Summary
Denne protokollen beskriver omprogrammering av pankreasduktalt adenokarsinom (PDAC) og normale duktale epitelceller i pankreas til induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Vi tilbyr en optimalisert og detaljert, trinnvis prosedyre, fra klargjøring av lentivirus til etablering av stabile iPSC-linjer.
Abstract
Genereringen av induserte pluripotente stamceller (iPSCs) ved hjelp av transkripsjonsfaktorer har blitt oppnådd fra nesten alle differensierte celletyper og har vist seg å være svært verdifull for forskning og kliniske anvendelser. Interessant nok har iPSC-omprogrammering av kreftceller, som bukspyttkjertelduktalt adenokarsinom (PDAC), vist seg å reversere den invasive PDAC-fenotypen og overstyre kreftepigenomet. Differensieringen av PDAC-avledede iPSCer kan rekapitulere PDAC-progresjon fra sin tidlige pankreas-intraepitelial neoplasi (PanIN) forløper, og avsløre molekylære og cellulære endringer som oppstår tidlig under PDAC-progresjon. Derfor kan PDAC-avledede iPSCer brukes til å modellere de tidligste stadiene av PDAC for oppdagelse av diagnostiske markører for tidlig deteksjon. Dette er spesielt viktig for PDAC-pasienter, som vanligvis diagnostiseres i de sene metastatiske stadiene på grunn av mangel på pålitelige biomarkører for de tidligere PanIN-stadiene. Imidlertid er omprogrammering av kreftcellelinjer, inkludert PDAC, til pluripotens fortsatt utfordrende, arbeidskrevende og svært variabel mellom forskjellige linjer. Her beskriver vi en mer konsistent protokoll for generering av iPSCer fra forskjellige humane PDAC-cellelinjer ved bruk av bicistroniske lentivirale vektorer. De resulterende iPSC-linjene er stabile, og viser ingen avhengighet av det eksogene uttrykket av omprogrammeringsfaktorer eller induserbare stoffer. Samlet sett letter denne protokollen genereringen av et bredt spekter av PDAC-avledede iPSCer, noe som er avgjørende for å oppdage tidlige biomarkører som er mer spesifikke og representative for PDAC-tilfeller.
Introduction
Pankreasduktalt adenokarsinom (PDAC) er en av de mest dødelige malignitetene, og tidlig diagnose er fortsatt utfordrende på grunn av sykdommens asymptomatiske natur. Flertallet av PDAC-pasienter diagnostiseres på det avanserte metastatiske stadiet når svært begrensede behandlingsalternativer er tilgjengelige 1,2. Dette skyldes hovedsakelig mangelen på pålitelige biomarkører for de tidligere stadiene, slik som de som lett kan oppdages som proteiner som slippes ut i blodet.
PDAC kan spre seg veldig tidlig under progresjonen, og en bedre prognose har vært knyttet til tidlig kreftdeteksjon når PDAC er lokalisert i bukspyttkjertelen3. Imidlertid er mindre enn en tiendedel av PDAC-pasientene diagnostisert med en gunstig prognose, noe som muliggjør kirurgisk reseksjon. Ikke desto mindre er de få med resektabel svulster også utsatt for tumorfall innen 12 måneder4.
I løpet av de siste fem tiårene har det blitt gjort bemerkelsesverdige forbedringer i kirurgiske teknikker, pasientbehandling og behandlingsmodaliteter 5,6. Imidlertid har 5-års overlevelse hos kirurgisk resekterte PDAC-pasienter knapt steget til 17%. Likevel er dette fortsatt bedre enn hos ikke-resekterte pasienter, som har vært nesten uendret (0,9 %)4,7. Kjemoterapi er den eneste andre alternative PDAC-behandlingen. Likevel er dette alternativet svært begrenset, da det store flertallet av PDAC-pasienter viser sterk motstand mot kjemoterapi medisiner som Gemcitabine 7,8. Andre legemidler, som erlotinib, er bare tilgjengelige for en liten gruppe PDAC-pasienter med spesifikke mutasjoner, hvorav de fleste viser erlotinibresistens9. De negative bivirkningene forbundet med kjemoterapi hos de fleste PDAC-pasienter er enda en ulempe ved denne behandlingen10. Nylig har lovende strategier vist at immunkontrollpunkthemmere (ICI) og småmolekylkinasehemmere (SMKI) kan være effektive i behandling av PDAC, men varige responser på disse målrettede terapiene forblir begrenset til et mindretall av pasientene11,12. Samlet sett kan oppdagelsen av PDAC-spesifikke tidlige biomarkører bane nye veier for tidlig diagnose og behandling.
PDAC utvikler seg fra pankreas intraepitelial neoplasmer (PanIN) forstadier lesjoner som skyldes ikke-invasive pankreasgang epitelial proliferasjoner13,14. Mens dannelsen av PanIN initieres av onkogenmutasjoner som KRAS, er det nødvendig med ytterligere genetiske og epigenetiske endringer for progresjonen til PDAC. Det har blitt anslått at progresjonen av PanIN gjennom de forskjellige stadiene i invasiv PDAC tar omtrent 10 år 13,15,16,17. Denne tidsrammen gir en flott mulighet til å dra nytte av tidlig PDAC-diagnose. Derfor har det blitt utført omfattende forskning for å etablere tumorxenograft dyremodeller og organoidkulturer for å studere PDAC-progresjon 18,19,20,21. Disse modellene har vært svært nyttige for å studere de invasive stadiene av PDAC, men ikke overgangen fra de tidlige PanIN-fasene. Det er derfor viktig å utvikle eksperimentelle modeller som kan rekapitulere den tidlige progresjonen av PanIN-stadier for å muliggjøre oppdagelsen av biomarkører for tidlig deteksjon.
Reprogrammering av somatiske celler til induserte pluripotente stamceller (iPSCs) ved hjelp av de fire transkripsjonsfaktorene OCT4, SOX2, KLF4 og c-MYC (OSKM) har illustrert omfanget av cellulær plastisitet22. Kreftcelleplastisitet har blitt godt dokumentert, og omprogrammering av humane kreftceller til iPSCs har blitt brukt til å tilbakestille celler til sin opprinnelige cellulære tilstand, og fjernet mange av de epigenetiske fornærmelsene som har akkumulert under kreftprogresjon 23,24,25,26,27,28,29 . Muligheten for å bruke denne omprogrammeringsstrategien til å manipulere kreftcelleidentitet har derfor gitt store løfter i behandling av kreft30,31. Faktisk har vi tidligere vist at differensieringen av iPSCer avledet fra PDAC kan rekapitulere PDAC-progresjon gjennom de tidlige PanIN-stadiene32. Ved å identifisere gener og veier som er spesifikke for de tidlige til mellomstadiene av PDAC, ble kandidatbiomarkører identifisert som kan brukes klinisk til tidlig PDAC-diagnose32,33. Imidlertid viste biomarkørene oppdaget ved hjelp av en enkelt iPSC-linje begrenset dekning hos flertallet av PDAC-pasientene32. Utfordringene med å generere iPSC-linjer fra andre PDAC-pasienter har stoppet muligheten til å oppdage mer pålitelige biomarkører. Dette skyldes mange tekniske faktorer, inkludert heterogeniteten til OSKM-levering, da bare en liten del av humane primære PDAC-celler inneholdt alle fire faktorene og reagerte vellykket på omprogrammering. Her presenteres en detaljert protokoll for omprogrammering av primære PDAC-celler ved hjelp av en mer effektiv og konsistent dobbel lentiviral levering av OSKM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller ble godkjent av OHSU Institutional Review Board. Alle metodene ble utført i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter. Alle dyrearbeid for PDX-svulster ble utført med OHSU Institutional Animal Use and Care Committee (IACUC) godkjenning. Denne protokollen ble testet i primære PDAC-celler fra pasientavledet xenograft (PDX), BxPc3-cellelinje som viste epitelmorfologi som ble isolert fra bukspyttkjertelvevet til en 61 år gammel kvinnelig pasient med adenokarsinom, H6C7 udødeliggjort epitelcellelinje avledet fra normalt humant bukspyttkjertelepitel og primære humane fibroblaster avledet fra hudbiopsi av friske individer. Humane PDAC-prøver ble oppnådd under Oregon Pancreas Tissue Registry studie (IRB00003609). Informert samtykke ble innhentet fra alle forsøkspersonene. Humane primære fibroblaster ble avledet i RBiomedical, Edinburgh, Storbritannia, fra hudprøver fra anonyme givere som gjennomgår rutinemessig kirurgi ved Edinburgh Royal Infirmary, Little France, Storbritannia, under deres samtykke og etiske godkjenning (09/MRE00/91). Alt lentivirusarbeid er utført under klasse 2 forskningsaktivitet (GM207/16.6) og godkjent av helse- og sikkerhetsavdelingen ved University of Edinburgh og varslet til HMS-kompetent myndighet i den skotske regjeringen. Alle omprogrammeringseksperimenter ved bruk av humane bukspyttkjertelceller ble utført under etisk godkjenning av School of Biological Sciences etiske komité ved University of Edinburgh (referanse # asoufi-0002).
1. Fremstilling av lentivirus
- For lentiviruspreparasjon, tilbered emballasje- og ekspresjonsplasmider av høy kvalitet (endotoksinfrie) med konsentrasjoner mellom 1-2 μg / μL inkludert psPAX2, pMDG34 og to RES-inneholdende bicistroniske vektorer; pSIN4-EF1a-O2S-kodingen for OCT4- og SOX2-uttrykk drevet av EF-1α-promotor, og pSIN4-CMV-K2M for KLF4- og c-MYC-uttrykk under CMV-forsterkerenhancer/promotor35 (se materialfortegnelse). Forbered også pWPT-GFP-plasmid som skal brukes som transfeksjonskontroll.
- Tine Human Embryonic Kidney cellelinje (293T) og kultur i Glasgows Minimum Essential Medium (GMEM), supplert med 10% føtal kalv serum (FCS), 1x ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat og 1 mM glutamin ved (se tabell over materialer) 37 ° C og 5% CO2.
MERK: Det anbefales å bruke 293T-celler innen fire passasjer etter tining. - Frø 293T med en tetthet på 3 millioner celler per 15 cm tallerken, 24 timer før transfeksjon. Totalt tre retter kreves. Det er å foretrekke å frø celler senere på ettermiddagen ~ 16:00.
- Neste dag (~ 16:00), når cellene når ~ 40% -50% sammenløp, forberede følgende for tre transfeksjonsreaksjoner:
MERK: Ta alltid høyde for pipetteringsfeil ved å legge til 10 % ekstra volum.- Merk tre 15 ml plastrør med riktig lentivirusnavn (pSIN4-EF1a-O2S, pSIN4-CMV-K2M og pwPT-GFP-kontroll). Tilsett 1,710 ml redusert serummedium (se materialfortegnelse) til hver tube.
- Fortynn 90 μL transfeksjonsreagens (se materialfortegnelse) i 1,710 ml redusert serummedium, bland ved toppunkt i 2 s, og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
- Bland emballasjevektorene; 5,1 μg psPAX2 og 2,4 μg pMDG (7,5 μg totalt).
- Tilsett emballasjevektorblandingen til transfeksjonsmediet (fra trinn 1.4.2) og virvel i 2 s.
- Tilsett 7,5 μg av hver omprogrammeringsvektor: pSIN4-EF1a-O2S og pSIN4-CMV-K2M og pwPT-GFP-kontrollen til transfeksjonsblandingen fra trinn (1.4.4) og virvel i 2 s.
MERK: Bruk uttrykket vektor: viral vektor i forholdet 1:1.
- Inkuber transfeksjonsrørene i 15 minutter ved romtemperatur.
- Transfekt 293T-cellene med hvert lentivirus ved direkte å legge til transfeksjon-DNA-blandingen fra trinn (1.4.5) til mediet på en dråpevis måte. Virvle fatet for å sikre jevn fordeling over hele overflaten.
- Inkuber de transfekterte cellene i en 37 ° C, 5% CO2 -inkubator over natten.
MERK: Bruk virusspesifikt avfall, en metallavfallsbøtte, dobbel pose med autoklavposer, og ta en flytende avfallsbeholder for virus og legg til en desinfiserende tablett. Kast alle pipetter, spisser og rør i en metallbøtte. Kast gamle medier i en beholder for virus-flytende avfall. Unngå å bruke glasspipetter og glass for å eliminere utilsiktet virusforurensning. - Etter 14-16 timer etter transfeksjon, erstatt mediet med 30 ml friskt 293T medium.
- Inkuber de transfekterte cellene ved 37 °C, 5% CO2 i 60-72 timer etter middels endring. Observer celler daglig og kontroller transfeksjonseffektiviteten ved GFP-fluorescens.
MERK: Ideelt sett bør transfeksjonseffektiviteten være >90% av GFP. For de andre virusene bør man observere klare morfologiske endringer av 293T-celler, da de har en tendens til å bli mer runde når de produserer viruspartikler. - Samle mediet fra hver virustransfeksjonskultur i 50 ml rør og spinn ned for å fjerne celleavfall ved 1932 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Filtrer hver lentivirussupernatant gjennom et 0,45 μM sprøytefilter for å fjerne mindre rusk og samle det inn i nye 50 ml rør.
- Del hver lentivirus supernatant i 6 ml alikoter og snap fryse hver i flytende nitrogen.
- Oppbevar lentivirusalikotene ved -80 °C til de er klare til bruk.
2. Omprogrammering av lentivirustransduksjon
- Tine primære PDAC-celler og kultur i fullstendig definert Keratinocyte Serum Free Medium (KSFM), supplert med Bovine Hypofyseekstrakt (BPE), human rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF) ved 5 ng / ml og koleratoksin ved 50 ng / ml i en 37 ° C, 5% CO2 og 5% O2 (hypoksi) inkubator (se materialtabellen).
- Tine BxPc3, en plateepitel pankreasduktalt adenokarsinomcellelinje, og dyrkning i RPMI 1640 medium supplert med 10 % kalveserum (FCS) ved 37 °C og 5 % CO2.
- Tine H6C7-celler, duktale epitelceller i bukspyttkjertelen og kultur i KSFM supplert med BPE og EGF ved 5 ng/ml, ved 37 °C og 5 % CO2.
- Tine human fibroblast (hFib) og kultur i Glasgows Minimum Essential Medium (GMEM), supplert med 10% FCS, 1x ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat og 1 mM glutamin og 0,05 mM (endelig) beta-merkaptoetanol ved 37 ° C og 5% CO2.
- En dag før lentivirustransduksjon (helst sent på ettermiddagen), klargjør to brønner på en 6-brønnsplate som inneholder 100 000 celler per brønn i hver av PDAC-, BxPc3-, H6C7- og hFib-celler. Infiser en brønn med OSKM lentivirus og bruk den andre som en uinfisert kontroll.
MERK: Bruk en separat plate for hver celletype. - Neste dag, om ettermiddagen (ca. 24 timer senere), må du sørge for at cellesammenløpet når minst 70 % før du går videre til neste trinn for lentivirusinfeksjon.
3. Lentivirus transduksjon av PDAC
- Tin 5 ml av hver lentivirussupernatant i en virusinkubator på 37 °C.
- Klargjør to 15 ml tuber, hver inneholdende 2 ml forvarmet PDAC dyrkningsmedium.
- Tilsett 6 ml av hvert omprogrammeringslentivirus (pSIN4-CMV-K2M og pSIN4-EF1a-O2S) og 12 μL 4,5 mg/ml polybren (endelig 4,5 μg/ml, se materialfortegnelse) og bland.
- Til det andre røret, tilsett 2 μL av 4,5 mg / ml polybren (endelig 4,5 μg / ml).
- Kast mediet fra hver brønn og vask én gang med PBS ved romtemperatur.
- Legg til omprogrammeringsinfeksjonsmediet (rør 1) til den første brønnen.
- Tilsett blandingen av rør 2 til den andre brønnen. Dette vil være den uinfiserte kontrollen.
- Inkuber PDAC-cellene i en 37 ° C, 5% CO2 og 5% O2 (hypoksi) inkubator over natten.
- Neste dag, om ettermiddagen, kast mediene fra begge brønnene og erstatt det med ferskt PDAC-kulturmedium.
- Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2 og 5% O2 (hypoksi) i 48 timer.
4. Lentivirus-transduksjon av BxPc3-celler
- Tin 3 ml av hver lentivirussupernatant i en virusinkubator på 37 °C.
- Klargjør to 15 ml tuber, hver inneholdende 2 ml BxPC3 dyrkningsmedium.
- Til det første røret, tilsett 3 ml av hvert omprogrammeringslentivirus (pSIN4-CMV-K2M og pSIN4-EF1a-O2S) og 6 μL 4,5 mg / ml polybren (endelig 4,5 μg / ml) og bland.
- Til det andre røret, tilsett 2 μL av 4,5 mg / ml polybren (endelig 4,5 μg / ml).
- Kast mediet fra hver brønn og vask én gang med PBS.
- Legg til omprogrammeringsinfeksjonsmediet (rør 1) til den første brønnen.
- Tilsett blandingen av rør 2 til den andre brønnen. Dette vil være den uinfiserte kontrollen.
- Inkuber de infiserte BxPc3-cellene ved 37 °C virus og 5% CO2 over natten.
- Neste dag, om ettermiddagen, kast mediene fra begge brønnene og erstatt det med ferskt BxPc3-kulturmedium.
- Inkuber cellene ved 37 °C og 5% CO2 i 48 timer.
5. Lentivirus transduksjon av H6c7 celler infeksjon
- Tin 4 ml av hver lentivirussupernatant i en virusinkubator på 37 °C.
- Klargjør to 15 ml tuber, hver inneholdende 2 ml H6c7 kulturmedium.
- Til det første røret, tilsett 4 ml av hvert omprogrammeringslentivirus (pSIN4-CMV-K2M og pSIN4-EF1a-O2S) og 8 μL 4,5 mg / ml polybren (endelig 4,5 μg / ml) og bland.
- Til det andre røret, tilsett 2 μL av 4,5 mg / ml polybren (endelig 4,5 μg / ml).
- Kast mediet fra begge brønnene og vask det én gang med PBS.
- Legg til omprogrammeringsinfeksjonsmediet (rør 1) til den første brønnen.
- Tilsett blandingen av rør 2 til den andre brønnen. Dette vil være den uinfiserte kontrollen.
- Inkuber de infiserte H6C7-cellene ved 37 °C virus og 5% CO2 over natten.
- Neste dag, om ettermiddagen, kast mediene fra begge brønnene og erstatt dem med et friskt H6c7-kulturmedium.
- Inkuber cellene ved 37 °C og 5% CO2 i 48 timer.
6. Lentivirustransduksjon av hFib-celler
- Tin 2 ml av hver lentivirussupernatant i en virusinkubator på 37 °C.
- Klargjør to 15 ml tuber, hver inneholdende 2 ml hFib dyrkningsmedium.
- Til det første røret, tilsett 2 ml av hvert omprogrammeringsvirus (pSIN4-CMV-K2M og pSIN4-EF1a-O2S) og tilsett 4 μL 4,5 mg / ml polybren (endelig 4,5 μg / ml) og bland.
- Til den andre tuben, tilsett 2 μL av 4,5 mg / ml polybren (endelig 4,5 μg / ml) og bland.
- Kast mediet fra hver brønn og vask én gang med PBS.
- Legg til omprogrammeringsinfeksjonsmediet (rør 1) til den første brønnen.
- Tilsett blandingen av rør 2 til den andre brønnen. Dette vil være den uinfiserte kontrollen.
- Inkuber de infiserte hFib-cellene ved 37 °C og 5% CO2 over natten.
- Neste dag, om ettermiddagen, kast mediene fra begge brønnene og erstatt det med ferskt hFib-kulturmedium.
- Inkuber cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i ytterligere 48 timer.
MERK: For effektiv lentivirustransduksjon, titre mengden lentivirus nøye, da dette varierer sterkt mellom de forskjellige celletypene. Flere lentivirustransduksjoner kan være nødvendig for noen celletyper. PDAC-cellelinjer krever opptil tre doser, mens en dose var nok til å omprogrammere BxPc3-, H6C7- og hFib-linjer.
7. Fremstilling av iMEF-materceller
- Tilbered 40 ml 0,2 % gelatinoppløsning ved å fortynne 1 % gelatinstamoppløsning med PBS.
- Belegg fire 6-brønnsplater ved å dekke hver brønn med 2 ml 0,2 % gelatinløsning.
- Inkuber de gelatinbelagte platene ved 37 °C og 5 %CO2 i minst 30 minutter.
- Aspirer overflødig gelatinoppløsning og la platene tørke under strømningshetten.
- Tine to hetteglass (~ 4 millioner celler per hetteglass) med bestrålt embryonal fibroblast (iMEF) ved å virvle den i et vannbad på 37 °C.
MERK: For å redusere muligheten for kontaminering, vær forsiktig med å forhindre at vann spruter nær lokkåpningen. Tørk hetteglasset med et papirhåndkle og spray det med 70% etanol. - I vevskulturhetten pipetterer du innholdet i hvert tinte iMEFs hetteglass til ett 15 ml rør inneholdende 10 ml forvarmet hFib kulturmedium på en dråpevis måte og blander godt ved å snu tuben forsiktig.
- Spinn ned cellesuspensjonen ved 309 x g i 3 minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten fra hver tube. Resuspender hver cellepellet i 12 ml hFib medium.
- Plate 2 ml av cellesuspensjonen per brønn av de gelatinbelagte 6-brønnplatene. Fordel cellene jevnt ved å riste platene forsiktig i alle retninger.
- Inkuber platene ved 37 °C og 5 % CO2 over natten.
MERK: Forbered ferske iMEF-plater 24 timer før de brukes til omprogrammeringseksperimentet.
8. Overføring av de infiserte cellene til iMEF-materlaget
- Kast media fra infiserte og ikke-infiserte PDAC-, BxPc3-, H6c7- og hFib-celler. Vask hver brønn to ganger med PBS ved romtemperatur.
- Dissociate cellene fra platen ved å legge 0,5 ml trypsin til hver brønn. Inkuber PDAC-celler i en 37 ° C, 5% CO2 og 5% O2 (hypoksi) inkubator i 15 minutter.
- Inkuber BxPc3-celler ved 37 °C og 5 % CO2 i 5 minutter.
- Inkuber H6c7- og hFib-celler ved 37 °C og 5 % CO2 i 4 minutter.
- Overfør den dissosierte cellesuspensjonen fra hver brønn til 15 ml rør merket tilsvarende som infisert eller uinfisert.
- Høst cellene ved sentrifugering som følger: For PDAC, spinn cellesuspensjonen ved 300 x g i 5 minutter; for BxPc3, spinn cellesuspensjonen ved 120 x g i 5 minutter; for H6C7, spinn cellesuspensjonen ved 112 x g i 4 minutter; for hFib, spinn cellesuspensjonen ved 161 x g i 3 minutter. Utfør alle sentrifugeringene ved romtemperatur.
- Resuspender hver celletype pellet i 1 ml av det aktuelle dyrkningsmediet.
- Vask iMEF-platene tilberedt i trinn 7 med hvert celledyrkningsmedium to ganger. dvs. vask en plate med PDAC-medier, en med BxPc3-medier, en med H6C7-medium og den andre med hFib-medium.
- Plate 50.000 infiserte celler per brønn i fem brønner av iMEF 6-brønnplate. Plate 50.000 uinfiserte kontrollceller i den gjenværende en brønn av iMEF 6-brønnplate.
MERK: Optimaliser antall infiserte celler som skal belegges fra 1000 til 50 000 celler per brønn. - Inkuber PDAC-celler ved 37 °C, 5% CO2 og 5%O2 (hypoksi) over natten.
- Inkuber BxPc3-, H6C7- og hFib-celler ved 37 °C og 5 % CO2 over natten.
- Neste dag, forbered omprogrammeringsmedium som følger: tilsett 100 ml knockout serum erstatning (25% endelig), 5 ml 200 mM glutamin (1 mM final), 5 ml 100x ikke-essensielle aminosyrer (100 μM final), 1,5 ml beta-merkaptoetanol (0,1 mM endelig) til 400 ml modifisert ørnemedium (DMEM).
- Oppbevar omprogrammeringsmediet i 100 ml alikoter ved 4 °C i opptil 4 uker eller ved -20 °C lenger.
- Når den er klar til bruk, tilsett 100 μL av 10 mg/ml basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF) (10 ng/ml endelig) til én 100 ml omprogrammeringsmediealikot.
- Varm omprogrammeringsmediet i et vannbad på 37 °C.
- Vask cellene som vokser på iMEFs matere med forvarmede omprogrammeringsmedier to ganger.
Tilsett 2 ml omprogrammeringsmedium til hver brønn. - Overfør omprogrammeringsplatene til en 37 ° C, 5% CO2og 3% O2 (hypoksi) inkubator.
MERK: Dagen da omprogrammeringsmedier legges til, regnes som dag 1 av omprogrammering. - Fôr cellene daglig med ferske omprogrammeringsmedier til iPSC-kolonier begynner å vises.
MERK: Identifiser iPSC-kolonier ved deres ESC-lignende morfologi (kompakte kolonier med veldefinerte kanter og består av celler med høyt kjerne / cytoplasmaforhold). - Overvåk iPSC-koloniene daglig, og etter at et tilstrekkelig antall er dannet, pass dem som et basseng.
MERK: Sørg for at iPSC-koloniene ikke berører hverandre, da dette vil resultere i differensiering og påvirke deres langsiktige stabilitet. - For å etablere klonale linjer, passere iPSC-bassenget omtrent 5 ganger, og velg deretter robuste kolonier som opprettholder sin ESC-lignende morfologi.
- For å identifisere fullstendig omprogrammerte iPSC-kolonier, utfør levende farging med TRA-160 (se materialtabell), og høst RNA fra iPSC-kolonier for karakterisering av genuttrykk.
9. Passering av iPSC-kolonier
- Klargjør nok iMEF-materplater 24 timer før du passerer iPSC-koloniene som beskrevet i trinn 7.
- Vask iMEF-materplatene to ganger med forvarmede omprogrammeringsmedier.
- Tilsett 2 ml omprogrammeringsmedier supplert med ROCK-hemmer (Y2) (10 μM) til hver brønn med iMEF-plate.
- Inkuber iMEF-platene i en 37 °C, 5 % CO2 og 3 %O2-inkubator til de er klare til bruk.
- Klargjør etylendiamintetraeddiksyre / fosfatbufret saltoppløsning (EDTA / PBS) ved å fortynne 0,5 M EDTA 1:1000 i PBS (0,5 mM endelig).
- Erstatt omprogrammeringskulturmediet med 0,5 ml EDTA/PBS i hver brønn.
- Inkuber i en 37 ° C, 5% CO2 og 3% O2 inkubator eller ved romtemperatur, avhengig av celletype. BxPc3 og PDAC iPSC krever 15 min inkubasjon ved 37 °C. H6C7 og hFib iPSC må inkuberes ved romtemperatur i 5 minutter.
- Kontroller iPSCs-cellene under mikroskopet til de begynner å dissociere jevnt fra materlaget gjennom hele kolonien.
- Samle den dissosierte iPSC-cellesuspensjonen i et 15 ml sentrifugerør. Spinn ned ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml omprogrammeringsmedier supplert med Y2 (10 μM).
- Plate cellene på iMEF-materlaget ved å overføre hver 1 ml iPSC-cellesuspensjon til tre brønner på iMEF-platen.
MERK: Delingsforholdet kan variere avhengig av antall høstede iPSC-kolonier. - Inkubere i en 37 ° C, 5% CO2 og 3% O2 inkubator.
10. Levende farging av iPSC-kolonier med TRA-1-60
- Klargjør 0,5 ml per brønn på 4 μg/ml TRA-1-60 antistoff i omprogrammeringsmedier.
- Kast omprogrammeringsmediet og erstatt det med 0,5 ml antistoffblanding i hver brønn. Inkuber i en 37 ° C, 5% CO2 og 3% O2 inkubator i 30 minutter.
- Vask cellene to ganger med omprogrammeringsmediet.
- Ta fluorescensbilder med et cellebildesystem ved hjelp av GFP-filteret.
- Kontroller bildekvaliteten ved å vurdere den negative kontrollkanalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative bilder som viser morfologien til iPSC-kolonier avledet fra PDAC-, BXPc3-, H6C7- og hFib-celler er vist i figur 1. PDAC-iPSC-kolonier begynte å dannes på dag 25 av omprogrammering. Robuste iPSC-kolonier med en mer etablert ESC-lignende morfologi ble identifisert på dag 40 av omprogrammeringen (figur 1). På samme måte begynte dannelsen av BxPc3-iPSCs på dag 23 og ble mer etablert innen dag 35. H6C7-iPSC-dannelsen lignet PDAC-iPSCs og begynte å etablere seg på dag 45. hFib-iPSC kolonier begynte å danne på dag 15 av omprogrammering.
Figur 1: Representative bilder av iPSC-kolonier. Bildene viser etablert hESC-lignende morfologi avledet fra (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 og (D) hFib. Dagene med omprogrammering er angitt over hvert bilde. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Klonale iPSC-linjer ble etablert fra hver omprogrammering av PDAC-, BxPc3-, H6C7- og hFib-celler. Alle etablerte iPSC-linjer farget positivt for TRA-1-60, en udifferensiert hESC-celleoverflatemarkør, som bekrefter omprogrammeringen til pluripotens (figur 2).
Figur 2: Representative bilder av klonale iPSC-linjer. Bildene er hentet fra (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 og (D) hFib som viser ESC-lignende morfologi (topppaneler) og positiv farging for TRA-1-60 (nederste panel). Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å lette bruken av iPSC-omprogrammering for å studere kreftprogresjon, er det etablert en robust protokoll for omprogrammering av kreftceller i bukspyttkjertelen. Omprogrammering av kreftceller til pluripotens har vist seg å være svært utfordrende så langt, da bare noen få studier har lykkes med å generere iPSCs fra kreftceller 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. De fleste av disse studiene brukte udødeliggjorte kreftcellelinjer for å generere iPSC-linjer, ikke primære pasientavledede celler 36,37,38,40,42,43,44,46. For eksempel ble omprogrammering av fire forskjellige leverkreftcellelinjer forsøkt ved hjelp av retroviral introduksjon av OSKM-faktorer, men bare en enkelt cellelinje ble vellykket omprogrammert41. Imidlertid viste den genererte leverkreft iPSC-linjen et tap av stamme etter noen få passasjer, og fremhevet den høye motstanden til kreftceller til OSKM omprogrammering41. Tidligere ble det gjort forsøk på å omprogrammere PDAC-celler ved hjelp av lentiviral levering av OSKM individuelt; Imidlertid ble bare en enkelt iPSC-linje generert, avhengig av eksogent OSKM-uttrykk og derfor ikke fullstendig omprogrammert37. En annen studie brukte episomale vektorer for å levere OSKM-faktorer uten genomisk integrasjon, men klarte bare å generere en enkelt iPSC-klon fra PDAC39. Den begrensede suksessen med å omprogrammere kreftceller legger til de mange utfordringene som hindrer bruken av iPSC-teknologi i kreftforskning.
Her forklares genereringen av iPSCer fra primære PDAC-prøver avledet fra to forskjellige pasienter og en etablert PDAC-cellelinje (BxPc3). Videre har iPSCs også blitt generert fra H6c7, en pankreatisk duktal epitelcellelinje. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten om vellykkede utledede stabile iPSC-linjer fra BxPc3 og H6c7. Etter denne protokollen har iPSCs også blitt generert fra primære humane fibroblaster avledet fra friske individer, og utvider anvendeligheten av metoden utover kreftforskning.
Et av nøkkelelementene bak suksessen til protokollen er bruken av bicistroniske lentivirale vektorer for å uttrykke OS- og KM-faktorer samtidig. Disse vektorene inneholder det interne ribosominngangsstedet 2 (IRES2) for å uttrykke OCT4 og SOX2 i den ene vektoren og KLF4 og cMYC i den andre. Flere studier ved bruk av monocistronic vektorer hvor hver omprogrammeringsfaktor ble levert individuelt har vist at opptaket av hver vektor er forskjellig, noe som påvirker OSKM støkiometri og omprogrammeringseffektivitet47. Bruk av bicistroniske vektorer kan bidra til å redusere dette problemet. Videre har bruk av IRES i lentivirale vektorer vist en betydelig økning i omprogrammeringseffektivitet48. I dette lentivirussystemet drives OS-uttrykk av EF1a-promotoren, mens KM-uttrykk er under kontroll av en CMV-promotor. Det er kjent at CMV-promotoren kan bli utsatt for svært effektiv silencing ved DNA-metylering og histondeacetylering, i motsetning til EF1a49,50. Derfor kan tidlig deaktivering av KM før OS under omprogrammering være en nøkkelfaktor for suksessen til protokollen. Dette stemmer overens med tidligere studier som viser viktigheten av OSKMs uttrykksdynamikk under omprogrammering 51,52,53,54,55. Dermed er bicistronvektoren også mer fordelaktig enn den polycistroniske vektoren, hvor alle OSKM-faktorer uttrykkes fra en enkelt promotor56. Andre faktorer som bidrar til suksessen til protokollen inkluderer doser av lentivirusinfeksjon og antall infiserte celler som brukes til omprogrammering, som ble tilpasset for hver celletype.
Oppsummert presenteres en optimalisert metode for omprogrammering av primære PDAC-celler sammen med andre cellelinjer og normale celler. Denne metoden vil bidra til å utvide bruken av iPSC-omprogrammering for å modellere kreftprogresjon og, i dette tilfellet, oppdage tidlige PDAC-biomarkører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
AS og JK ønsker å takke Cancer Research UK og OHSU for finansiering (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S støttes av en MRC karriereutviklingspris (MR / N024028 / 1). AA er finansiert av en Ph.D. stipend (stipend ref. 1078107040) fra King Abdulaziz City for Science and Technology. JK er finansiert av MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) og Knight CEDAR grant (68182-933-000, 68182-939-000). Vi takker professor Keisuke Kaji for vennlig å gi omprogrammeringsvektoren pSIN4-EF1a-O2S og pSIN4-CMV-K2M. For formålet med åpen tilgang har forfatteren anvendt en Creative Commons Attribution (CC BY)-lisens på enhver forfatterakseptert manuskriptversjon som oppstår fra denne innsendingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 | |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 | |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 | |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 | |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 | |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 | |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 | |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML | |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B | |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP | |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V | |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 | |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | |
| pMDG | AddGene | 187440 | |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G | |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 | |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 | |
| psPAX2 | AddGene | 12260 | |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 | |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 | |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 | |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
References
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Hu, J. X., et al. Pancreatic cancer: A review of epidemiology, trend, and risk factors. World Journal of Gastroenterology. 27 (27), 4298 (2021).
- Howlader, N., et al. SEER cancer statistics review, 1975-2013. National Cancer Institute. 19, Bethesda, MD. (2016).
- Bengtsson, A., Andersson, R., Ansari, D. The actual 5-year survivors of pancreatic ductal adenocarcinoma based on real-world data. Scientific Reports. 10 (1), 16425 (2020).
- He, J., et al. 2564 resected periampullary adenocarcinomas at a single institution: trends over three decades. HPB. 16 (1), 83-90 (2014).
- Dusch, N., et al. Factors predicting long-term survival following pancreatic resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas: 40 years of experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 18 (4), 674-681 (2014).
- Principe, D. R., et al. The current treatment paradigm for pancreatic ductal adenocarcinoma and barriers to therapeutic efficacy. Frontiers in Oncology. 11, 688377 (2021).
- Papademetrio, D. L., et al. Interplay between autophagy and apoptosis in pancreatic tumors in response to gemcitabine. Targeted Oncology. 9 (2), 123-134 (2014).
- Ng, S. S., Tsao, M. S., Nicklee, T., Hedley, D. W. Effects of the epidermal growth factor receptor inhibitor OSI-774, Tarceva, on downstream signaling pathways and apoptosis in human pancreatic adenocarcinoma 1 supported by the National Cancer Institute of Canada and the Pat Myhal Fund for Pancreatic Cancer Research. Molecular Cancer Therapeutics. 1 (10), 777-783 (2002).
- Sultana, A., et al. Meta-analyses of chemotherapy for locally advanced and metastatic pancreatic cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (18), 2607-2615 (2007).
- Sun, J., Russell, C. C., Scarlett, C. J., McCluskey, A. Small molecule inhibitors in pancreatic cancer. RSC Medicinal Chemistry. 11 (2), 164-183 (2020).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Hruban, R. H., et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. The American Journal of Surgical Pathology. 25 (5), 579-586 (2001).
- Maitra, A., Hruban, R. H.
- Vincent, A., Herman, J., Schulick, R., Hruban, R. H., Goggins, M.
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Lennon, A. M., et al. The early detection of pancreatic cancer: what will it take to diagnose and treat curable pancreatic neoplasia. Cancer Research. 74 (13), 3381-3389 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Research. 67 (3), 1030-1037 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Suvà, M. L., et al. Reconstructing and reprogramming the tumor-propagating potential of glioblastoma stem-like cells. Cell. 157, 580-594 (2014).
- Kotini, A. G., et al. Stage-specific human induced pluripotent stem cells map the progression of myeloid transformation to transplantable leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Stricker, S. H., et al. Widespread resetting of DNA methylation in glioblastoma-initiating cells suppresses malignant cellular behavior in a lineage-dependent manner. Genes Development. 27 (6), 654-669 (2013).
- Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
- Aparicio, L. A., et al. Clinical implications of epithelial cell plasticity in cancer progression. Cancer letters. 366 (1), 1-10 (2015).
- Grimont, A., Leach, S. D., Chandwani, R. Uncertain beginnings: acinar and ductal cell plasticity in the development of pancreatic cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (2), 369-382 (2022).
- Greenspan, L. J., Weinstein, B. M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 24 (2), 251-269 (2021).
- Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
- Zhang, X., Cruz, F. D., Terry, M., Remotti, F., Matushansky, I. Terminal differentiation and loss of tumorigenicity of human cancers via pluripotency-based reprogramming. Oncogene. 32 (18), 2249-2260 (2013).
- Kim, J., et al. An iPSC line from human pancreatic ductal adenocarcinoma undergoes early to invasive stages of pancreatic cancer progression. Cell Reports. 3 (6), 2088-2099 (2013).
- Kim, J., et al. Detection of early pancreatic ductal adenocarcinoma with thrombospondin-2 and CA19-9 blood markers. Science Translational Medicine. 9 (398), (2017).
- Susac, L., et al. Structure of a fully assembled tumor-specific T cell receptor ligated by pMHC. Cell. 185 (17), 3201-3213 (2022).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Carette, J. E., et al. Generation of iPSCs from cultured human malignant cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 115 (20), 4039-4042 (2010).
- Choi, S. M., et al. Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 118 (7), 1801-1805 (2011).
- Hochedlinger, K., et al. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes & Development. 18 (15), 1875-1885 (2004).
- Hu, K., et al. Efficient generation of transgene-free induced pluripotent stem cells from normal and neoplastic bone marrow and cord blood mononuclear cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 117 (14), e109-e119 (2011).
- Iskender, B., Izgi, K., Canatan, H. Reprogramming bladder cancer cells for studying cancer initiation and progression. Tumor Biology. 37, 13237-13245 (2016).
- Khoshchehreh, R., et al. Epigenetic reprogramming of primary pancreatic cancer cells counteracts their in vivo tumourigenicity. Oncogene. 38 (34), 6226-6239 (2019).
- Kim, H. J., et al. Establishment of hepatocellular cancer induced pluripotent stem cells using a reprogramming technique. Gut and Liver. 11 (2), 261 (2017).
- Lin, S. L., et al. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA. 14 (10), 2115-2124 (2008).
- Miyoshi, N., et al. Defined factors induce reprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 40-45 (2010).
- Singovski, G., et al. In vivo epigenetic reprogramming of primary human colon cancer cells enhances metastases. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 157-173 (2016).
- Zhao, H., et al. A highly optimized protocol for reprogramming cancer cells to pluripotency using nonviral plasmid vectors. Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells". 17 (1), 7-18 (2015).
- Lo, C. A., et al. Quantification of protein levels in single living cells). Cell Reports. 13 (11), 2634-2644 (2015).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Prösch, S., et al. Inactivation of the very strong HCMV immediate early promoter by DNA CpG methylation in vitro. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 377 (3), 195-201 (1996).
- Mehta, A. K., Majumdar, S. S., Alam, P., Gulati, N., Brahmachari, V. Epigenetic regulation of cytomegalovirus major immediate-early promoter activity in transgenic mice. Gene. 428 (1-2), 20-24 (2009).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Chronis, C., et al. Cooperative binding of transcription factors orchestrates reprogramming. Cell. 168 (3), 442-459 (2017).
- Li, D., et al. Chromatin accessibility dynamics during iPSC reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (6), 819-833 (2017).
- Soufi, A., Donahue, G., Zaret, K. S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors' initial engagement with the genome. Cell. 151 (5), 994-1004 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
