Summary
본 프로토콜은 췌관 선암종(PDAC)과 정상 췌관 상피세포를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 방법을 설명합니다. 당사는 렌티바이러스 준비부터 안정적인 iPSC 라인 구축에 이르기까지 최적화되고 상세한 단계별 절차를 제공합니다.
Abstract
전사 인자를 사용한 유도만능줄기세포(iPSC)의 생성은 거의 모든 분화된 세포 유형에서 이루어졌으며 연구 및 임상 응용 분야에서 매우 가치 있는 것으로 입증되었습니다. 흥미롭게도, 췌관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)과 같은 암세포의 iPSC 재프로그래밍은 침습성 PDAC 표현형을 되돌리고 암 후성유전체를 무시하는 것으로 나타났습니다. PDAC 유래 iPSC의 분화는 초기 췌장 상피내 종양(PanIN) 전구체에서 PDAC 진행을 재현하여 PDAC 진행 초기에 발생하는 분자 및 세포 변화를 밝힐 수 있습니다. 따라서 PDAC에서 파생된 iPSC는 조기 검출 진단 마커를 발견하기 위해 PDAC의 초기 단계를 모델링하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 초기 PanIN 단계에 대한 신뢰할 수 있는 바이오마커가 부족하기 때문에 일반적으로 후기 전이성 단계에서 진단되는 PDAC 환자에게 특히 중요합니다. 그러나 PDAC를 포함한 암 세포주를 다능성으로 재프로그래밍하는 것은 여전히 어렵고 노동 집약적이며 서로 다른 세포 주 간에 매우 가변적입니다. 여기서는 bicistronic 렌티바이러스 벡터를 사용하여 다양한 인간 PDAC 세포주에서 iPSC를 생성하기 위한 보다 일관된 프로토콜에 대해 설명합니다. 그 결과 iPSC 라인은 안정적이며, 재프로그래밍 인자 또는 유도성 약물의 외인성 발현에 의존하지 않습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 광범위한 PDAC 유래 iPSC의 생성을 용이하게 하며, 이는 PDAC 사례를 보다 구체적이고 대표하는 초기 바이오마커를 발견하는 데 필수적입니다.
Introduction
췌관 선암(PDAC)은 가장 치명적인 악성 종양 중 하나이며, 질병의 무증상 특성으로 인해 조기 진단이 여전히 어렵습니다. PDAC 환자의 대다수는 매우 제한된 치료 옵션을 이용할 수 있는 진행성 전이성 단계에서 진단됩니다 1,2. 이는 주로 혈류로 방출되는 단백질로 편리하게 검출될 수 있는 것과 같은 초기 단계에 대한 신뢰할 수 있는 바이오마커가 부족하기 때문입니다.
PDAC는 진행 중 매우 초기에 퍼질 수 있으며, PDAC가 췌장에 국한되어 있을 때 더 나은 예후가 암 조기 발견과 관련이 있다3. 그러나 PDAC 환자의 10분의 1 미만이 예후가 양호하여 외과적 절제가 가능하다는 진단을 받습니다. 그럼에도 불구하고 절제 가능한 종양이 있는 소수의 종양은 12개월 이내에 재발하기 쉽다4.
지난 50년 동안 수술 기법, 환자 치료 및 치료 방식에서 괄목할 만한 개선이 이루어졌다 5,6. 그러나 수술로 절제된 PDAC 환자의 5년 생존율은 17%로 거의 증가하지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 이는 거의 변하지 않은 비절제 환자(0.9%)보다 여전히 양호합니다4,7. 화학 요법은 유일한 대체 PDAC 치료법입니다. 그러나 대다수의 PDAC 환자가 젬시타빈 7,8과 같은 화학요법 약물에 강한 내성을 보이기 때문에 이 옵션은 매우 제한적입니다. 엘로티닙(Erlotinib)과 같은 다른 약물은 특정 돌연변이를 가진 소수의 PDAC 환자에게만 제공되며, 이들 중 대부분은 엘로티닙 내성을 보인다9. 대부분의 PDAC 환자에서 화학요법과 관련된 부작용은 이 치료법의 또 다른 단점이다10. 최근에는 면역관문억제제(ICI)와 저분자 키나아제 억제제(SMKI)가 PDAC 치료에 효과적일 수 있다는 유망한 전략이 제시되었지만, 이러한 표적 치료제에 대한 지속적인 반응은 여전히 소수의 환자로 제한되어 있다11,12. 전반적으로, PDAC 특이적 초기 바이오마커의 발견은 조기 진단 및 치료를 위한 새로운 길을 열 수 있습니다.
PDAC는 비침습적 췌관 상피 증식(non-invasive pancreatic tulatial epithelial proliferations)으로 인한 췌장 상피내 신생물(panIN) 전구체 병변에서 발생한다13,14. PanIN의 형성은 KRAS와 같은 종양유전자 돌연변이에 의해 시작되지만, PDAC로 진행되기 위해서는 추가적인 유전적 및 후성유전학적 변형이 필요합니다. PanIN이 여러 단계를 거쳐 침습적 PDAC로 진행되는 데는 약 10년이 걸릴 것으로 예상됩니다 13,15,16,17. 이 기간은 조기 PDAC 진단의 이점을 누릴 수 있는 좋은 기회를 제공합니다. 따라서 PDAC 진행을 연구하기 위해 종양 이종이식 동물 모델 및 오가노이드 배양을 확립하기 위한 광범위한 연구가 수행되었습니다 18,19,20,21. 이러한 모델은 PDAC의 침습 단계를 연구하는 데 매우 유용하지만 초기 PanIN 단계로부터의 전환은 아닙니다. 따라서 조기 검출 바이오마커를 발견할 수 있도록 PanIN 단계의 초기 진행을 재현할 수 있는 실험 모델을 개발하는 것이 중요합니다.
4개의 전사 인자 OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC(OSKM)를 사용하여 체세포를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 것은 세포 가소성의 정도를 보여줍니다22. 암세포 가소성은 잘 문서화되어 있으며, 인간 암세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 것은 세포를 원래의 세포 상태로 재설정하는 데 성공적으로 사용되어 암 진행 중에 축적된 많은 후성유전학적 모욕을 제거했습니다 23,24,25,26,27,28,29. 따라서 암세포 정체성을 조작하기 위해 이 재프로그래밍 전략을 사용할 수 있는 가능성은 암 치료에 큰 가능성을 제시했다30,31. 실제로, PDAC에서 유래한 iPSC의 분화가 초기 PanIN 단계(32)를 통해 PDAC 진행을 재현할 수 있음을 이전에 보여주었습니다. PDAC의 초기에서 중간 단계에 특이적인 유전자 및 경로를 식별함으로써 조기 PDAC 진단에 임상적으로 사용할 수 있는 후보 바이오마커를 식별했습니다32,33. 그러나, 단일 iPSC 라인을 사용하여 발견된 바이오마커는 PDAC 환자의 대다수에서 제한된 커버리지를 보였다32. 다른 PDAC 환자로부터 iPSC 세포주를 생성하는 데 따르는 어려움으로 인해 보다 신뢰할 수 있는 바이오마커를 발견하는 능력이 중단되었습니다. 이는 OSKM 전달의 이질성을 포함한 많은 기술적 요인 때문인데, 인간 1차 PDAC 세포의 극히 일부만이 4가지 요인을 모두 포함하고 재프로그래밍에 성공적으로 반응했기 때문입니다. 여기에서는 OSKM의 보다 효율적이고 일관된 이중 렌티바이러스 전달을 사용하여 1차 PDAC 세포를 재프로그래밍하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 실험 프로토콜은 OHSU Institutional Review Board의 승인을 받았습니다. 모든 방법은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. PDX 종양에 대한 모든 동물 실험은 OHSU IACUC(Institutional Animal Use and Care Committee)의 승인을 받아 수행되었습니다. 이 프로토콜은 선암이 있는 61세 여성 환자의 췌장 조직에서 분리된 상피 형태를 나타내는 환자 유래 이종이식(PDX)의 일차 PDAC 세포주, 정상 인간 췌관 상피에서 유래한 H6C7 불멸화 상피 세포주 및 건강한 개인의 피부 생검에서 유래한 일차 인간 섬유아세포에서 테스트되었습니다. 인간 PDAC 표본은 Oregon Pancreas Tissue Registry 연구(IRB00003609)에 따라 획득되었습니다. 모든 피험자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었다. 인간 1차 섬유아세포는 영국 에딘버러의 RBiomedical에서 영국 리틀 프랑스의 에딘버러 왕립 병원에서 그들의 동의와 윤리적 승인 하에 일상적인 수술을 받는 익명의 기증자의 피부 샘플로부터 유래되었습니다(09/MRE00/91). 모든 렌티바이러스 연구는 Class 2 연구 활동(GM207/16.6)에 따라 수행되었으며 에든버러 대학의 보건 및 안전 부서의 승인을 받았으며 스코틀랜드 정부의 HSE 관할 당국에 통보되었습니다. 인간 췌장 세포를 이용한 모든 재프로그래밍 실험은 에딘버러 대학의 생명과학부 윤리 위원회의 윤리적 승인 하에 수행되었다(참고 문헌 # asoufi-0002).
1. 렌티바이러스의 제조
- 렌티바이러스 전처리를 위해 psPAX2, pMDG34 및 2개의 RES 함유 bicistronic 벡터를 포함하여 1-2 μg/μL 농도의 고품질 패키징 및 발현 플라스미드(내독소 없음)를 준비합니다. EF-1α 프로모터에 의해 구동되는 OCT4 및 SOX2 발현에 대한 pSIN4-EF1a-O2S 인코딩, 및 CMV 인핸서/프로모터(35 )에 따른 KLF4 및 c-MYC 발현에 대한 pSIN4-CMV-K2M( 재료 표 참조). 또한, transfection control로 사용할 pWPT-GFP plasmid를 준비합니다.
- 인간 배아 신장 세포주(293T)를 해동하고 글래스고의 최소 필수 배지(GMEM)에서 배양하고 10% 태아 송아지 혈청(FCS), 1x 비필수 아미노산, 1mM 피루브산 나트륨 및 1mM 글루타민을 37°C( 재료 표 참조) 37°C 및 5%CO2에서 보충합니다.
알림: 해동 후 4개의 통로 내에서 293T 세포를 사용하는 것이 좋습니다. - 형질주입 전 24시간 동안 15cm 접시당 300만 개의 세포 밀도로 293T를 파종합니다. 총 3 가지 요리가 필요합니다. 늦은 오후~16:00에 세포를 파종하는 것이 바람직하다.
- 다음 날(~16:00), 세포가 ~40%-50% 밀도에 도달하면 세 가지 transfection 반응에 대해 다음을 준비합니다.
참고: 항상 10%의 부피를 추가하여 피펫팅 오류를 고려하십시오.- 3개의 15mL 플라스틱 튜브에 적절한 렌티바이러스 이름(pSIN4-EF1a-O2S, pSIN4-CMV-K2M 및 pwPT-GFP 대조군)을 라벨링합니다. 각 튜브에 1.710mL 환원 혈청 배지( 재료 표 참조)를 추가합니다.
- 90μL transfection 시약( 재료 표 참조)을 1.710mL 환원 혈청 배지에 희석하고 2초 동안 꼭짓점으로 혼합한 후 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 포장 벡터를 혼합합니다. 5.1μg의 psPAX2 및 2.4μg의 pMDG(총 7.5μg).
- 패키징 벡터 혼합물을 transfection 배지(단계 1.4.2)에 추가하고 2초 동안 소용돌이를 일으킵니다.
- 각 재프로그래밍 벡터: pSIN4-EF1a-O2S 및 pSIN4-CMV-K2M 및 pwPT-GFP 대조군을 단계 (1.4.4)의 transfection 혼합물에 7.5μg을 추가하고 2초 동안 와류에 추가합니다.
참고: 1:1 비율로 expression vector: viral vector를 사용합니다.
- transfection tube를 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 단계 (1.4.5)의 transfection-DNA 혼합물을 적적 방식으로 배지에 직접 첨가하여 각 렌티바이러스로 293T 세포를 transfection합니다. 전체 표면에 고르게 분포되도록 접시를 휘젓습니다.
- 형질주입된 세포를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.
알림: 바이러스 관련 폐기물, 금속 폐기 버킷, 오토클레이브 백이 있는 이중 백을 사용하고 바이러스용 액체 폐기물 용기를 가져와 소독제를 추가합니다. 모든 피펫, 팁 및 튜브를 금속 양동이에 폐기하십시오. 오래된 미디어는 바이러스 액체 폐기물 용기에 폐기하십시오. 우발적인 바이러스 오염을 제거하기 위해 유리 피펫 및 유리 제품을 사용하지 마십시오. - transfection 후 14-16시간 후 배지를 30mL의 신선한 293T 배지로 교체합니다.
- 형질주입된 세포를 37°C, 5%CO2 에서 배지 변화 후 60-72시간 동안 배양합니다. 매일 세포를 관찰하고 GFP 형광으로 transfection 효율을 확인합니다.
참고: 이상적으로, transfection 효율은 GFP에 의해 >90%가 되어야 합니다. 다른 바이러스의 경우, 293T 세포는 바이러스 입자를 생성할 때 더 둥글게 되는 경향이 있기 때문에 명확한 형태학적 변화를 관찰해야 합니다. - 각 바이러스 transfection 배양액의 배지를 50mL 튜브에 모으고 스핀다운하여 4°C에서 10분 동안 1932 x g 에서 세포 파편을 제거합니다.
- 0.45μM 주사기 필터를 통해 각 렌티바이러스 상층액을 여과하여 작은 파편을 제거하고 새 50mL 튜브에 수집합니다.
- 각 렌티바이러스 상층액을 6mL 분취액으로 나누고 각각 액체 질소에 급속 냉동합니다.
- 렌티바이러스 부분 표본은 사용할 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
2. 렌티바이러스 형질도입 재프로그래밍
- 37 °C, 5%CO2 및 5%O2 (저산소증) 인큐베이터에서 소 뇌하수체 추출물(BPE), 인간 재조합 표피 성장 인자(EGF) 5ng/mL 및 콜레라 독소를 50ng/mL로 보충한 완전히 정의된 각질 세포 무함유 배지(KSFM)에서 1차 PDAC 세포 및 배양을 해동합니다( 재료 표 참조).
- 37°C에서 10% 태아 송아지 혈청(FCS) 및 5%CO2가 보충된 RPMI 1640 배지에서 편평 췌관 선암 세포주인 BxPc3를 해동합니다.
- BPE 및 EGF가 보충된 KSFM에서 H6C7 세포, 췌관 상피 세포 및 배양을 37°C 및 5%CO2에서 5ng/mL로 해동합니다.2.
- 37 ° C 및 5 % CO2에서 10 % FCS, 1x 비 필수 아미노산, 1 mM 피루브 산 나트륨 및 1 mM 글루타민, 0.05 mM (최종) 베타 - 메르 캅토 에탄올이 보충 된 글래스고의 최소 필수 배지 (GMEM)에서 인간 섬유 아세포 (hFib) 및 배양을 해동합니다.
- 렌티바이러스 형질도입 하루 전(가급적이면 늦은 오후)에 PDAC, BxPc3, H6C7 및 hFib 세포 각각의 웰당 100,000개의 세포를 포함하는 6-웰 플레이트의 두 웰을 준비합니다. 하나는 OSKM 렌티바이러스로 감염시키고 다른 하나는 감염되지 않은 대조군으로 사용합니다.
알림: 각 셀 유형에 대해 별도의 플레이트를 사용하십시오. - 다음 날 오후(약 24시간 후)에 다음 렌티바이러스 감염 단계를 진행하기 전에 세포 밀도가 70% 이상에 도달하는지 확인합니다.
3. PDAC의 렌티바이러스 형질도입
- 37°C 바이러스 인큐베이터에서 각 렌티바이러스 상층액 5mL를 해동합니다.
- 각각 2mL의 사전 예열된 PDAC 배양 배지가 들어 있는 2개의 15mL 튜브를 준비합니다.
- 첫 번째 튜브에 각 재프로그래밍 렌티바이러스(pSIN4-CMV-K2M 및 pSIN4-EF1a-O2S) 6mL와 4.5mg/mL 폴리브렌 12μL(최종 4.5μg/mL, 재료 표 참조)를 넣고 혼합합니다.
- 두 번째 튜브에 2μL의 4.5mg/mL 폴리브렌(최종 4.5μg/mL)을 추가합니다.
- 각 웰에서 배지를 버리고 실온에서 PBS로 한 번 세척합니다.
- 재프로그래밍 감염 배지(튜브 1)를 첫 번째 웰에 추가합니다.
- 튜브 2의 혼합물을 두 번째 웰에 추가합니다. 이것이 감염되지 않은 제어가 됩니다.
- PDAC 세포를 37°C, 5%CO2 및 5%O2 (저산소증) 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.
- 다음날 오후에 양쪽 우물에서 배지를 버리고 새 PDAC 배양 배지로 교체합니다.
- 세포를 37 °C, 5 % CO2 및 5 % O2 (저산소증)에서 48 시간 동안 배양합니다.
4. BxPc3 세포의 렌티바이러스 형질도입
- 37°C 바이러스 인큐베이터에서 각 렌티바이러스 상층액 3mL를 해동합니다.
- 각각 2mL의 BxPc3 배양 배지가 들어 있는 2개의 15mL 튜브를 준비합니다.
- 첫 번째 튜브에 각 재프로그래밍 렌티바이러스(pSIN4-CMV-K2M 및 pSIN4-EF1a-O2S) 3mL와 4.5mg/mL 폴리브렌 6μL(최종 4.5μg/mL)를 넣고 혼합합니다.
- 두 번째 튜브에 2μL의 4.5mg/mL 폴리브렌(최종 4.5μg/mL)을 추가합니다.
- 각 우물에서 배지를 버리고 PBS로 한 번 씻으십시오.
- 재프로그래밍 감염 배지(튜브 1)를 첫 번째 웰에 추가합니다.
- 튜브 2의 혼합물을 두 번째 웰에 추가합니다. 이것이 감염되지 않은 제어가 됩니다.
- 감염된 BxPc3 세포를 37°C 바이러스 및 5%CO2 에서 밤새 배양합니다.
- 다음날 오후에 양쪽 우물에서 배지를 버리고 신선한 BxPc3 배양 배지로 교체합니다.
- 세포를 37 °C 및 5 % CO2 에서 48 시간 동안 배양합니다.
5. H6c7 세포 감염의 렌티바이러스 형질도입
- 37°C 바이러스 인큐베이터에서 각 렌티바이러스 상층액 4mL를 해동합니다.
- 각각 2mL H6c7 배양 배지가 들어 있는 15mL 튜브 2개를 준비합니다.
- 첫 번째 튜브에 각 재프로그래밍 렌티바이러스(pSIN4-CMV-K2M 및 pSIN4-EF1a-O2S) 4mL 4mL와 4.5mg/mL 폴리브렌(최종 4.5μg/mL) 8μL를 추가하고 혼합합니다.
- 두 번째 튜브에 2μL의 4.5mg/mL 폴리브렌(최종 4.5μg/mL)을 추가합니다.
- 양쪽 우물에서 배지를 버리고 PBS로 한 번 씻으십시오.
- 재프로그래밍 감염 배지(튜브 1)를 첫 번째 웰에 추가합니다.
- 튜브 2의 혼합물을 두 번째 웰에 추가합니다. 이것이 감염되지 않은 제어가 됩니다.
- 감염된 H6C7 세포를 37°C 바이러스 및 5%CO2 에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 다음날 오후에 두 우물에서 배지를 버리고 신선한 H6c7 배양 배지로 교체합니다.
- 세포를 37 °C 및 5 % CO2 에서 48 시간 동안 배양합니다.
6. hFib 세포의 렌티바이러스 형질도입
- 37°C 바이러스 인큐베이터에서 각 렌티바이러스 상층액 2mL를 해동합니다.
- 각각 2mL hFib 배양 배지가 들어 있는 2개의 15mL 튜브를 준비합니다.
- 첫 번째 튜브에 각 재프로그래밍 바이러스(pSIN4-CMV-K2M 및 pSIN4-EF1a-O2S) 2mL를 추가하고 4μL의 4.5mg/mL 폴리브렌(최종 4.5μg/mL)을 추가하고 혼합합니다.
- 두 번째 튜브에 2μL의 4.5mg/mL 폴리브렌(최종 4.5μg/mL)을 넣고 혼합합니다.
- 각 우물에서 배지를 버리고 PBS로 한 번 씻으십시오.
- 재프로그래밍 감염 배지(튜브 1)를 첫 번째 웰에 추가합니다.
- 튜브 2의 혼합물을 두 번째 웰에 추가합니다. 이것이 감염되지 않은 제어가 됩니다.
- 감염된 hFib 세포를 37°C 및 5%CO2 에서 밤새 배양합니다.
- 다음날 오후에 두 우물에서 배지를 버리고 신선한 hFib 배양 배지로 교체합니다.
- 세포를 37 °C 및 5 % CO2 에서 48 시간 동안 배양합니다.
참고: 효율적인 렌티바이러스 형질도입을 위해 렌티바이러스의 양은 세포 유형에 따라 크게 다르므로 신중하게 역가를 정하십시오. 일부 세포 유형에는 여러 개의 렌티바이러스 형질도입이 필요할 수 있습니다. PDAC 세포주는 최대 3회 투여가 필요한 반면, BxPc3, H6C7 및 hFib 세포주를 재프로그래밍하는 데는 1회 투여로 충분했습니다.
7. iMEF 공급 셀의 제조
- PBS로 1% 젤라틴 원액을 희석하여 40mL 0.2% 젤라틴 용액을 준비합니다.
- 각 웰을 0.2% 젤라틴 용액 2mL로 덮어 4개의 6웰 플레이트를 코팅합니다.
- 젤라틴 코팅 플레이트를 37 °C 및 5 % CO2 에서 최소 30 분 동안 배양합니다.
- 여분의 젤라틴 용액을 흡인하고 플레이트를 플로우 후드 아래에서 건조시킵니다.
- 방사선 조사된 마우스 배아 섬유아세포(iMEF)의 바이알 2개(바이알당 ~ 400만 셀)를 37°C 수조에서 소용돌이쳐 해동합니다.
알림: 오염 가능성을 줄이려면 뚜껑 입구 근처에 물이 튀지 않도록 주의하십시오. 종이 타월로 바이알을 말리고 70% 에탄올을 뿌립니다. - 조직 배양 후드에서 해동된 각 iMEF 바이알의 내용물을 10mL의 예열된 hFib 배양 배지가 들어 있는 15mL 튜브 하나에 피펫팅하고 튜브를 부드럽게 뒤집어 잘 혼합합니다.
- 실온에서 309 x g 에서 3분 동안 셀 현탁액을 회전시키고 각 튜브에서 상층액을 제거합니다. 각 세포 펠릿을 12mL hFib 배지에 재현탁시킵니다.
- 젤라틴 코팅된 6웰 플레이트의 웰당 세포 현탁액 2mL를 플레이트합니다. 플레이트를 모든 방향으로 부드럽게 흔들어 세포를 고르게 분포시킵니다.
- 플레이트를 37 °C 및 5 % CO2 에서 밤새 배양합니다.
알림: 재프로그래밍 실험에 사용하기 24시간 전에 새 iMEF 플레이트를 준비하십시오.
8. 감염된 세포를 iMEF 피더 레이어로 이동
- 감염된 PDAC, BxPc3, H6c7 및 hFib 세포에서 미디어를 폐기합니다. 실온에서 PBS로 각각 두 번 잘 씻으십시오.
- 각 웰에 0.5mL의 트립신을 추가하여 플레이트에서 세포를 분리합니다. PDAC 세포를 37°C, 5%CO2 및 5%O2 (저산소증) 인큐베이터에서 15분 동안 배양합니다.
- BxPc3 세포를 37°C 및 5%CO2 에서 5분 동안 배양합니다.
- H6c7 및 hFib 세포를 37°C 및 5%CO2 에서 4분 동안 배양합니다.
- 해리된 세포 현탁액을 각 웰에서 감염 또는 비감염으로 표시된 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 다음과 같이 원심분리를 통해 세포를 수확합니다: PDAC의 경우 세포 현탁액을 300 x g 에서 5분 동안 회전시킵니다. BxPc3의 경우 셀 현탁액을 120 x g 에서 5분 동안 회전시킵니다. H6C7의 경우 셀 현탁액을 112 x g 에서 4분 동안 회전시킵니다. hFib의 경우 셀 현탁액을 161 x g 에서 3분 동안 회전시킵니다. 실온에서 모든 원심분리를 수행합니다.
- 각 세포 유형 펠릿을 적절한 배양 배지 1mL에 재현탁시킵니다.
- 7단계에서 준비한 iMEF 플레이트를 각 세포 유형 배양 배지로 2회 세척합니다. 즉, 한 접시는 PDAC 매체로, 하나는 BxPc3 매체로, 하나는 H6C7 배지로, 다른 하나는 hFib 배지로 세척합니다.
- 웰당 감염된 세포 50,000개를 iMEF 6웰 플레이트 5웰에 플레이트합니다. 감염되지 않은 대조군 세포 50,000개를 iMEF 6웰 플레이트의 나머지 웰 1개에 플레이트합니다.
참고: 웰당 1,000개에서 50,000개까지 도금할 감염된 세포의 수를 최적화합니다. - PDAC 세포를 37 °C, 5 % CO2 및 5 % O2 (저산소증)에서 밤새 배양합니다.
- BxPc3, H6C7 및 hFib 세포를 37°C 및 5%CO2 에서 밤새 배양합니다.
- 다음 날, 다음과 같이 재프로그래밍 배지를 준비합니다: 100mL 녹아웃 혈청 치환(25% 최종), 200mM 글루타민 5mL(1mM 최종), 100x 비필수 아미노산 5mL(100μM 최종), 베타-메르캅토에탄올 1.5mL(0.1mM 최종)를 400mL DMEM(Modified Eagle Medium)에 추가합니다.
- 재프로그래밍 배지를 100mL 부분 표본에 담아 4°C에서 최대 4주 동안 또는 -20°C에서 더 오래 보관합니다.
- 사용할 준비가 되면 100μL의 10mg/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)(최종 10ng/mL)를 100mL 재프로그래밍 배지 부분 표본 1개에 추가합니다.
- 37°C 수조에서 리프로그래밍 미디어를 데우십시오.
- iMEFs 피더에서 자라는 세포를 미리 예열된 재프로그래밍 배지로 두 번 세척합니다.
각 웰에 2mL의 재프로그래밍 배지를 추가합니다. - 재프로그래밍 플레이트를 37°C, 5%CO2및 3%O2 (저산소증) 인큐베이터로 옮깁니다.
알림: 재프로그래밍 미디어가 추가된 날은 재프로그래밍의 1일차로 간주됩니다. - iPSC 콜로니가 나타나기 시작할 때까지 매일 세포에 새로운 재프로그래밍 배지를 공급합니다.
참고: ESC와 유사한 형태(가장자리가 잘 정의되고 핵/세포질 비율이 높은 세포로 구성된 조밀한 콜로니)로 iPSC 콜로니를 식별합니다. - 매일 iPSC 콜로니를 모니터링하고, 적절한 수가 형성된 후 풀로 통과시킵니다.
참고: iPSC 콜로니가 서로 접촉하지 않도록 해야 하는데, 이는 분화를 초래하고 장기적인 안정성에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. - 클론 라인을 확립하려면 iPSC 풀을 약 5번 통과시킨 다음 ESC와 유사한 형태를 유지하는 견고한 콜로니를 선택합니다.
- 완전히 재프로그래밍된 iPSC 콜로니를 식별하려면 TRA-160( 재료 표 참조)으로 라이브 염색을 수행하고 유전자 발현 특성 분석을 위해 iPSC 콜로니에서 RNA를 수확합니다.
9. iPSC 콜로니의 통과
- 7단계에서 설명한 대로 iPSC 콜로니를 통과시키기 전에 24시간 전에 충분한 iMEF 피더 플레이트를 준비합니다.
- 미리 예열된 리프로그래밍 미디어로 iMEF 피더 플레이트를 두 번 세척합니다.
- ROCK 억제제(Y2)(10μM)가 보충된 2mL의 재프로그래밍 배지를 iMEF 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
- 사용할 준비가 될 때까지 37 °C, 5 % CO2 및 3 % O2 인큐베이터에서 iMEF 플레이트를 배양합니다.
- PBS(0.5mM 최종 0.5mM)에 0.5M EDTA 1:1000을 희석하여 에틸렌디아민테트라아세트산/인산염 완충 식염수(EDTA/PBS) 용액을 준비합니다.
- 각 웰에서 재프로그래밍 배양 배지를 0.5mL의 EDTA/PBS로 교체합니다.
- 세포 유형에 따라 37 °C, 5% CO2 및 3% O2 인큐베이터 또는 실온에서 배양합니다. BxPc3 및 PDAC iPSC는 37°C에서 15분 배양이 필요합니다. H6C7 및 hFib iPSC는 실온에서 5분 동안 배양해야 합니다.
- iPSC 세포가 전체 콜로니의 피더 층에서 균일하게 해리되기 시작할 때까지 현미경으로 관찰합니다.
- 해리된 iPSC 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브에 수집합니다. 실온에서 300 x g 에서 5분 동안 아래로 회전합니다.
- Y2(10μM)가 보충된 1mL의 재프로그래밍 배지에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
- 각 1mL의 iPSC 세포 현탁액을 iMEF 플레이트의 3웰로 옮겨 iMEF 공급층의 세포를 플레이트합니다.
참고: 분할 비율은 수확된 iPSC 콜로니의 수에 따라 달라질 수 있습니다. - 37 °C, 5 % CO2 및 3 % O2 인큐베이터에서 배양합니다.
10. TRA-1-60을 이용한 iPSC 콜로니의 라이브 염색
- 재프로그래밍 배지에서 웰당 4μg/mL TRA-1-60 항체를 0.5mL씩 준비합니다.
- 재프로그래밍 배지를 폐기하고 각 웰에서 0.5mL 항체 혼합물로 교체합니다. 37 °C, 5 % CO2 및 3 % O2 인큐베이터에서 30 분 동안 배양합니다.
- 재프로그래밍 매체로 세포를 두 번 세척합니다.
- GFP 필터를 사용하여 세포 이미징 시스템으로 형광 이미지를 캡처합니다.
- 네거티브 제어 채널을 고려하여 이미지 품질을 확인하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PDAC, BXPc3, H6C7 및 hFib 세포에서 유래한 iPSC 콜로니의 형태를 보여주는 대표적인 이미지가 그림 1에 나와 있습니다. PDAC-iPSC 콜로니는 재프로그래밍의 25일째에 형성되기 시작했다. 보다 확립된 ESC 유사 형태를 가진 견고한 iPSC 콜로니는 재프로그래밍 40일째에 확인되었습니다(그림 1). 마찬가지로, BxPc3-iPSC의 형성은 23일째에 시작되어 35일째에 더 확립되었습니다. H6C7-iPSC 형성은 PDAC-iPSC와 유사했으며 45일째에 확립되기 시작했습니다. hFib-iPSC 콜로니는 재프로그래밍의 15일째에 형성되기 시작했습니다.
그림 1: iPSC 콜로니의 대표 이미지. 이미지는 (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 및 (D) hFib에서 파생된 확립된 hESC 유사 형태를 보여줍니다. 재프로그래밍 날짜는 각 이미지 위에 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
클론 iPSC 라인은 PDAC, BxPc3, H6C7 및 hFib 세포의 각 재프로그래밍으로부터 확립되었습니다. 확립된 모든 iPSC 라인은 미분화 hESC 세포 표면 마커인 TRA-1-60에 대해 양성으로 염색되어 다능성으로의 재프로그래밍을 확인했습니다(그림 2).
그림 2: 클론 iPSC 라인의 대표 이미지. 이미지는 (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 및 (D) hFib에서 파생되어 ESC 유사 형태(상단 패널) 및 TRA-1-60(하단 패널)에 대한 양성 염색을 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
암 진행을 연구하기 위한 iPSC 재프로그래밍의 사용을 용이하게 하기 위해 췌장암 세포를 재프로그래밍하기 위한 강력한 프로토콜이 확립되었습니다. 암세포를 다능성으로 재프로그래밍하는 것은 지금까지 매우 어려운 것으로 입증되었는데, 이는 암세포로부터 iPSC를 성공적으로 생성한 연구가 소수에 불과하기 때문이다 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. 이러한 연구의 대부분은 iPSC 세포주를 생성하기 위해 불멸화된 암 세포주를 사용했으며, 1차 환자 유래 세포주를 생성하지 않았다 36,37,38,40,42,43,44,46. 예를 들어, OSKM 인자의 레트로바이러스 도입을 사용하여 4개의 서로 다른 간암 세포주를 재프로그래밍하려고 시도했지만, 단 하나의 세포주만이 성공적으로 재프로그래밍되었다41. 그러나 생성된 간암 iPSC 라인은 몇 번의 통과 후 줄기 손실이 나타났으며, 이는 OSKM 재프로그래밍에 대한 암세포의 높은 내성을 강조합니다41. 이전에는 OSKM의 렌티바이러스 전달을 사용하여 PDAC 세포를 개별적으로 재프로그래밍하려는 시도가 있었습니다. 그러나, 외인성 OSKM 발현에 의존하는 단일 iPSC 라인만이 생성되었고, 따라서 완전히 재프로그래밍되지 않았다37. 또 다른 연구에서는 에피솜 벡터를 사용하여 게놈 통합 없이 OSKM 인자를 전달했지만 PDAC39에서 단일 iPSC 클론만 생성할 수 있었습니다. 암세포를 재프로그래밍하는 데 있어 제한적인 성공은 암 연구에서 iPSC 기술의 사용을 방해하는 많은 문제를 가중시킵니다.
여기에서는 두 명의 서로 다른 환자와 하나의 확립된 PDAC 세포주(BxPc3)에서 유래한 1차 PDAC 샘플에서 iPSC를 생성하는 방법을 설명합니다. 또한 iPSC는 췌관 상피 세포주인 H6c7에서도 생성되었습니다. 우리가 아는 한, 이것은 BxPc3 및 H6c7에서 성공적으로 도출된 안정적인 iPSC 라인에 대한 첫 번째 보고서입니다. 이 프로토콜에 따라 iPSC는 건강한 개인에서 유래한 1차 인간 섬유아세포에서도 성공적으로 생성되어 암 연구를 넘어 이 방법의 적용 가능성을 확장했습니다.
프로토콜의 성공의 핵심 요소 중 하나는 빅시스트로닉 렌티바이러스 벡터를 사용하여 OS 및 KM 인자를 함께 발현하는 것입니다. 이 벡터는 내부 리보솜 진입 부위 2(IRES2)를 포함하여 한 벡터에서 OCT4 및 SOX2를 발현하고 다른 벡터에서 KLF4 및 cMYC를 발현합니다. 각 재프로그래밍 인자를 개별적으로 전달한 monocistronic 벡터를 사용한 여러 연구에서 각 벡터의 흡수가 다르고 OSKM 화학량론과 재프로그래밍 효율에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다47. bicistronic 벡터를 사용하면 이 문제를 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 더욱이, 렌티바이러스 벡터에서 IRES를 사용하는 것은 재프로그래밍 효율의 현저한 증가를 보여주었다48. 이 렌티바이러스 시스템에서 OS 발현은 EF1a promoter에 의해 유도되는 반면, KM 발현은 CMV promoter에 의해 제어됩니다. CMV 프로모터는 EF1a49,50과 달리 DNA 메틸화 및 히스톤 탈아세틸화에 의해 매우 효율적인 침묵을 받을 수 있는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 리프로그래밍 중 OS 이전에 KM을 조기에 침묵시키는 것이 프로토콜의 성공에 중요한 요소가 될 수 있습니다. 이는 51,52,53,54,55를 다시 프로그래밍하는 동안 OSKM 발현 역학의 중요성을 보여주는 이전 연구와 일치합니다. 따라서, bicistronic 벡터는 또한 polycistronic 벡터보다 더 유리한데, 여기서 모든 OSKM 인자는 단일 프로모터(56)로부터 발현된다. 프로토콜의 성공에 기여하는 다른 요인으로는 렌티바이러스 감염의 선량과 각 세포 유형에 맞게 맞춤화된 재프로그래밍에 사용되는 감염된 세포의 수가 있습니다.
요약하면, 다른 세포주 및 정상 세포와 함께 일차 PDAC 세포를 재프로그래밍하기 위한 최적화된 방법이 제시됩니다. 이 방법은 암 진행을 모델링하고 이 경우 초기 PDAC 바이오마커를 발견하기 위해 iPSC 재프로그래밍의 사용을 확대하는 데 도움이 될 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
A.S와 J.K는 자금 지원을 해주신 Cancer Research UK와 OHSU에 감사의 뜻을 전합니다(CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S는 MRC 경력 개발 상(MR/N024028/1)의 지원을 받습니다. AA는 박사 장학금(장학금 참조 1078107040)으로 자금을 지원합니다. JK는 MRF New Investigator Grant(GCNCR1042A)와 Knight CEDAR Grant(68182-933-000, 68182-939-000)의 자금 지원을 받습니다. 재프로그래밍 벡터 pSIN4-EF1a-O2S 및 pSIN4-CMV-K2M을 제공해 주신 Keisuke Kaji 교수님께 감사드립니다. 오픈 액세스를 위해 저자는 이 제출물에서 발생하는 모든 저자 수락 원고 버전에 크리에이티브 커먼즈 저작자표시(CC BY) 라이선스를 적용했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 | |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 | |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 | |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 | |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 | |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 | |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 | |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML | |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B | |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP | |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V | |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 | |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | |
| pMDG | AddGene | 187440 | |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G | |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 | |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 | |
| psPAX2 | AddGene | 12260 | |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 | |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 | |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 | |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
References
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Hu, J. X., et al. Pancreatic cancer: A review of epidemiology, trend, and risk factors. World Journal of Gastroenterology. 27 (27), 4298 (2021).
- Howlader, N., et al. SEER cancer statistics review, 1975-2013. National Cancer Institute. 19, Bethesda, MD. (2016).
- Bengtsson, A., Andersson, R., Ansari, D. The actual 5-year survivors of pancreatic ductal adenocarcinoma based on real-world data. Scientific Reports. 10 (1), 16425 (2020).
- He, J., et al. 2564 resected periampullary adenocarcinomas at a single institution: trends over three decades. HPB. 16 (1), 83-90 (2014).
- Dusch, N., et al. Factors predicting long-term survival following pancreatic resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas: 40 years of experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 18 (4), 674-681 (2014).
- Principe, D. R., et al. The current treatment paradigm for pancreatic ductal adenocarcinoma and barriers to therapeutic efficacy. Frontiers in Oncology. 11, 688377 (2021).
- Papademetrio, D. L., et al. Interplay between autophagy and apoptosis in pancreatic tumors in response to gemcitabine. Targeted Oncology. 9 (2), 123-134 (2014).
- Ng, S. S., Tsao, M. S., Nicklee, T., Hedley, D. W. Effects of the epidermal growth factor receptor inhibitor OSI-774, Tarceva, on downstream signaling pathways and apoptosis in human pancreatic adenocarcinoma 1 supported by the National Cancer Institute of Canada and the Pat Myhal Fund for Pancreatic Cancer Research. Molecular Cancer Therapeutics. 1 (10), 777-783 (2002).
- Sultana, A., et al. Meta-analyses of chemotherapy for locally advanced and metastatic pancreatic cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (18), 2607-2615 (2007).
- Sun, J., Russell, C. C., Scarlett, C. J., McCluskey, A. Small molecule inhibitors in pancreatic cancer. RSC Medicinal Chemistry. 11 (2), 164-183 (2020).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Hruban, R. H., et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. The American Journal of Surgical Pathology. 25 (5), 579-586 (2001).
- Maitra, A., Hruban, R. H.
- Vincent, A., Herman, J., Schulick, R., Hruban, R. H., Goggins, M.
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Lennon, A. M., et al. The early detection of pancreatic cancer: what will it take to diagnose and treat curable pancreatic neoplasia. Cancer Research. 74 (13), 3381-3389 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Research. 67 (3), 1030-1037 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Suvà, M. L., et al. Reconstructing and reprogramming the tumor-propagating potential of glioblastoma stem-like cells. Cell. 157, 580-594 (2014).
- Kotini, A. G., et al. Stage-specific human induced pluripotent stem cells map the progression of myeloid transformation to transplantable leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Stricker, S. H., et al. Widespread resetting of DNA methylation in glioblastoma-initiating cells suppresses malignant cellular behavior in a lineage-dependent manner. Genes Development. 27 (6), 654-669 (2013).
- Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
- Aparicio, L. A., et al. Clinical implications of epithelial cell plasticity in cancer progression. Cancer letters. 366 (1), 1-10 (2015).
- Grimont, A., Leach, S. D., Chandwani, R. Uncertain beginnings: acinar and ductal cell plasticity in the development of pancreatic cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (2), 369-382 (2022).
- Greenspan, L. J., Weinstein, B. M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 24 (2), 251-269 (2021).
- Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
- Zhang, X., Cruz, F. D., Terry, M., Remotti, F., Matushansky, I. Terminal differentiation and loss of tumorigenicity of human cancers via pluripotency-based reprogramming. Oncogene. 32 (18), 2249-2260 (2013).
- Kim, J., et al. An iPSC line from human pancreatic ductal adenocarcinoma undergoes early to invasive stages of pancreatic cancer progression. Cell Reports. 3 (6), 2088-2099 (2013).
- Kim, J., et al. Detection of early pancreatic ductal adenocarcinoma with thrombospondin-2 and CA19-9 blood markers. Science Translational Medicine. 9 (398), (2017).
- Susac, L., et al. Structure of a fully assembled tumor-specific T cell receptor ligated by pMHC. Cell. 185 (17), 3201-3213 (2022).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Carette, J. E., et al. Generation of iPSCs from cultured human malignant cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 115 (20), 4039-4042 (2010).
- Choi, S. M., et al. Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 118 (7), 1801-1805 (2011).
- Hochedlinger, K., et al. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes & Development. 18 (15), 1875-1885 (2004).
- Hu, K., et al. Efficient generation of transgene-free induced pluripotent stem cells from normal and neoplastic bone marrow and cord blood mononuclear cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 117 (14), e109-e119 (2011).
- Iskender, B., Izgi, K., Canatan, H. Reprogramming bladder cancer cells for studying cancer initiation and progression. Tumor Biology. 37, 13237-13245 (2016).
- Khoshchehreh, R., et al. Epigenetic reprogramming of primary pancreatic cancer cells counteracts their in vivo tumourigenicity. Oncogene. 38 (34), 6226-6239 (2019).
- Kim, H. J., et al. Establishment of hepatocellular cancer induced pluripotent stem cells using a reprogramming technique. Gut and Liver. 11 (2), 261 (2017).
- Lin, S. L., et al. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA. 14 (10), 2115-2124 (2008).
- Miyoshi, N., et al. Defined factors induce reprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 40-45 (2010).
- Singovski, G., et al. In vivo epigenetic reprogramming of primary human colon cancer cells enhances metastases. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 157-173 (2016).
- Zhao, H., et al. A highly optimized protocol for reprogramming cancer cells to pluripotency using nonviral plasmid vectors. Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells". 17 (1), 7-18 (2015).
- Lo, C. A., et al. Quantification of protein levels in single living cells). Cell Reports. 13 (11), 2634-2644 (2015).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Prösch, S., et al. Inactivation of the very strong HCMV immediate early promoter by DNA CpG methylation in vitro. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 377 (3), 195-201 (1996).
- Mehta, A. K., Majumdar, S. S., Alam, P., Gulati, N., Brahmachari, V. Epigenetic regulation of cytomegalovirus major immediate-early promoter activity in transgenic mice. Gene. 428 (1-2), 20-24 (2009).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Chronis, C., et al. Cooperative binding of transcription factors orchestrates reprogramming. Cell. 168 (3), 442-459 (2017).
- Li, D., et al. Chromatin accessibility dynamics during iPSC reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (6), 819-833 (2017).
- Soufi, A., Donahue, G., Zaret, K. S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors' initial engagement with the genome. Cell. 151 (5), 994-1004 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
