Summary
Detta protokoll beskriver omprogrammeringen av pankreasduktalt adenokarcinom (PDAC) och normala bukspottkörtelbarkala epitelceller till inducerade pluripotenta stamceller (iPSC). Vi tillhandahåller en optimerad och detaljerad steg-för-steg-procedur, från att förbereda lentivirus till att etablera stabila iPSC-linjer.
Abstract
Generering av inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) med hjälp av transkriptionsfaktorer har uppnåtts från nästan vilken differentierad celltyp som helst och har visat sig vara mycket värdefull för forskning och kliniska tillämpningar. Intressant nog har iPSC-omprogrammering av cancerceller, såsom bukspottkörtelduktalt adenokarcinom (PDAC), visat sig återställa den invasiva PDAC-fenotypen och åsidosätta cancerepigenomet. Differentieringen av PDAC-härledda iPSCs kan rekapitulera PDAC-progression från dess tidiga pankreasintraepitelial neoplasi (PanIN)-prekursor, vilket avslöjar de molekylära och cellulära förändringar som uppstår tidigt under PDAC-progression. Därför kan PDAC-härledda iPSCs användas för att modellera de tidigaste stadierna av PDAC för upptäckt av diagnostiska markörer för tidig upptäckt. Detta är särskilt viktigt för PDAC-patienter, som vanligtvis diagnostiseras i de sena metastaserande stadierna på grund av brist på tillförlitliga biomarkörer för de tidigare PanIN-stadierna. Att omprogrammera cancercellinjer, inklusive PDAC, till pluripotens är dock fortfarande utmanande, arbetsintensivt och mycket varierande mellan olika linjer. Här beskriver vi ett mer konsekvent protokoll för att generera iPSCs från olika humana PDAC-cellinjer med hjälp av bicistroniska lentivirala vektorer. De resulterande iPSC-linjerna är stabila och visar inget beroende av det exogena uttrycket av omprogrammeringsfaktorer eller inducerbara läkemedel. Sammantaget underlättar detta protokoll genereringen av ett brett spektrum av PDAC-härledda iPSC:er, vilket är avgörande för att upptäcka tidiga biomarkörer som är mer specifika och representativa för PDAC-fall.
Introduction
Bukspottkörtelcancer (PDAC) är en av de mest dödliga maligniteterna, och tidig diagnos är fortfarande utmanande på grund av sjukdomens asymtomatiska natur. Majoriteten av PDAC-patienterna diagnostiseras i det avancerade metastaserande stadiet när mycket begränsade behandlingsalternativ finns tillgängliga 1,2. Detta beror främst på bristen på tillförlitliga biomarkörer för de tidigare stadierna, till exempel de som lätt kan detekteras som proteiner som släpps ut i blodomloppet.
PDAC kan spridas mycket tidigt under sin utveckling, och en bättre prognos har kopplats till tidig cancerupptäckt när PDAC är lokaliserat i bukspottkörteln3. Mindre än en tiondel av PDAC-patienterna diagnostiseras dock med en gynnsam prognos, vilket möjliggör kirurgisk resektion. Icke desto mindre är de få med resekterbara tumörer också benägna att få tumöråterfall inom 12 månader4.
Under de senaste fem decennierna har anmärkningsvärda förbättringar gjorts i kirurgiska tekniker, patientvård och behandlingsmetoder 5,6. 5-årsöverlevnaden hos kirurgiskt resekerade PDAC-patienter har dock knappt stigit till 17 %. Detta är dock fortfarande bättre än hos icke-resekerade patienter, som har förblivit nästan oförändrat (0,9 %)4,7. Kemoterapi är den enda andra alternativa PDAC-behandlingen. Detta alternativ är dock mycket begränsat eftersom den stora majoriteten av PDAC-patienter uppvisar stark resistens mot kemoterapiläkemedel som Gemcitabine 7,8. Andra läkemedel, såsom Erlotinib, är endast tillgängliga för en liten grupp PDAC-patienter med specifika mutationer, varav de flesta uppvisar Erlotinib-resistens9. De negativa biverkningarna i samband med kemoterapi hos de flesta PDAC-patienter är ytterligare en nackdel med denna behandling10. Nyligen har lovande strategier visat att immuncheckpointhämmare (ICI) och småmolekylära kinashämmare (SMKI) kan vara effektiva vid behandling av PDAC, men varaktiga svar på dessa riktade terapier är fortfarande begränsade till en minoritet av patienterna11,12. Sammantaget kan upptäckten av PDAC-specifika tidiga biomarkörer bana nya vägar för tidig diagnos och behandling.
PDAC utvecklas från pankreasintraepiteltumörer (PanIN) prekursorlesioner som är ett resultat av icke-invasiva epitelproliferationer i bukspottkörtelgångarna13,14. Bildandet av PanIN initieras av onkogenmutationer såsom KRAS, men ytterligare genetiska och epigenetiska förändringar krävs för progression till PDAC. Det har beräknats att utvecklingen av PanIN genom de olika stadierna till invasiv PDAC tar cirka 10 år 13,15,16,17. Denna tidsram ger en stor möjlighet att dra nytta av tidig PDAC-diagnos. Därför har omfattande forskning utförts för att etablera tumörxenograftdjurmodeller och organoidkulturer för att studera PDAC-progression 18,19,20,21. Dessa modeller har varit mycket användbara för att studera de invasiva stadierna av PDAC, men inte övergången från de tidiga PanIN-faserna. Det är därför viktigt att utveckla experimentella modeller som kan rekapitulera den tidiga utvecklingen av PanIN-stadier för att möjliggöra upptäckten av biomarkörer för tidig upptäckt.
Omprogrammering av somatiska celler till inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) med hjälp av de fyra transkriptionsfaktorerna OCT4, SOX2, KLF4 och c-MYC (OSKM) har illustrerat omfattningen av cellulär plasticitet22. Cancercellers plasticitet har varit väldokumenterad, och omprogrammering av mänskliga cancerceller till iPSCs har framgångsrikt använts för att återställa celler till deras ursprungliga cellulära tillstånd, vilket tar bort många av de epigenetiska förolämpningar som har ackumulerats under cancerprogression 23,24,25,26,27,28,29. Möjligheten att använda denna omprogrammeringsstrategi för att manipulera cancercellers identitet har därför varit mycket lovande vid behandling av cancer30,31. Vi har tidigare visat att differentieringen av iPSCs som härrör från PDACs kan rekapitulera PDAC-progression genom de tidiga PanIN-stadierna32. Genom att identifiera gener och signalvägar som är specifika för de tidiga till intermediära stadierna av PDAC identifierades kandidatbiomarkörer som kan användas kliniskt för tidig PDAC-diagnos 32,33. De biomarkörer som upptäcktes med hjälp av en enda iPSC-linje visade dock begränsad täckning hos majoriteten av PDAC-patienterna32. Utmaningarna med att generera iPSC-linjer från andra PDAC-patienter har stoppat möjligheten att upptäcka mer tillförlitliga biomarkörer. Detta beror på många tekniska faktorer, inklusive heterogeniteten i OSKM-leveransen, eftersom endast en liten del av humana primära PDAC-celler innehöll alla fyra faktorerna och svarade framgångsrikt på omprogrammering. Här presenteras ett detaljerat protokoll för omprogrammering av primära PDAC-celler med hjälp av en mer effektiv och konsekvent dubbel lentiviral leverans av OSKM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella protokoll godkändes av OHSU Institutional Review Board. Alla metoder utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter. Alla djurarbeten för PDX-tumörer utfördes med godkännande från OHSU Institutional Animal Use and Care Committee (IACUC). Detta protokoll testades i primära PDAC-celler från patient-derived xenograft (PDX), BxPc3-cellinje som uppvisade epitelmorfologi som isolerades från bukspottkörtelvävnaden hos en 61-årig kvinnlig patient med adenokarcinom, den H6C7-odödliga epitelcellinjen härledd från normal human pankreasgångepitel och primära humana fibroblaster härrörande från hudbiopsi av friska individer. Humana PDAC-prover erhölls under Oregon Pancreas Tissue Registry-studien (IRB00003609). Informerat samtycke erhölls från alla försökspersoner. Humana primära fibroblaster härleddes i RBiomedical, Edinburgh, Storbritannien, från hudprover från anonyma donatorer som genomgick rutinkirurgi vid Edinburgh Royal Infirmary, Little France, Storbritannien, under deras samtycke och etiska godkännande (09/MRE00/91). Allt arbete med lentivirus har utförts inom ramen för klass 2-forskning (GM207/16.6) och godkänts av hälso- och säkerhetsavdelningen vid University of Edinburgh och anmälts till den skotska regeringens HSE-behöriga myndighet. Alla omprogrammeringsexperiment med mänskliga bukspottkörtelceller utfördes under etiskt godkännande av School of Biological Sciences etiska kommitté vid University of Edinburgh (referens # asoufi-0002).
1. Beredning av lentivirus
- För lentivirusberedning, förbered högkvalitativa förpacknings- och expressionsplasmider (endotoxinfria) med koncentrationer mellan 1-2 μg/μL inklusive psPAX2, pMDG34 och två RES-innehållande bicistroniska vektorer; pSIN4-EF1a-O2S-kodningen för OCT4- och SOX2-uttryck som drivs av EF-1α-promotorn och pSIN4-CMV-K2M för KLF4- och c-MYC-uttryck under CMV-förstärkaren/promotorn35 (se materialtabell). Förbered också pWPT-GFP-plasmiden som ska användas som transfektionskontroll.
- Tina cellinjen för human embryonal njure (293T) och odling i Glasgows Minimum Essential Medium (GMEM), kompletterat med 10 % fetalt kalvserum (FCS), 1x icke-essentiella aminosyror, 1 mM natriumpyruvat och 1 mM glutamin vid (se materialförteckning) 37 °C och 5 % CO2 .
OBS: Det rekommenderas att använda 293T-celler inom fyra passager efter upptining. - Frö 293T med en densitet av 3 miljoner celler per 15 cm maträtt, 24 timmar före transfektion. Totalt krävs tre rätter. Det är att föredra att fröa celler senare på eftermiddagen ~ 16:00.
- Nästa dag (~16:00), när cellerna når ~40%-50% sammanflöde, förbered följande för tre transfektionsreaktioner:
OBS: Ta alltid hänsyn till pipetteringsfel genom att lägga till 10 % volym extra.- Märk tre 15 ml plaströr med lämpligt lentivirusnamn (pSIN4-EF1a-O2S, pSIN4-CMV-K2M och pwPT-GFP-kontroll). Tillsätt 1,710 ml reducerat serummedium (se materialförteckning) till varje tub.
- Späd 90 μL transfektionsreagens (se materialtabell) i 1,710 ml reducerat serummedium, blanda genom vertexing i 2 s och inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
- Blanda förpackningsvektorerna; 5,1 μg psPAX2 och 2,4 μg pMDG (7,5 μg totalt).
- Tillsätt förpackningsvektorblandningen till transfektionsmediet (från steg 1.4.2) och virvla i 2 s.
- Tillsätt 7,5 μg av varje omprogrammeringsvektor: pSIN4-EF1a-O2S och pSIN4-CMV-K2M och pwPT-GFP-kontrollen till transfektionsblandningen från steg (1.4.4) och virvel i 2 s.
OBS: Använd uttrycksvektorn: viral vektor i förhållandet 1:1.
- Inkubera transfektionsrören i 15 minuter i rumstemperatur.
- Transfektera 293T-cellerna med varje lentivirus genom att direkt tillsätta transfektions-DNA-blandningen från steg (1.4.5) till mediet på ett droppvis sätt. Snurra skålen för att säkerställa jämn fördelning över hela ytan.
- Inkubera de transfekterade cellerna i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator över natten.
OBS: Använd virusspecifikt avfall, en avfallshink av metall, dubbelpåse med autoklavpåsar och ta en behållare för flytande avfall för virus och tillsätt en desinfektionstablett. Kassera alla pipetter, spetsar och rör i en metallhink. Kassera gamla medier i en behållare för virus-vätskeavfall. Undvik att använda glaspipetter och glas för att eliminera oavsiktlig viruskontaminering. - Efter 14-16 timmar efter transfektionen, byt ut mediet mot 30 ml färskt 293T-medium.
- Inkubera de transfekterade cellerna vid 37 °C, 5 % CO2 i 60-72 timmar efter byte av medium. Observera cellerna dagligen och kontrollera transfektionseffektiviteten genom GFP-fluorescens.
OBS: Helst bör transfektionseffektiviteten vara >90 % av GFP. För de andra virusen bör man observera tydliga morfologiska förändringar av 293T-celler, eftersom de tenderar att bli mer runda när de producerar viruspartiklar. - Samla upp mediet från varje virustransfektionskultur i 50 ml rör och centrifugera ner för att rensa bort cellrester vid 1932 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Filtrera varje lentivirussupernatant genom ett 0,45 μM sprutfilter för att avlägsna mindre skräp och samla upp det i nya 50 ml rör.
- Dela varje lentivirussupernatant i 6 ml alikvoter och snabbfrys in var och en i flytande kväve.
- Förvara lentivirusalikvoter vid -80 °C tills de ska användas.
2. Omprogrammering av lentivirustransduktion
- Tina primära PDAC-celler och odling i fullständigt definierat Keratinocyte Serum Free Medium (KSFM), kompletterat med bovint hypofysextrakt (BPE), human rekombinant epidermal tillväxtfaktor (EGF) vid 5 ng/ml och koleratoxin vid 50 ng/ml i en inkubator för 37 °C, 5 % CO 2 och 5 % O2 (hypoxi) (se materialförteckning).
- Tina BxPc3, en cellinje av skivepitelcancer i bukspottkörteln och odling i RPMI 1640 medium kompletterat med 10 % fetalt kalvserum (FCS) vid 37 °C och 5 % CO2 .
- Tina H6C7-celler, bukspottkörtelns duktala epitelceller och odling i KSFM kompletterat med BPE och EGF vid 5 ng/ml, vid 37 °C och 5 % CO2 .
- Upptining av humana fibroblaster (hFib) och odling i Glasgows Minimum Essential Medium (GMEM), kompletterat med 10 % FCS, 1x icke-essentiella aminosyror, 1 mM natriumpyruvat och 1 mM glutamin och 0,05 mM (final) beta-merkaptoetanol vid 37 °C och 5 % CO2.
- En dag före lentivirustransduktion (helst sent på eftermiddagen) bereds två brunnar med en 6-hålsplatta innehållande 100 000 celler per brunn av vardera PDAC-, BxPc3-, H6C7- och hFib-celler. Infektera den ena brunnen med OSKM-lentivirus och använd den andra som en oinfekterad kontroll.
OBS: Använd en separat platta för varje celltyp. - Följande dag, på eftermiddagen (cirka 24 timmar senare), se till att cellsammanflödet når minst 70 % innan du går vidare till nästa lentivirusinfektionssteg.
3. Lentivirustransduktion av PDAC
- Tina upp 5 ml av varje lentivirussupernatant i en 37 °C virusinkubator.
- Förbered två 15 ml rör, som var och en innehåller 2 ml förvärmt PDAC-odlingsmedium.
- Tillsätt 6 ml av varje lentivirus som omprogrammeras (pSIN4-CMV-K2M och pSIN4-EF1a-O2S) och 12 μl 4,5 mg/ml polybren (slutlig 4,5 μg/ml, se materialtabell) till det första röret och blandas.
- Tillsätt 2 μl 4,5 mg/ml polybren till det andra röret (slutlig 4,5 μg/ml).
- Kassera mediet från varje brunn och tvätta en gång med PBS i rumstemperatur.
- Tillsätt omprogrammeringsinfektionsmediet (rör 1) i den första brunnen.
- Tillsätt blandningen av rör 2 i den andra brunnen. Detta kommer att vara den oinfekterade kontrollen.
- Inkubera PDAC-cellerna i en inkubator för 37 °C, 5 %CO 2 och 5 % O2 (hypoxi) över natten.
- Nästa dag, på eftermiddagen, kasserar du mediet från båda brunnarna och ersätter det med ett nytt PDAC-odlingsmedium.
- Inkubera cellerna vid 37 °C, 5 %CO 2 och 5 % O2 (hypoxi) i 48 timmar.
4. Lentivirustransduktion av BxPc3-celler
- Tina upp 3 ml av varje lentivirussupernatant i en 37 °C virusinkubator.
- Bered två 15 ml rör som var och en innehåller 2 ml BxPc3 odlingsmedium.
- Tillsätt 3 ml av varje lentivirus som omprogrammeras (pSIN4-CMV-K2M och pSIN4-EF1a-O2S) och 6 μl av 4,5 mg/ml polybren (slutlig 4,5 μg/ml) till det första röret och blandas.
- Tillsätt 2 μl 4,5 mg/ml polybren till det andra röret (slutlig 4,5 μg/ml).
- Kassera mediet från varje brunn och tvätta en gång med PBS.
- Tillsätt omprogrammeringsinfektionsmediet (rör 1) i den första brunnen.
- Tillsätt blandningen av rör 2 i den andra brunnen. Detta kommer att vara den oinfekterade kontrollen.
- Inkubera de infekterade BxPc3-cellerna vid 37 °C-virus och 5 % CO2 över natten.
- Nästa dag, på eftermiddagen, kassera mediet från båda brunnarna och ersätt det med färskt BxPc3-odlingsmedium.
- Inkubera cellerna vid 37 °C och 5 % CO2 i 48 timmar.
5. Infektion med lentivirustransduktion av H6c7-celler
- Tina upp 4 ml av varje lentivirussupernatant i en 37 °C virusinkubator.
- Bered två 15 ml rör, som var och en innehåller 2 ml H6c7 odlingsmedium.
- Tillsätt 4 ml av varje lentivirus som omprogrammeras (pSIN4-CMV-K2M och pSIN4-EF1a-O2S) och 8 μl 4,5 mg/ml polybren (slutlig 4,5 μg/ml) till det första röret och blandas.
- Tillsätt 2 μl 4,5 mg/ml polybren till det andra röret (slutlig 4,5 μg/ml).
- Kassera mediet från båda brunnarna och tvätta en gång med PBS.
- Tillsätt omprogrammeringsinfektionsmediet (rör 1) i den första brunnen.
- Tillsätt blandningen av rör 2 i den andra brunnen. Detta kommer att vara den oinfekterade kontrollen.
- Inkubera de infekterade H6C7-cellerna vid 37 °C-virus och 5 % CO2 över natten.
- Nästa dag, på eftermiddagen, kassera medierna från båda brunnarna och ersätt dem med ett nytt H6c7-odlingsmedium.
- Inkubera cellerna vid 37 °C och 5 % CO2 i 48 timmar.
6. Lentivirustransduktion av hFib-celler
- Tina upp 2 ml av varje lentivirussupernatant i en 37 °C virusinkubator.
- Förbered två 15 ml rör, som var och en innehåller 2 ml hFib odlingsmedium.
- Tillsätt 2 ml av varje omprogrammerande virus (pSIN4-CMV-K2M och pSIN4-EF1a-O2S) till det första röret och tillsätt 4 μl 4,5 mg/ml polybren (slutlig 4,5 μg/ml) och blanda.
- Tillsätt 2 μl 4,5 mg/ml polybren (slutlig 4,5 μg/ml) till det andra röret och blanda.
- Kassera mediet från varje brunn och tvätta en gång med PBS.
- Tillsätt omprogrammeringsinfektionsmediet (rör 1) i den första brunnen.
- Tillsätt blandningen av rör 2 i den andra brunnen. Detta kommer att vara den oinfekterade kontrollen.
- Inkubera de infekterade hFib-cellerna vid 37 °C och 5 % CO2 över natten.
- Nästa dag, på eftermiddagen, kasserar du mediet från båda brunnarna och ersätter det med ett nytt hFib-odlingsmedium.
- Inkubera cellerna vid 37 °C och 5 % CO2 i ytterligare 48 timmar.
OBS: För effektiv lentivirustransduktion bör mängden lentivirus titeras noggrant, eftersom detta varierar mycket mellan de olika celltyperna. Multipla lentivirustransduktioner kan krävas för vissa celltyper. PDAC-cellinjer kräver upp till tre doser, medan en dos räckte för att omprogrammera BxPc3-, H6C7- och hFib-linjer.
7. Beredning av iMEF-matarceller
- Bered 40 ml 0,2 % gelatinlösning genom att späda 1 % gelatinstamlösning med PBS.
- Täck fyra 6-hålsplattor genom att täcka varje brunn med 2 ml 0,2 % gelatinlösning.
- Inkubera de gelatinbelagda plattorna vid 37 °C och 5 % CO2 i minst 30 minuter.
- Sug upp överflödig gelatinlösning och låt plattorna torka under flödeshuven.
- Tina två injektionsflaskor (~ 4 miljoner celler per injektionsflaska) med bestrålade musembryonala fibroblaster (iMEF) genom att virvla dem i ett 37 °C vattenbad.
OBS: För att minska risken för kontaminering, var noga med att förhindra att vatten stänker nära lockets öppning. Torka injektionsflaskan med en pappershandduk och spraya den med 70 % etanol. - I vävnadsodlingshuven, pipettera innehållet i varje tinad iMEFs-injektionsflaska i ett 15 ml rör som innehåller 10 ml förvärmt hFib-odlingsmedium på ett droppvis sätt och blanda väl genom att försiktigt vända röret upp och ner.
- Centrifugera cellsuspensionen med 309 x g i 3 minuter vid rumstemperatur och ta bort supernatanten från varje rör. Återsuspendera varje cellpellet i 12 ml hFib-medium.
- Platta 2 ml av cellsuspensionen per brunn av de gelatinbelagda 6-hålsplattorna. Fördela cellerna jämnt genom att försiktigt skaka plattorna i alla riktningar.
- Inkubera plattorna vid 37 °C och 5 % CO2 över natten.
OBS: Förbered färska iMEF-plattor 24 timmar innan de används för omprogrammeringsexperimentet.
8. Överföring av de infekterade cellerna till iMEF-matarskiktet
- Kassera media från infekterade och icke-infekterade PDAC-, BxPc3-, H6c7- och hFib-celler. Tvätta varje väl två gånger med PBS i rumstemperatur.
- Skilj cellerna från plattan genom att tillsätta 0,5 ml trypsin till varje brunn. Inkubera PDAC-celler i en inkubator för 37 °C, 5 %CO 2 och 5 % O2 (hypoxi) i 15 minuter.
- Inkubera BxPc3-celler vid 37 °C och 5 % CO2 i 5 min.
- Inkubera H6c7- och hFib-celler vid 37 °C och 5 % CO2 i 4 min.
- Överför den dissocierade cellsuspensionen från varje brunn till 15 ml rör märkta som infekterade eller oinfekterade.
- Skörda cellerna genom centrifugering enligt följande: För PDAC, centrifugera cellsuspensionen vid 300 x g i 5 minuter. För BxPc3, centrifugera cellsuspensionen med 120 × g i 5 minuter. För H6C7, centrifugera cellsuspensionen med 112 x g i 4 minuter. För hFib, centrifugera cellsuspensionen med 161 x g i 3 minuter. Utför alla centrifugeringar vid rumstemperatur.
- Återsuspendera varje celltyp pellet i 1 ml av lämpligt odlingssubstrat.
- Tvätta iMEF-plattorna som förberetts i steg 7 med odlingsmediet för varje celltyp två gånger. d.v.s. tvätta en tallrik med PDAC-media, en med BxPc3-media, en med H6C7-medium och den andra med hFib-medium.
- Platta 50 000 infekterade celler per brunn i fem brunnar med iMEF 6-brunnars platta. Platta 50 000 oinfekterade kontrollceller i den återstående brunnen av iMEF 6-brunnsplattan.
OBS: Optimera antalet infekterade celler som ska pläteras från 1 000 till 50 000 celler per brunn. - Inkubera PDAC-celler vid 37 °C, 5 % CO2 och 5 % O2 (hypoxi) över natten.
- Inkubera BxPc3-, H6C7- och hFib-celler vid 37 °C och 5 % CO2 över natten.
- Nästa dag, förbered omprogrammeringsmediet enligt följande: tillsätt 100 ml knockout-serumersättning (25 % final), 5 ml 200 mM glutamin (1 mM final), 5 ml 100x icke-essentiella aminosyror (100 μM final), 1,5 ml beta-merkaptoetanol (0,1 mM final) till 400 ml Modified Eagle Medium (DMEM).
- Förvara omprogrammeringsmediet i alikvoter på 100 ml vid 4 °C i upp till 4 veckor eller vid -20 °C längre.
- När du är klar att använda, tillsätt 100 μl 10 mg/ml basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) (10 ng/ml final) till en 100 ml alikvot för omprogrammeringsmedia.
- Värm omprogrammeringsmediet i ett 37 °C vattenbad.
- Tvätta cellerna som växer på iMEFs-matare med förvärmda omprogrammeringsmedier två gånger.
Tillsätt 2 ml omprogrammeringsmedium till varje brunn. - Överför omprogrammeringsplattorna till en inkubator för 37 °C, 5 %CO 2 och3 % O2 (hypoxi).
OBS: Dagen då omprogrammeringsmedia läggs till anses vara dag 1 av omprogrammeringen. - Mata cellerna dagligen med nya omprogrammeringsmedier tills iPSC-kolonier börjar dyka upp.
OBS: Identifiera iPSC-kolonier genom deras ESC-liknande morfologi (kompakta kolonier med väldefinierade kanter och bestående av celler med ett högt kärn-/cytoplasmaförhållande). - Övervaka iPSC-kolonierna dagligen, och efter att ett tillräckligt antal har bildats, passera dem som en pool.
OBS: Se till att iPSC-kolonierna inte vidrör varandra, eftersom detta skulle resultera i differentiering och påverka deras långsiktiga stabilitet. - För att etablera klonala linjer, passera iPSC-poolen cirka 5 gånger och välj sedan robusta kolonier som bibehåller sin ESC-liknande morfologi.
- För att identifiera helt omprogrammerade iPSC-kolonier, utför levande färgning med TRA-160 (se Materialtabell) och skörda RNA från iPSC-kolonier för karakterisering av genuttryck.
9. Passaging av iPSC-kolonier
- Förbered tillräckligt med iMEF-matarplattor 24 timmar innan du passerar iPSC-kolonierna enligt beskrivningen i steg 7.
- Tvätta iMEF-matarplattorna två gånger med förvärmda omprogrammeringsmedier.
- Tillsätt 2 ml omprogrammeringsmedium kompletterat med ROCK-hämmare (Y2) (10 μM) till varje brunn på iMEF-plattan.
- Inkubera iMEF-plattorna i en inkubator för 37 °C, 5 %CO 2 och 3 % O2 tills den ska användas.
- Bered etylendiamintetraättiksyra/fosfatbuffrad saltlösning (EDTA/PBS) lösning genom att späda 0,5 M EDTA 1:1000 i PBS (0,5 mM final).
- Ersätt omprogrammeringsodlingsmediet med 0.5 ml EDTA/PBS i varje brunn.
- Inkubera i en inkubator för 37 °C, 5 %CO 2 och 3 % O2 eller i rumstemperatur, beroende på celltyp. BxPc3 och PDAC iPSCs kräver 15 minuters inkubation vid 37 °C. H6C7 och hFib iPSCs måste inkuberas i rumstemperatur i 5 minuter.
- Kontrollera iPSCs-cellerna under mikroskopet tills de börjar dissociera jämnt från matarskiktet genom hela kolonin.
- Samla upp den dissocierade iPSC-cellsuspensionen i ett 15 ml centrifugrör. Centrifugera med 300 x g i 5 minuter i rumstemperatur.
- Återsuspendera cellpelleten i 1 ml omprogrammeringsmedium kompletterat med Y2 (10 μM).
- Platta cellerna på iMEF-matarskiktet genom att överföra varje 1 ml iPSC-cellsuspension till tre brunnar på iMEF-plattan.
OBS: Delningsförhållandet kan variera beroende på antalet skördade iPSC-kolonier. - Inkubera i en inkubator med 37 °C, 5 %CO och 3 % O2 .
10. Levande färgning av iPSC-kolonier med TRA-1-60
- Bered 0,5 ml 4 μg/ml TRA-1-60-antikropp per brunn i omprogrammeringsmedia.
- Kassera omprogrammeringsmedia och ersätt det med 0.5 ml antikroppsblandning i varje brunn. Inkubera i en inkubator för 37 °C, 5 %CO 2 och 3 % O2 i 30 min.
- Tvätta cellerna två gånger med omprogrammeringsmediet.
- Ta fluorescensbilder med ett cellavbildningssystem med hjälp av GFP-filtret.
- Kontrollera bildkvaliteten genom att ta hänsyn till den negativa kontrollkanalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa bilder som visar morfologin hos iPSC-kolonier härledda från PDAC-, BXPc3-, H6C7- och hFib-celler visas i figur 1. PDAC-iPSC-kolonier började bildas på dag 25 av omprogrammeringen. Robusta iPSC-kolonier med en mer etablerad ESC-liknande morfologi identifierades på dag 40 av omprogrammeringen (Figur 1). På samma sätt började bildandet av BxPc3-iPSCs på dag 23 och blev mer etablerat på dag 35. H6C7-iPSC-formationen liknade PDAC-iPSCs och började etableras på dag 45. hFib-iPSC-kolonier började bildas på dag 15 av omprogrammeringen.
Figur 1: Representativa bilder av iPSC-kolonier. Bilderna visar etablerad hESC-liknande morfologi härledd från (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 och (D) hFib. Dagarna för omprogrammering anges ovanför varje bild. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Klonala iPSC-linjer etablerades från varje omprogrammering av PDAC-, BxPc3-, H6C7- och hFib-celler. Alla etablerade iPSC-linjer färgades positiva för TRA-1-60, en odifferentierad hESC-cellytemarkör, vilket bekräftar deras omprogrammering till pluripotens (figur 2).
Figur 2: Representativa bilder av klonala iPSC-linjer. Bilderna är härledda från (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 och (D) hFib som visar ESC-liknande morfologi (övre paneler) och positiv färgning för TRA-1-60 (nedre panel). Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att underlätta användningen av iPSC-omprogrammering för att studera cancerprogression har ett robust protokoll etablerats för omprogrammering av bukspottkörtelcancerceller. Att omprogrammera cancerceller till pluripotens har hittills visat sig vara mycket utmanande, eftersom endast ett fåtal studier framgångsrikt har genererat iPSCs från cancerceller 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. De flesta av dessa studier använde odödliga cancercellinjer för att generera iPSC-linjer, inte primära patienthärledda celler 36,37,38,40,42,43,44,46. Till exempel försökte man omprogrammera fyra olika levercancercellinjer med hjälp av retroviral introduktion av OSKM-faktorer, men endast en enda cellinje omprogrammerades framgångsrikt41. Den genererade iPSC-linjen för levercancer visade dock en förlust av stamhet efter några passager, vilket belyser cancercellernas höga resistens mot OSKM-omprogrammering41. Tidigare har försök gjorts att omprogrammera PDAC-celler med hjälp av lentiviral leverans av OSKM individuellt; dock genererades endast en enda iPSC-linje, beroende på exogent OSKM-uttryck och därför inte helt omprogrammerad37. En annan studie använde episomala vektorer för att leverera OSKM-faktorer utan genomisk integration, men lyckades bara generera en enda iPSC-klon från PDAC39. De begränsade framgångarna med att omprogrammera cancerceller bidrar till de många utmaningar som hämmar användningen av iPSC-teknik inom cancerforskning.
Här förklaras genereringen av iPSCs från primära PDAC-prover som härrör från två olika patienter och en etablerad PDAC-cellinje (BxPc3). Dessutom har iPSCs också genererats från H6c7, en bukspottkörtel-duktal epitelcellinje. Såvitt vi vet är detta den första rapporten om framgångsrikt härledda stabila iPSC-linjer från BxPc3 och H6c7. I enlighet med detta protokoll har iPSCs också framgångsrikt genererats från primära humana fibroblaster som härrör från friska individer, vilket utökar metodens användbarhet bortom cancerforskning.
En av de viktigaste faktorerna bakom framgången med protokollet är användningen av bicistroniska lentivirala vektorer för att samuttrycka OS- och KM-faktorer. Dessa vektorer innehåller det interna ribosomingångsstället 2 (IRES2) för att uttrycka OCT4 och SOX2 i den ena vektorn och KLF4 och cMYC i den andra. Flera studier med monocistroniska vektorer där varje omprogrammeringsfaktor levererades individuellt har visat att upptaget av varje vektor är olika, vilket påverkar OSKM-stökiometri och omprogrammeringseffektivitet47. Att använda bicistronic-vektorer kan hjälpa till att mildra detta problem. Dessutom har användningen av IRES i lentivirala vektorer visat en signifikant ökning av omprogrammeringseffektiviteten48. I det här lentivirussystemet drivs OS-uttrycket av EF1a-promotorn, medan KM-uttrycket kontrolleras av en CMV-promotor. Det är känt att CMV-promotorn kan utsättas för mycket effektiv avstängning genom DNA-metylering och histondeacetylering, till skillnad från EF1a49,50. Därför kan den tidiga nedtystningen av KM före OS under omprogrammering vara en nyckelfaktor för protokollets framgång. Detta stämmer överens med tidigare studier som visar vikten av OSKM-uttrycksdynamik under omprogrammering 51,52,53,54,55. Således är den bicistroniska vektorn också mer fördelaktig än den polycistroniska vektorn, där alla OSKM-faktorer uttrycks från en enda promotor56. Andra faktorer som bidrar till protokollets framgång är doserna av lentivirusinfektion och antalet infekterade celler som används för omprogrammering, som anpassades för varje celltyp.
Sammanfattningsvis presenteras en optimerad metod för omprogrammering av primära PDAC-celler tillsammans med andra cellinjer och normala celler. Denna metod kommer att bidra till att utöka användningen av iPSC-omprogrammering för att modellera cancerprogression och, i detta fall, upptäcka tidiga PDAC-biomarkörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar att det inte föreligger någon intressekonflikt.
Acknowledgments
A.S och J.K vill tacka Cancer Research UK och OHSU för finansieringen (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S stöds av ett MRC-karriärutvecklingspris (MR/N024028/1). AA finansieras av ett Ph.D. stipendium (Scholarship ref. 1078107040) från King Abdulaziz City for Science and Technology. J.K finansieras av MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) och Knight CEDAR grant (68182-933-000, 68182-939-000). Vi tackar Prof Keisuke Kaji för att ha tillhandahållit omprogrammeringsvektorn pSIN4-EF1a-O2S och pSIN4-CMV-K2M. För open access-ändamål har författaren tillämpat en Creative Commons Attribution (CC BY)-licens för alla Author Accepted Manuscript-versioner som härrör från denna inlämning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 | |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 | |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 | |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 | |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 | |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 | |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 | |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML | |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B | |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP | |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V | |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 | |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | |
| pMDG | AddGene | 187440 | |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G | |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 | |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 | |
| psPAX2 | AddGene | 12260 | |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 | |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 | |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 | |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
References
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Hu, J. X., et al. Pancreatic cancer: A review of epidemiology, trend, and risk factors. World Journal of Gastroenterology. 27 (27), 4298 (2021).
- Howlader, N., et al. SEER cancer statistics review, 1975-2013. National Cancer Institute. 19, Bethesda, MD. (2016).
- Bengtsson, A., Andersson, R., Ansari, D. The actual 5-year survivors of pancreatic ductal adenocarcinoma based on real-world data. Scientific Reports. 10 (1), 16425 (2020).
- He, J., et al. 2564 resected periampullary adenocarcinomas at a single institution: trends over three decades. HPB. 16 (1), 83-90 (2014).
- Dusch, N., et al. Factors predicting long-term survival following pancreatic resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas: 40 years of experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 18 (4), 674-681 (2014).
- Principe, D. R., et al. The current treatment paradigm for pancreatic ductal adenocarcinoma and barriers to therapeutic efficacy. Frontiers in Oncology. 11, 688377 (2021).
- Papademetrio, D. L., et al. Interplay between autophagy and apoptosis in pancreatic tumors in response to gemcitabine. Targeted Oncology. 9 (2), 123-134 (2014).
- Ng, S. S., Tsao, M. S., Nicklee, T., Hedley, D. W. Effects of the epidermal growth factor receptor inhibitor OSI-774, Tarceva, on downstream signaling pathways and apoptosis in human pancreatic adenocarcinoma 1 supported by the National Cancer Institute of Canada and the Pat Myhal Fund for Pancreatic Cancer Research. Molecular Cancer Therapeutics. 1 (10), 777-783 (2002).
- Sultana, A., et al. Meta-analyses of chemotherapy for locally advanced and metastatic pancreatic cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (18), 2607-2615 (2007).
- Sun, J., Russell, C. C., Scarlett, C. J., McCluskey, A. Small molecule inhibitors in pancreatic cancer. RSC Medicinal Chemistry. 11 (2), 164-183 (2020).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Hruban, R. H., et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. The American Journal of Surgical Pathology. 25 (5), 579-586 (2001).
- Maitra, A., Hruban, R. H.
- Vincent, A., Herman, J., Schulick, R., Hruban, R. H., Goggins, M.
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Lennon, A. M., et al. The early detection of pancreatic cancer: what will it take to diagnose and treat curable pancreatic neoplasia. Cancer Research. 74 (13), 3381-3389 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Research. 67 (3), 1030-1037 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Suvà, M. L., et al. Reconstructing and reprogramming the tumor-propagating potential of glioblastoma stem-like cells. Cell. 157, 580-594 (2014).
- Kotini, A. G., et al. Stage-specific human induced pluripotent stem cells map the progression of myeloid transformation to transplantable leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Stricker, S. H., et al. Widespread resetting of DNA methylation in glioblastoma-initiating cells suppresses malignant cellular behavior in a lineage-dependent manner. Genes Development. 27 (6), 654-669 (2013).
- Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
- Aparicio, L. A., et al. Clinical implications of epithelial cell plasticity in cancer progression. Cancer letters. 366 (1), 1-10 (2015).
- Grimont, A., Leach, S. D., Chandwani, R. Uncertain beginnings: acinar and ductal cell plasticity in the development of pancreatic cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (2), 369-382 (2022).
- Greenspan, L. J., Weinstein, B. M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 24 (2), 251-269 (2021).
- Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
- Zhang, X., Cruz, F. D., Terry, M., Remotti, F., Matushansky, I. Terminal differentiation and loss of tumorigenicity of human cancers via pluripotency-based reprogramming. Oncogene. 32 (18), 2249-2260 (2013).
- Kim, J., et al. An iPSC line from human pancreatic ductal adenocarcinoma undergoes early to invasive stages of pancreatic cancer progression. Cell Reports. 3 (6), 2088-2099 (2013).
- Kim, J., et al. Detection of early pancreatic ductal adenocarcinoma with thrombospondin-2 and CA19-9 blood markers. Science Translational Medicine. 9 (398), (2017).
- Susac, L., et al. Structure of a fully assembled tumor-specific T cell receptor ligated by pMHC. Cell. 185 (17), 3201-3213 (2022).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Carette, J. E., et al. Generation of iPSCs from cultured human malignant cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 115 (20), 4039-4042 (2010).
- Choi, S. M., et al. Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 118 (7), 1801-1805 (2011).
- Hochedlinger, K., et al. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes & Development. 18 (15), 1875-1885 (2004).
- Hu, K., et al. Efficient generation of transgene-free induced pluripotent stem cells from normal and neoplastic bone marrow and cord blood mononuclear cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 117 (14), e109-e119 (2011).
- Iskender, B., Izgi, K., Canatan, H. Reprogramming bladder cancer cells for studying cancer initiation and progression. Tumor Biology. 37, 13237-13245 (2016).
- Khoshchehreh, R., et al. Epigenetic reprogramming of primary pancreatic cancer cells counteracts their in vivo tumourigenicity. Oncogene. 38 (34), 6226-6239 (2019).
- Kim, H. J., et al. Establishment of hepatocellular cancer induced pluripotent stem cells using a reprogramming technique. Gut and Liver. 11 (2), 261 (2017).
- Lin, S. L., et al. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA. 14 (10), 2115-2124 (2008).
- Miyoshi, N., et al. Defined factors induce reprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 40-45 (2010).
- Singovski, G., et al. In vivo epigenetic reprogramming of primary human colon cancer cells enhances metastases. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 157-173 (2016).
- Zhao, H., et al. A highly optimized protocol for reprogramming cancer cells to pluripotency using nonviral plasmid vectors. Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells". 17 (1), 7-18 (2015).
- Lo, C. A., et al. Quantification of protein levels in single living cells). Cell Reports. 13 (11), 2634-2644 (2015).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Prösch, S., et al. Inactivation of the very strong HCMV immediate early promoter by DNA CpG methylation in vitro. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 377 (3), 195-201 (1996).
- Mehta, A. K., Majumdar, S. S., Alam, P., Gulati, N., Brahmachari, V. Epigenetic regulation of cytomegalovirus major immediate-early promoter activity in transgenic mice. Gene. 428 (1-2), 20-24 (2009).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Chronis, C., et al. Cooperative binding of transcription factors orchestrates reprogramming. Cell. 168 (3), 442-459 (2017).
- Li, D., et al. Chromatin accessibility dynamics during iPSC reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (6), 819-833 (2017).
- Soufi, A., Donahue, G., Zaret, K. S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors' initial engagement with the genome. Cell. 151 (5), 994-1004 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
