ESC-ähnliche Morphologie (obere Felder) und eine positive Färbung für TRA-1-60 (untere Platte). Maßstabsleisten = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Um die Verwendung der iPSC-Reprogrammierung zur Untersuchung des Krebsverlaufs zu erleichtern, wurde ein robustes Protokoll für die Reprogrammierung von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen entwickelt. Die Reprogrammierung von Krebszellen in Pluripotenz hat sich bisher als sehr schwierig erwiesen, da nur wenige Studien erfolgreich iPSCs aus Krebszellen erzeugt haben 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Die meisten dieser Studien verwendeten immortalisierte Krebszelllinien zur Erzeugung von iPSC-Linien, keine primären patienteneigenen Zellen 36,37,38,40,42,43,44,46. Beispielsweise wurde versucht, vier verschiedene Leberkrebszelllinien mit der retroviralen Einführung von OSKM-Faktoren zu reprogrammieren, aber nur eine einzige Zelllinie wurde erfolgreich reprogrammiert41. Die erzeugte Leberkrebs-iPSC-Linie zeigte jedoch nach einigen Passagen einen Verlust an Stammzellen, was die hohe Resistenz von Krebszellen gegen OSKM-Reprogrammierung unterstreicht41. Zuvor wurden Versuche unternommen, PDAC-Zellen durch lentivirale Verabreichung von OSKM einzeln umzuprogrammieren; es wurde jedoch nur eine einzige iPSC-Linie erzeugt, die von der exogenen OSKM-Expression abhängt und daher nicht vollständig umprogrammiert wurde37. Eine andere Studie verwendete episomale Vektoren, um OSKM-Faktoren ohne genomische Integration zu liefern, konnte aber nur einen einzigen iPSC-Klon aus PDAC39 erzeugen. Der begrenzte Erfolg bei der Reprogrammierung von Krebszellen trägt zu den vielen Herausforderungen bei, die den Einsatz der iPSC-Technologie in der Krebsforschung behindern.
Hier wird die Erzeugung von iPSCs aus primären PDAC-Proben von zwei verschiedenen Patienten und einer etablierten PDAC-Zelllinie (BxPc3) erläutert. Darüber hinaus wurden iPSCs auch aus H6c7, einer duktalen Epithelzelllinie der Bauchspeicheldrüse, erzeugt. Unseres Wissens ist dies der erste Bericht über erfolgreich abgeleitete stabile iPSC-Linien aus BxPc3 und H6c7. Nach diesem Protokoll wurden auch erfolgreich iPSCs aus primären menschlichen Fibroblasten von gesunden Personen generiert, wodurch die Anwendbarkeit der Methode über die Krebsforschung hinaus erweitert wurde.
Eines der Schlüsselelemente für den Erfolg des Protokolls ist die Verwendung von bicistronischen lentiviralen Vektoren zur Co-Expression von OS- und KM-Faktoren. Diese Vektoren enthalten die interne Ribosomeneintrittsstelle 2 (IRES2), um OCT4 und SOX2 in einem Vektor und KLF4 und cMYC im anderen Vektor zu exprimieren. Mehrere Studien mit monocistronischen Vektoren, bei denen jeder Reprogrammierungsfaktor einzeln verabreicht wurde, haben gezeigt, dass die Aufnahme jedes Vektors unterschiedlich ist, was sich auf die OSKM-Stöchiometrie und die Reprogrammierungseffizienz auswirkt47. Die Verwendung von bicistronischen Vektoren kann helfen, dieses Problem zu entschärfen. Darüber hinaus hat die Verwendung von IRES in lentiviralen Vektoren eine signifikante Steigerung der Reprogrammierungseffizienz gezeigt48. In diesem Lentivirus-System wird die OS-Expression durch den EF1a-Promotor gesteuert, während die KM-Expression unter der Kontrolle eines CMV-Promotors steht. Es ist bekannt, dass der CMV-Promotor im Gegensatz zu EF1a49,50 durch DNA-Methylierung und Histon-Deacetylierung einem hocheffizienten Silencing unterzogen werden kann. Daher kann die frühzeitige Stummschaltung von KM vor dem Betriebssystem während der Neuprogrammierung ein Schlüsselfaktor für den Erfolg des Protokolls sein. Dies steht im Einklang mit früheren Studien, die die Bedeutung der OSKM-Expressionsdynamik während der Reprogrammierung zeigen 51,52,53,54,55. Somit ist der bicistronische Vektor auch vorteilhafter als der polycistronische Vektor, bei dem alle OSKM-Faktoren aus einem einzigen Promotor56 exprimiert werden. Weitere Faktoren, die zum Erfolg des Protokolls beitragen, sind die Dosen der Lentivirus-Infektion und die Anzahl der infizierten Zellen, die für die Reprogrammierung verwendet werden, die für jeden Zelltyp angepasst wurden.
Zusammenfassend wird eine optimierte Methode zur Reprogrammierung von primären PDAC-Zellen zusammen mit anderen Zelllinien und normalen Zellen vorgestellt. Diese Methode wird dazu beitragen, den Einsatz der iPSC-Reprogrammierung zur Modellierung des Krebsverlaufs zu erweitern und in diesem Fall frühe PDAC-Biomarker zu entdecken.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
A.S. und J.K. danken Cancer Research UK und OHSU für die Finanzierung (CRUK-OHSU-Projektpreis C65925/A26986). A.S. wird durch einen MRC-Karriereentwicklungspreis (MR/N024028/1) unterstützt. A.A. wird durch ein Ph.D.-Stipendium (Scholarship Ref. 1078107040) der King Abdulaziz City for Science and Technology finanziert. J.K. wird durch den MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) und den Knight CEDAR Grant (68182-933-000, 68182-939-000) finanziert. Wir danken Prof. Keisuke Kaji für die freundliche Bereitstellung der Reprogrammierungsvektoren pSIN4-EF1a-O2S und pSIN4-CMV-K2M. Für die Zwecke des Open Access hat der Autor eine Creative Commons Attribution (CC BY)-Lizenz auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergibt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 | |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 | |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 | |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 | |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 | |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 | |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 | |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML | |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B | |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP | |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V | |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 | |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | |
| pMDG | AddGene | 187440 | |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G | |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 | |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 | |
| psPAX2 | AddGene | 12260 | |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 | |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 | |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 | |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
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