Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

תכנות מחדש של אדנוקרצינומה של צינור הלבלב לפלוריפוטנציה

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/65811
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 4,5, 4,6, 3,6, 1
1Centre for Regenerative Medicine, Institute of Regeneration and Repair, Institute of Stem Cell Research, The University of Edinburgh, 2King Abdulaziz City for Science and Technology Health Sector (KACST), 3Cancer Early Detection Advanced Research Center, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, 4Brenden-Colson Canter for Pancreatic Care, Oregon Health & Science University, 5Department of Surgery, Oregon Health & Science University, 6Department of Molecular & Medical Genetics, Oregon Health & Science University

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר תכנות מחדש של אדנוקרצינומה צינורית לבלב (PDAC) ותאי אפיתל צינור לבלב נורמליים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). אנו מספקים הליך אופטימלי ומפורט, שלב אחר שלב, החל מהכנת lentivirus ועד הקמת קווי iPSC יציבים.

Abstract

יצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות גורמי שעתוק הושגה כמעט מכל סוג תא ממוין והוכחה כבעלת ערך רב למחקר וליישומים קליניים. באופן מעניין, הוכח כי תכנות מחדש של תאי סרטן iPSC, כגון אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC), מחזיר לאחור את הפנוטיפ הפולשני של PDAC וגובר על אפיגנום הסרטן. ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם ב-PDAC יכולה לשחזר את התקדמות PDAC מהמבשר המוקדם של הניאופלזיה התוך-אפיתליאלית של הלבלב (PanIN), ולחשוף את השינויים המולקולריים והתאיים המתרחשים בשלב מוקדם במהלך התקדמות PDAC. לכן, ניתן להשתמש בתאי גזע מושרים שמקורם ב-PDAC כדי למדל את השלבים המוקדמים ביותר של PDAC לגילוי סמני אבחון לגילוי מוקדם. זה חשוב במיוחד עבור חולי PDAC, אשר מאובחנים בדרך כלל בשלבים גרורתיים מאוחרים בשל מחסור בסמנים ביולוגיים אמינים עבור שלבי PanIN מוקדמים יותר. עם זאת, תכנות מחדש של קווי תאים סרטניים, כולל PDAC, לפלוריפוטנציה נותר מאתגר, דורש עבודה רבה ומשתנה מאוד בין קווים שונים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול עקבי יותר ליצירת תאי iPSC מקווי תאי PDAC אנושיים שונים באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים דו-גלגליים. קווי iPSC המתקבלים יציבים, ואינם מראים תלות בביטוי אקסוגני של גורמי תכנות מחדש או תרופות אינדוקטיביות. בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר יצירה של מגוון רחב של iPSCs שמקורם ב-PDAC, שהוא חיוני לגילוי סמנים ביולוגיים מוקדמים שהם ספציפיים יותר ומייצגים מקרי PDAC.

Introduction

אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) היא אחת הממאירויות הקטלניות ביותר, ואבחון מוקדם נותר מאתגר בשל האופי האסימפטומטי של המחלה. רוב חולי PDAC מאובחנים בשלב גרורתי מתקדם כאשר אפשרויות הטיפול מוגבלות מאוד זמינות 1,2. זה בעיקר בשל היעדר סמנים ביולוגיים אמינים עבור השלבים המוקדמים יותר, כגון אלה שניתן לזהות בנוחות כמו חלבונים שוחררו לתוך זרם הדם.

PDAC יכול להתפשט מוקדם מאוד במהלך התקדמותו, ופרוגנוזה טובה יותר נקשרה לגילוי מוקדם של סרטן כאשר PDAC ממוקם בלבלב3. עם זאת, פחות מעשירית מחולי PDAC מאובחנים עם פרוגנוזה חיובית, המאפשרת כריתה כירורגית. עם זאת, מעטים עם גידולים נתיחים נוטים גם להישנות הגידול תוך 12 חודשים4.

בחמשת העשורים האחרונים, שיפורים מדהימים נעשו בטכניקות כירורגיות, טיפול בחולים ושיטות טיפול 5,6. עם זאת, שיעור ההישרדות ל-5 שנים בחולי PDAC שעברו ניתוח עלה בקושי ל-17%. עם זאת, זה עדיין טוב יותר מזה של חולים שלא נותחו, אשר נשאר כמעט ללא שינוי (0.9%)4,7. כימותרפיה היא הטיפול האלטרנטיבי היחיד ב-PDAC. עם זאת, אפשרות זו מוגבלת מאוד מכיוון שהרוב הגדול של חולי PDAC מפגינים עמידות חזקה לתרופות כימותרפיות כגון Gemcitabine 7,8. תרופות אחרות, כגון ארלוטיניב, זמינות רק לקבוצה קטנה של חולי PDAC עם מוטציות ספציפיות, שרובן מראות עמידות לארלוטיניב9. תופעות הלוואי השליליות הקשורות לכימותרפיה ברוב חולי PDAC הן חסרון נוסף של טיפול זה10. לאחרונה, אסטרטגיות מבטיחות הראו כי מעכבי נקודות בקרה חיסוניות (ICIs) ומעכבי מולקולות קינאז קטנות (SMKIs) יכולים להיות יעילים בטיפול ב- PDAC, אך תגובות עמידות לטיפולים ממוקדים אלה נותרו מוגבלות למיעוט החולים11,12. בסך הכל, גילוי סמנים ביולוגיים מוקדמים ספציפיים ל-PDAC יכול לסלול דרכים חדשות לאבחון וטיפול מוקדם.

PDAC מתפתח מנגעים מקדימים תוך-אפיתליאליים של הלבלב (PanIN) הנובעים מהתפשטות אפיתל לא פולשנית של צינור הלבלב13,14. בעוד היווצרות PanIN היא יזומה על ידי מוטציות אונקוגנים כגון KRAS, שינויים גנטיים ואפיגנטיים נוספים נדרשים עבור התקדמות PDAC. על פי התחזיות, ההתקדמות של PanIN דרך השלבים השונים לתוך PDAC פולשני לוקח בערך10 שנים 13,15,16,17. מסגרת זמן זו מספקת הזדמנות מצוינת להפיק תועלת מאבחון מוקדם של PDAC. לכן, מחקר מקיף בוצע כדי לבסס מודלים של בעלי חיים ותרביות אורגנואידים כדי לחקור את התקדמות PDAC 18,19,20,21. מודלים אלה היו שימושיים מאוד לחקר השלבים הפולשניים של PDAC, אם כי לא המעבר משלבי PanIN המוקדמים. לכן, חשוב לפתח מודלים ניסיוניים שיוכלו לשחזר את ההתקדמות המוקדמת של שלבי PanIN כדי לאפשר גילוי של סמנים ביולוגיים לגילוי מוקדם.

תכנות מחדש של תאים סומטיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות ארבעת גורמי השעתוק OCT4, SOX2, KLF4 ו-c-MYC (OSKM) המחיש את מידת הפלסטיות התאית22. פלסטיות תאי סרטן תועדה היטב, ותכנות מחדש של תאי סרטן אנושיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שימש בהצלחה כדי לאפס תאים למצבם התאי המקורי, תוך הסרת רבים מהעלבונות האפיגנטיים שהצטברו במהלך התקדמות הסרטן 23,24,25,26,27,28,29. האפשרות להשתמש באסטרטגיית תכנות מחדש זו כדי להשפיע על זהות התא הסרטני היו, אם כן, הבטחה גדולה בטיפול בסרטן30,31. ואכן, הראינו בעבר כי ההבחנה בין iPSCs הנגזרים מ- PDACs יכולה לשחזר את התקדמות PDAC דרך שלבי PanIN המוקדמים32. על ידי זיהוי גנים ומסלולים ספציפיים לשלבים המוקדמים עד בינוניים של PDAC, זוהו סמנים ביולוגיים מועמדים שניתן להשתמש בהם קלינית לאבחון מוקדם של PDAC32,33. עם זאת, הסמנים הביולוגיים שהתגלו באמצעות קו iPSC יחיד הראו כיסוי מוגבל ברוב חולי PDAC32. האתגרים של יצירת קווי iPSC מחולי PDAC אחרים עצרו את היכולת לגלות סמנים ביולוגיים אמינים יותר. זה נובע מגורמים טכניים רבים, כולל ההטרוגניות של העברת OSKM, מכיוון שרק חלק קטן מתאי PDAC ראשוניים אנושיים הכילו את כל ארבעת הגורמים והגיבו בהצלחה לתכנות מחדש. כאן, פרוטוקול מפורט מוצג לתכנות מחדש של תאי PDAC ראשוניים באמצעות העברה לנטיויראלית כפולה יעילה ועקבית יותר של OSKM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים הניסיוניים אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של OHSU. כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. כל העבודות בבעלי חיים עבור גידולי PDX בוצעו באישור הוועדה המוסדית לשימוש וטיפול בבעלי חיים של OHSU (IACUC). פרוטוקול זה נבדק בתאי PDAC ראשוניים מקסנוגרפט שמקורו במטופל (PDX), קו תאי BxPc3 המציג מורפולוגיה אפיתל שבודד מרקמת הלבלב של מטופלת בת 61 עם אדנוקרצינומה, קו תאי אפיתל אימורטלי H6C7 שמקורו באפיתל צינור לבלב אנושי רגיל, ופיברובלסטים אנושיים ראשוניים שמקורם בביופסיית עור של אנשים בריאים. דגימות PDAC אנושיות התקבלו במסגרת מחקר רישום רקמות הלבלב של אורגון (IRB00003609). התקבלה הסכמה מדעת מכל הנבדקים. פיברובלסטים ראשוניים אנושיים הופקו ב- RBiomedical, אדינבורו, בריטניה, מדגימות עור מתורמים אנונימיים שעברו ניתוח שגרתי במרפאה המלכותית אדינבורו, צרפת הקטנה, בריטניה, בהסכמתם ובאישורם האתי (09/MRE00/91). כל עבודת הלנטיוירוס בוצעה תחת פעילות מחקר Class 2 (GM207/16.6) ואושרה על ידי מחלקת הבריאות והבטיחות באוניברסיטת אדינבורו והודיעה לרשות המוסמכת HSE של הממשלה הסקוטית. כל ניסויי התכנות מחדש באמצעות תאי לבלב אנושיים בוצעו תחת אישור אתי של ועדת האתיקה של בית הספר למדעי הביולוגיה באוניברסיטת אדינבורו (סימוכין # asoufi-0002).

1. הכנת lentiviruses

  1. להכנת לנטיוירוס, הכינו פלסמידים איכותיים לאריזה ולהבעה (נטולי אנדוטוקסין) בריכוזים שבין 1-2 מיקרוגרם/מיקרוליטר כולל psPAX2, pMDG34 ושני וקטורים ביסיסטרוניים המכילים RES; קידוד pSIN4-EF1a-O2S עבור ביטוי OCT4 ו-SOX2 המונע על ידי מקדם EF-1α, ו-pSIN4-CMV-K2M עבור ביטוי KLF4 ו-c-MYC תחת משפר/מקדם CMV35 (ראה טבלת חומרים). כמו כן, הכינו פלסמיד pWPT-GFP שישמש כבקרת טרנספקציה.
  2. הפשירו קו תאי כליות עובריים אנושיים (293T) ותרבית במדיום החיוני המינימלי של גלזגו (GMEM), בתוספת 10% סרום עגל עובר (FCS), 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 1 mM נתרן פירובט ו 1 mM גלוטמין ב (ראה טבלה של חומרים) 37 ° C ו 5% CO2.
    הערה: מומלץ להשתמש בתאי 293T בארבעה מעברים לאחר ההפשרה.
  3. זרע 293T בצפיפות של 3 מיליון תאים לכל צלחת 15 ס"מ, 24 שעות לפני ההדבקה. בסך הכל נדרשות שלוש מנות. עדיף לזרוע תאים מאוחר יותר אחר הצהריים ~ 16: 00.
  4. למחרת (~16:00), כאשר התאים מגיעים למפגש ~40%-50%, הכינו את הפעולות הבאות לשלוש תגובות טרנספקציה:
    הערה: קח בחשבון תמיד את שגיאת הצנרת על-ידי הוספת נפח נוסף של 10%.
    1. יש לסמן שלוש שפופרות פלסטיק בנפח 15 מ"ל עם השם המתאים לנטי-וירוס (pSIN4-EF1a-O2S, pSIN4-CMV-K2M ובקרת pwPT-GFP). יש להוסיף מדיום סרום מופחת בנפח 1.710 מ"ל (ראו טבלת חומרים) לכל צינור.
    2. לדלל 90 μL מגיב transfection (ראה טבלה של חומרים) בתווך סרום מופחת 1.710 מ"ל, לערבב על ידי vertexing במשך 2 שניות, ולדגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    3. מערבבים את וקטורי האריזה; 5.1 מיקרוגרם של psPAX2 ו-2.4 מיקרוגרם של pMDG (7.5 מיקרוגרם בסך הכל).
    4. הוסף את תערובת וקטור האריזה למדיום הטרנספקציה (משלב 1.4.2) ומערבולת למשך 2 שניות.
    5. הוסף 7.5 מיקרוגרם של כל וקטור תכנות מחדש: pSIN4-EF1a-O2S ו- pSIN4-CMV-K2M ואת בקרת pwPT-GFP לתערובת הטרנספקציה משלב (1.4.4) ומערבולת למשך 2 שניות.
      הערה: השתמש בביטוי וקטור: וקטור ויראלי ביחס של 1:1.
  5. לדגור על צינורות transfection במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. בצע טרנספציה של תאי 293T עם כל לנטיוירוס על ידי הוספה ישירה של תערובת הטרנספקציה-דנ"א משלב (1.4.5) למדיה בצורה טיפתית. מערבלים את התבנית כדי להבטיח פיזור אחיד על פני כל המשטח.
  7. לדגור את התאים הנגועים ב 37 ° C, 5% CO2 אינקובטור לילה.
    הערה: השתמש בפסולת ספציפית לווירוס, דלי לסילוק מתכות, שקית כפולה עם שקיות אוטוקלאב, וקח מיכל פסולת נוזלית לווירוס והוסף טבלית חיטוי. יש להשליך את כל הפיפטות, הקצוות והצינורות לדלי מתכת. יש להשליך מדיה ישנה למיכל פסולת נוזלי של וירוסים. הימנע משימוש פיפטות זכוכית וכלי זכוכית כדי למנוע זיהום וירוס בשוגג.
  8. לאחר 14-16 שעות לאחר הטרנספקציה, להחליף את המדיום עם 30 מ"ל טרי 293T בינוני.
  9. לדגור על התאים הנגועים ב 37 ° C, 5% CO2 עבור 60-72 שעות לאחר שינוי בינוני. התבוננו בתאים מדי יום ובדקו את יעילות הטרנספקציה על ידי פלואורסצנטיות GFP.
    הערה: באופן אידיאלי, יעילות ההעברה צריכה להיות >90% על ידי GFP. עבור הנגיפים האחרים, יש להבחין בשינויים מורפולוגיים ברורים של תאי 293T, שכן הם נוטים להיות עגולים יותר בעת ייצור חלקיקי וירוס.
  10. אסוף את המדיה מכל תרבית העברת וירוסים לצינורות של 50 מ"ל וסובב מטה כדי לפנות פסולת תאים ב 1932 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  11. סנן כל סופרנאטנט lentivirus דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר כדי להסיר פסולת קטנה יותר ולאסוף אותו לתוך צינורות חדשים של 50 מ"ל.
  12. מחלקים כל סופרנאטנט לנטיוירוס ל-6 מ"ל אליציטוטים ומקפיאים כל אחד בחנקן נוזלי.
  13. לאחסן את aliquots lentivirus ב -80 °C עד מוכן לשימוש.

2. תכנות מחדש של התמרה lentivirus

  1. הפשירו תאי PDAC ראשוניים ותרבית באינקובטור ללא מדיום ללא קרטינוציטים מוגדרים לחלוטין (KSFM), בתוספת תמצית יותרת המוח של בקר (BPE), גורם גדילה אפידרמלי רקומביננטי אנושי (EGF) ב-5 ננוגרם/מ"ל, ורעלן כולרה ב-50 נ"ג/מ"ל באינקובטור של 37°C, 5%CO2 ו-5% O2 (היפוקסיה) (ראו טבלת חומרים).
  2. הפשרה BxPc3, קו תאי אדנוקרצינומה של צינור לבלב קשקשי, ותרבית במדיום RPMI 1640 בתוספת 10% נסיוב עגל עוברי (FCS) ב 37 ° C, ו 5% CO2.
  3. הפשרת תאי H6C7, תאי אפיתל צינור לבלב ותרבית ב-KSFM בתוספת BPE ו-EGF ב-5 ננוגרם/מ"ל, ב-37°C וב-5% CO2.
  4. הפשרת פיברובלסט אנושי (hFib) ותרבית במדיום החיוני המינימלי (GMEM) של גלזגו, בתוספת 10% FCS, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 1 mM נתרן פירובט ו 1 mM גלוטמין, ו 0.05 mM (סופי) בטא-מרקפטואתנול ב 37 ° C ו 5% CO2.
  5. יום אחד לפני התמרת הלנטיוירוס (רצוי בשעות אחר הצהריים המאוחרות), הכינו שתי בארות של צלחת בת 6 בארות המכילה 100,000 תאים לכל באר מכל אחד מתאי PDAC, BxPc3, H6C7 ו-hFib. להדביק אחד היטב עם lentiviruses OSKM ולהשתמש השני כמו שליטה נגועה.
    הערה: השתמש בלוח נפרד עבור כל סוג תא.
  6. למחרת, בשעות אחר הצהריים (כ-24 שעות מאוחר יותר), יש לוודא שמפגש התאים מגיע לפחות ל-70% לפני שממשיכים לשלב הבא של זיהום הלנטיוירוס.

3. התמרה Lentivirus של PDAC

  1. הפשיר 5 מ"ל מכל סופרנאטנט lentivirus באינקובטור וירוסים של 37 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו שני צינורות של 15 מ"ל, שכל אחד מהם מכיל 2 מ"ל של מדיום תרבית PDAC שחומם מראש.
  3. לצינור הראשון, הוסף 6 מ"ל של כל לנטיוירוס לתכנות מחדש (pSIN4-CMV-K2M ו- pSIN4-EF1a-O2S) ו- 12 μL של פוליברן 4.5 מ"ג / מ"ל (סופי 4.5 מיקרוגרם / מ"ל, ראה טבלת חומרים) וערבב.
  4. לצינור השני, הוסף 2 μL של 4.5 מ"ג / מ"ל פוליברן (סופי 4.5 מיקרוגרם / מ"ל).
  5. יש להשליך את המדיום מכל באר ולשטוף פעם אחת עם PBS בטמפרטורת החדר.
  6. הוסף את מדיית ההדבקה המתכנתת מחדש (צינור 1) לבאר הראשונה.
  7. מוסיפים את תערובת הצינור 2 לבאר השנייה. זו תהיה הבקרה הלא נגועה.
  8. לדגור על תאי PDAC באינקובטור של 37°C, 5%CO2 ו-5% O2 (היפוקסיה) למשך הלילה.
  9. למחרת, בשעות אחר הצהריים, השליכו את המדיה משתי הבארות והחליפו אותה במדיום תרבית PDAC טרי.
  10. לדגור על התאים ב 37 ° C, 5% CO2, ו 5% O2 (היפוקסיה) במשך 48 שעות.

4. התמרה Lentivirus של תאי BxPc3

  1. הפשיר 3 מ"ל של כל סופרנאטנט lentivirus באינקובטור וירוסים של 37 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו שני צינורות 15 מ"ל, שכל אחד מהם מכיל 2 מ"ל של מדיום תרבית BxPc3.
  3. לצינור הראשון, הוסף 3 מ"ל של כל לנטיוירוס תכנות מחדש (pSIN4-CMV-K2M ו- pSIN4-EF1a-O2S) ו- 6 μL של פוליברן 4.5 מ"ג / מ"ל (סופי 4.5 מיקרוגרם / מ"ל) וערבב.
  4. לצינור השני, הוסף 2 μL של 4.5 מ"ג / מ"ל פוליברן (סופי 4.5 מיקרוגרם / מ"ל).
  5. יש להשליך את המדיום מכל באר ולשטוף פעם אחת עם PBS.
  6. הוסף את מדיית ההדבקה המתכנתת מחדש (צינור 1) לבאר הראשונה.
  7. מוסיפים את תערובת הצינור 2 לבאר השנייה. זו תהיה הבקרה הלא נגועה.
  8. לדגור על תאי BxPc3 נגועים ב 37 ° C וירוס ו 5% CO2 בן לילה.
  9. למחרת, בשעות אחר הצהריים, השליכו את המדיה משתי הבארות והחליפו אותה במדיום תרבית BxPc3 טרי.
  10. לדגור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 48 שעות.

5. התמרה Lentivirus של זיהום תאי H6c7

  1. הפשיר 4 מ"ל מכל סופרנאטנט לנטיוירוס באינקובטור וירוסים של 37 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו שני צינורות 15 מ"ל, שכל אחד מהם מכיל 2 מ"ל H6c7 תרבית בינונית.
  3. לצינור הראשון, הוסף 4 מ"ל של כל לנטיוירוס תכנות מחדש (pSIN4-CMV-K2M ו- pSIN4-EF1a-O2S) ו- 8 μL של פוליברן 4.5 מ"ג / מ"ל (סופי 4.5 מיקרוגרם / מ"ל) וערבב.
  4. לצינור השני, הוסף 2 μL של 4.5 מ"ג / מ"ל פוליברן (סופי 4.5 מיקרוגרם / מ"ל).
  5. יש להשליך את המדיום משתי הבארות ולשטוף פעם אחת עם PBS.
  6. הוסף את מדיית ההדבקה המתכנתת מחדש (צינור 1) לבאר הראשונה.
  7. מוסיפים את תערובת הצינור 2 לבאר השנייה. זו תהיה הבקרה הלא נגועה.
  8. לדגור על תאי H6C7 נגועים ב 37 ° C וירוס ו 5% CO2 בן לילה.
  9. למחרת, בשעות אחר הצהריים, השליכו את אמצעי התקשורת משתי הבארות והחליפו אותם במדיום תרבית H6c7 טרי.
  10. לדגור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 48 שעות.

6. התמרה Lentivirus של תאי hFib

  1. הפשיר 2 מ"ל של כל סופרנאטנט lentivirus באינקובטור וירוסים של 37 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו שני צינורות 15 מ"ל, שכל אחד מהם מכיל 2 מ"ל hFib תרבית בינונית.
  3. לצינור הראשון, הוסף 2 מ"ל של כל וירוסים המתכנתים מחדש (pSIN4-CMV-K2M ו- pSIN4-EF1a-O2S) והוסף 4 μL של פוליברן 4.5 מ"ג / מ"ל (סופי 4.5 מיקרוגרם / מ"ל) וערבב.
  4. לצינור השני, להוסיף 2 μL של 4.5 מ"ג / מ"ל פוליברן (סופי 4.5 מיקרוגרם / מ"ל) ולערבב.
  5. יש להשליך את המדיום מכל באר ולשטוף פעם אחת עם PBS.
  6. הוסף את מדיית ההדבקה המתכנתת מחדש (צינור 1) לבאר הראשונה.
  7. מוסיפים את תערובת הצינור 2 לבאר השנייה. זו תהיה הבקרה הלא נגועה.
  8. לדגור על תאי hFib נגועים ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך הלילה.
  9. למחרת, אחר הצהריים, השליכו את המדיה משתי הבארות והחליפו אותה במדיום תרבית hFib טרי.
  10. לדגור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 48 שעות נוספות.
    הערה: להעברת לנטיוירוס יעילה, יש להפחית את כמות הלנטיוירוס בזהירות, מכיוון שזה משתנה מאוד בין סוגי התאים השונים. ייתכן שיידרשו התמרה של לנטי-וירוס מרובים עבור סוגי תאים מסוימים. קווי תאי PDAC דורשים עד שלוש מנות, בעוד שמנה אחת הספיקה לתכנות מחדש של קווי BxPc3, H6C7 ו-hFib.

7. הכנת תאי הזנה iMEF

  1. הכן 40 מ"ל תמיסת ג'לטין 0.2% על ידי דילול תמיסת מלאי ג'לטין 1% עם PBS.
  2. מצפים ארבע צלחות 6 באר על ידי כיסוי כל באר עם 2 מ"ל של 0.2% תמיסת ג'לטין.
  3. יש לדגור על הצלחות מצופות הג'לטין בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 30 דקות לפחות.
  4. שאפו את תמיסת הג'לטין העודפת והשאירו את הצלחות להתייבש מתחת למכסה המנוע.
  5. הפשיר שני בקבוקונים (~ 4 מיליון תאים לבקבוקון) של פיברובלסט עוברי עכבר מוקרן (iMEFs) על ידי ערבול אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: כדי לצמצם את האפשרות לזיהום, יש להקפיד למנוע התזת מים ליד פתח המכסה. יבשו את הבקבוקון במגבת נייר ורססו אותו באתנול 70%.
  6. במכסה המנוע של תרבית הרקמה, פיפטה את התוכן של כל בקבוקון iMEFs מופשר לתוך צינור אחד 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מדיום תרבית hFib שחומם מראש בצורה טיפתית ומערבבים היטב על ידי היפוך עדין של הצינור.
  7. סובבו את מתלה התא במהירות של 309 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר והוציאו את הסופרנאטנט מכל צינור. להשהות כל כדור תא ב 12 מ"ל hFib בינוני.
  8. צלחת 2 מ"ל של תרחיף התא לכל באר של צלחות 6 באר מצופה ג'לטין. פזרו את התאים באופן שווה על ידי ניעור עדין של הצלחות לכל הכיוונים.
  9. לדגור על הצלחות ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך הלילה.
    הערה: הכינו צלחות iMEF טריות 24 שעות לפני השימוש בהן לניסוי התכנות מחדש.

8. העברת התאים הנגועים לשכבת מזין iMEF

  1. יש להשליך מדיה מתאי PDAC, BxPc3, H6c7 ו-hFib נגועים ולא נגועים. שטפו היטב כל אחד מהם פעמיים עם PBS בטמפרטורת החדר.
  2. לנתק את התאים מהצלחת על ידי הוספת 0.5 מ"ל של טריפסין לכל באר. לדגור על תאי PDAC באינקובטור של 37°C, 5% CO2 ו-5% O2 (היפוקסיה) למשך 15 דקות.
  3. יש לדגור על תאי BxPc3 בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 למשך 5 דקות.
  4. יש לדגור על תאי H6c7 ו-hFib בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 4 דקות.
  5. העבירו את תרחיף התאים המנותק מכל באר לצינורות של 15 מ"ל המסומנים בהתאם כנגועים או לא נגועים.
  6. קצור את התאים על ידי צנטריפוגה כדלקמן: עבור PDAC, סובב את תרחיף התא ב 300 x גרם במשך 5 דקות; עבור BxPc3, סובב את מתלה התא ב 120 x גרם במשך 5 דקות; עבור H6C7, סובב את מתלה התא ב 112 x גרם במשך 4 דקות; עבור hFib, סובב את מתלה התא ב 161 x גרם במשך 3 דקות. בצעו את כל הצנטריפוגות בטמפרטורת החדר.
  7. השהה מחדש כל גלולה מסוג תא ב 1 מ"ל של מדיה תרבית מתאימה.
  8. שטפו צלחות iMEF שהוכנו בשלב 7 עם כל מדיה של תרבית מסוג תא פעמיים. כלומר, לשטוף צלחת אחת עם מדיה PDAC, אחד עם מדיה BxPc3, אחד עם בינוני H6C7, והשני עם בינוני hFib.
  9. צלחת 50,000 תאים נגועים לכל באר בחמש בארות של צלחת iMEF 6-well. צלחת 50,000 תאי בקרה לא נגועים בבאר הנותרת של צלחת iMEF 6-well.
    הערה: מטב את מספר התאים הנגועים כך שיהיו מצופים מ- 1,000 ל- 50,000 תאים לכל באר.
  10. לדגור על תאי PDAC בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 ו-5% O2 (היפוקסיה) למשך הלילה.
  11. יש לדגור על תאי BxPc3, H6C7 ו-hFib בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך הלילה.
  12. למחרת, הכינו מדיום תכנות מחדש באופן הבא: הוסיפו 100 מ"ל תחליף סרום נוקאאוט (25% סופי), 5 מ"ל של 200 מ"ל גלוטמין (1 מ"מ סופי), 5 מ"ל של 100x חומצות אמינו לא חיוניות (100 מיקרומטר סופי), 1.5 מ"ל בטא-מרקפטואתנול (0.1 מ"ל סופי) ל-400 מ"ל מדיום נשר שונה (DMEM).
  13. אחסן את מדיית התכנות מחדש ב- Aliquots של 100 מ"ל ב- 4 ° C למשך עד 4 שבועות או ב- -20 ° C למשך זמן רב יותר.
  14. כאשר מוכן לשימוש, הוסף 100 μL של 10 מ"ג / מ"ל גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF) (10 ng / mL סופי) אחד 100 מ"ל תכנות מחדש מדיה aliquot.
  15. חממו את מדיית התכנות מחדש באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  16. שטפו פעמיים את התאים הגדלים על מזיני iMEFs באמצעות מדיה לתכנות מחדש שחוממה מראש.
    הוסף 2 מ"ל של מדיום תכנות מחדש לכל באר.
  17. העבר את לוחות התכנות מחדש לתוך 37 ° C, 5% CO2ו 3% O2 (היפוקסיה) אינקובטור.
    הערה: היום שבו מתווספת מדיה לתכנות מחדש נחשב ליום הראשון של תכנות מחדש.
  18. הזינו את התאים מדי יום במדיה חדשה של תכנות מחדש עד שמושבות iPSC מתחילות להופיע.
    הערה: זהה מושבות iPSC לפי המורפולוגיה דמוית ESC שלהן (מושבות קומפקטיות עם קצוות מוגדרים היטב המורכבות מתאים עם יחס גרעין/ציטופלסמה גבוה).
  19. עקוב אחר מושבות iPSC מדי יום, ולאחר שנוצר מספר מספיק, להעביר אותם כבריכה.
    הערה: ודא שמושבות iPSC אינן נוגעות זו בזו, מכיוון שהדבר יגרום לבידול וישפיע על יציבותן לטווח הארוך.
  20. כדי ליצור קווי שיבוט, עברו את מאגר iPSC כ-5 פעמים, ואז בחרו מושבות חזקות ששומרות על המורפולוגיה דמוית ה-ESC שלהן.
  21. כדי לזהות מושבות iPSC שתוכנתו מחדש באופן מלא, בצעו צביעה חיה עם TRA-160 (ראו טבלת חומרים), וקצרו RNA ממושבות iPSC לצורך אפיון ביטוי גנים.

9. מעבר מושבות iPSC

  1. הכינו מספיק צלחות הזנה iMEF 24 שעות לפני שתעברו את מושבות iPSC כמתואר בשלב 7.
  2. שטפו את צלחות הזנת iMEF פעמיים במדיית תכנות מחדש שחוממה מראש.
  3. הוסף 2 מ"ל של מדיה לתכנות מחדש בתוספת מעכב ROCK (Y2) (10 מיקרומטר) לכל באר של צלחת iMEF.
  4. יש לדגור על לוחות iMEF באינקובטור של 37°C, 5% CO2 ו-3% O2 עד שיהיו מוכנים לשימוש.
  5. הכן תמיסת חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית / פוספט מלח חוצץ (EDTA/PBS) על ידי דילול 0.5 M EDTA 1:1000 ב- PBS (0.5 mM סופי).
  6. החלף את מדיית תרבות התכנות מחדש ב- 0.5 מ"ל של EDTA/PBS בכל באר.
  7. יש לדגור באינקובטור של 37°C, 5% CO2 ו-3% O2 או בטמפרטורת החדר, בהתאם לסוג התא. BxPc3 ו-PDAC iPSCs דורשים דגירה של 15 דקות ב-37°C. H6C7 ו-hFib iPSCs צריכים להיות מודגרים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  8. בדוק את תאי iPSCs תחת המיקרוסקופ עד שהם מתחילים להתנתק באופן אחיד משכבת ההזנה בכל המושבה.
  9. אסוף את מתלה תאי iPSC מנותק לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. יש לסחוט כלפי מטה במהירות של 300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. השהה מחדש את גלולת התא ב -1 מ"ל של מדיה לתכנות מחדש בתוספת Y2 (10 מיקרומטר).
  11. לוחית את התאים על שכבת מזין iMEF על ידי העברת כל 1 מ"ל של תרחיף תאי iPSC לשלוש בארות של צלחת iMEF.
    הערה: יחס הפיצול עשוי להשתנות בהתאם למספר מושבות iPSC שנקטפו.
  12. דגירה באינקובטור של 37°C, 5% CO2 ו-3% O2 .

10. צביעה חיה של מושבות iPSC עם TRA-1-60

  1. הכן 0.5 מ"ל לכל באר של 4 מיקרוגרם / מ"ל נוגדן TRA-1-60 במדיה תכנות מחדש.
  2. השליכו את מדיית התכנות מחדש והחליפו אותה בתערובת נוגדנים של 0.5 מ"ל בכל באר. יש לדגור באינקובטור של 37°C, 5% CO2 ו-3% O2 למשך 30 דקות.
  3. שטפו את התאים פעמיים עם מדיית התכנות מחדש.
  4. צלם תמונות פלואורסצנטיות באמצעות מערכת דימות תאי באמצעות מסנן GFP.
  5. בדוק את איכות התמונה על ידי התחשבות בערוץ הבקרה השלילי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תמונות מייצגות המציגות את המורפולוגיה של מושבות iPSC שמקורן בתאי PDAC, BXPc3, H6C7 ו-hFib מוצגות באיור 1. מושבות PDAC-iPSC החלו להיווצר ביום ה-25 של התכנות מחדש. מושבות iPSC חזקות עם מורפולוגיה מבוססת יותר דמוית ESC זוהו ביום 40 של תכנות מחדש (איור 1). באופן דומה, היווצרות BxPc3-iPSCs החלה ביום ה-23 והתבססה יותר ביום ה-35. היווצרות H6C7-iPSC הייתה דומה ל-PDAC-iPSCs והחלה להתבסס ביום ה-45. מושבות hFib-iPSC החלו להיווצר ביום ה-15 של תכנות מחדש.

Figure 1
איור 1: תמונות מייצגות של מושבות iPSC. התמונות מראות מורפולוגיה מבוססת דמוית hESC הנגזרת מ-(A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 ו-(D) hFib. ימי התכנות מחדש מצוינים מעל כל תמונה. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 

קווי iPSC משובטים הוקמו מכל תכנות מחדש של תאי PDAC, BxPc3, H6C7 ו-hFib. כל קווי iPSC שנקבעו הוכתמו כחיוביים עבור TRA-1-60, סמן פני השטח של תאי hESC בלתי ממוינים, המאשר את התכנות מחדש שלהם לפלוריפוטנציה (איור 2).

Figure 2
איור 2: תמונות מייצגות של קווי iPSC שבטים. התמונות נגזרות מ- (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 ו- (D) hFib המציגות מורפולוגיה דמוית ESC (לוחות עליונים) וצביעה חיובית עבור TRA-1-60 (לוח תחתון). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי להקל על השימוש בתכנות מחדש של iPSC לחקר התקדמות הסרטן, נקבע פרוטוקול חזק לתכנות מחדש של תאי סרטן הלבלב. תכנות מחדש של תאים סרטניים לפלוריפוטנציה הוכח כמאתגר מאוד עד כה, שכן רק מחקרים מעטים יצרו בהצלחה iPSCs מתאי סרטן 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. רוב המחקרים הללו השתמשו בקווי תאים סרטניים אימורטליים כדי ליצור קווי iPSC, ולא בתאים ראשוניים שמקורם בחולה 36,37,38,40,42,43,44,46. לדוגמה, נעשה ניסיון לתכנת מחדש ארבעה קווי תאים שונים של סרטן הכבד באמצעות החדרה רטרו-ויראלית של גורמי OSKM, אך רק קו תאים אחד תוכנת מחדש בהצלחה41. עם זאת, קו iPSC שנוצר סרטן הכבד הראה אובדן גזע לאחר כמה מעברים, מדגיש את העמידות הגבוהה של תאים סרטניים לתכנות מחדש OSKM41. בעבר, נעשו ניסיונות לתכנת מחדש תאי PDAC באמצעות העברה לנטיויראלית של OSKM בנפרד; עם זאת, נוצר רק קו iPSC יחיד, תלוי בביטוי OSKM אקסוגני ולכן לא תוכנת מחדש באופן מלא37. מחקר אחר השתמש בווקטורים אפיזומליים כדי לספק גורמי OSKM ללא אינטגרציה גנומית, אך הצליח ליצור רק שיבוט iPSC יחיד מ- PDAC39. ההצלחה המוגבלת בתכנות מחדש של תאים סרטניים מוסיפה לאתגרים הרבים המעכבים את השימוש בטכנולוגיית iPSC בחקר הסרטן.

כאן, מוסבר הדור של iPSCs מדגימות PDAC ראשוניות שמקורן בשני חולים שונים וקו תאי PDAC מבוסס אחד (BxPc3). יתר על כן, iPSCs נוצרו גם מ H6c7, קו תאי אפיתל צינור הלבלב. למיטב ידיעתנו, זהו הדיווח הראשון של קווי iPSC יציבים שהופקו בהצלחה מ-BxPc3 ו-H6c7. בעקבות פרוטוקול זה, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים נוצרו בהצלחה גם מפיברובלסטים אנושיים ראשוניים שמקורם באנשים בריאים, ובכך הרחיבו את תחולת השיטה מעבר לחקר הסרטן.

אחד ממרכיבי המפתח מאחורי הצלחת הפרוטוקול הוא השימוש בווקטורים לנטי-ויראליים ביסיסטרוניים לביטוי משותף של גורמי מערכת ההפעלה וה-KM. וקטורים אלה מכילים את אתר הזנת הריבוזום הפנימי 2 (IRES2) כדי לבטא OCT4 ו-SOX2 בווקטור אחד ואת KLF4 ו-cMYC בווקטור השני. מחקרים רבים שהשתמשו בווקטורים מונוציסטרוניים שבהם כל גורם תכנות מחדש הועבר בנפרד הראו כי הקליטה של כל וקטור שונה, מה שמשפיע על סטויכיומטריה של OSKM ויעילות תכנות מחדש47. שימוש בווקטורים bicistronic יכול לעזור להקל על בעיה זו. יתר על כן, שימוש ב-IRES בווקטורים לנטי-ויראליים הראה עלייה משמעותית ביעילות התכנות מחדש48. במערכת לנטיוירוס זו, ביטוי מערכת ההפעלה מונע על ידי מקדם EF1a, בעוד ביטוי KM נמצא תחת שליטתו של מקדם CMV. ידוע כי מקדם CMV יכול להיות נתון להשתקה יעילה ביותר על ידי מתילציה DNA ו deacetylation היסטון, בניגוד EF1a49,50. לכן, ההשתקה המוקדמת של KM לפני מערכת ההפעלה במהלך תכנות מחדש עשויה להיות גורם מפתח להצלחת הפרוטוקול. זה עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים שהראו את החשיבות של דינמיקת ביטוי OSKM במהלך תכנות מחדש 51,52,53,54,55. לפיכך, וקטור bicistronic הוא גם יתרון יותר מאשר וקטור polycistronic, שבו כל גורמי OSKM באים לידי ביטוי מתוך מקדם יחיד56. גורמים נוספים התורמים להצלחת הפרוטוקול כוללים את מנות ההדבקה בלנטיוירוס ואת מספר התאים הנגועים המשמשים לתכנות מחדש, שהותאמו אישית לכל סוג תא.

לסיכום, מוצגת שיטה אופטימלית לתכנות מחדש של תאי PDAC ראשוניים יחד עם קווי תאים אחרים ותאים נורמליים. שיטה זו תסייע להרחיב את השימוש בתכנות מחדש של iPSC כדי למדל התקדמות סרטן, ובמקרה זה, לגלות סמנים ביולוגיים מוקדמים של PDAC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgments

A.S ו- J.K רוצים להודות לחקר הסרטן בבריטניה ול- OHSU על המימון (פרס פרויקט CRUK-OHSU C65925/A26986). A.S נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה של MRC (MR/N024028/1). A.A ממומן על ידי מלגת דוקטורט (מלגה מס' 1078107040) מהעיר המלך עבד אל-עזיז למדע וטכנולוגיה. J.K ממומן על ידי MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) ומענק Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). אנו מודים לפרופ' קייסוקה קאג'י על שסיפק באדיבות את וקטור התכנות מחדש pSIN4-EF1a-O2S ו- pSIN4-CMV-K2M. לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון Creative Commons Attribution (CC BY) על כל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר הנובעת מהגשה זו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol (50 mM) Thermo Fisher 31350010
Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R BioLegend 330613
Bovine Pituitary Extract (BPE) Thermo Fisher 13028014
BxPc3 ATCC CRL-1687
Cholera Toxin from Vibrio cholerae Merck  C8052-1MG
Collagen, Type I solution from rat tail Merck  C3867
Completed Defined K-SFM Thermo Fisher  10744-019
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates Merck  CLS3516
Corning syringe filters Merck  CLS431231
Corning tissue-culture treated culture dishes Merck  CLS430599
Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets Thermo Fisher 12328667
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) Merck  D8537
Fetal Calf Serum (FCS)  Thermo Fisher 10270-106
Fugene HD Transfection Reagent  Promega   E2312
Gelatin solution, Type B, 2% in H2O Merck  G1393-100ML
Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) Merck  G5154
Human EGF Recombinant Protein Thermo Fisher PHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech Thermo Fisher 100-18B
Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) Kerafast ECA001-FP
iMEF feeder cells  iXcells Biotechnologies 10MU-001-1V
Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)  Thermo Fisher 17005-042
KnockOut DMEM  Thermo Fisher 10829018
KnockOut serum Replacement  Thermo Fisher 10828028
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher 25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher 11140050
Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) Merck  SLHP033RS
Opti-MEM Reduced Serum Medium  Thermo Fisher 31985062
pMDG  AddGene 187440
Polybrene (Hexadimethrine bromide)  Merck  H9268-5G
pSIN4-CMV-K2M  AddGene 21164
pSIN4-EF2-O2S  AddGene 21162
psPAX2 AddGene 12260
pWPT-GFP  AddGene 12255
RPMI 1640 Medium (ATCC modification) Thermo Fisher A1049101
Sodym Pyruvate Thermo Fisher 11360-039
Sterile Syringes for Single Use (60 mL)  Thermo Fisher 15899152
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red Thermo Fisher 12605036
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020
Y-27632 (Dihydrochloride) STEMCELL Technologies 72304

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
  2. Hu, J. X., et al. Pancreatic cancer: A review of epidemiology, trend, and risk factors. World Journal of Gastroenterology. 27 (27), 4298 (2021).
  3. Howlader, N., et al. SEER cancer statistics review, 1975-2013. National Cancer Institute. 19, Bethesda, MD. (2016).
  4. Bengtsson, A., Andersson, R., Ansari, D. The actual 5-year survivors of pancreatic ductal adenocarcinoma based on real-world data. Scientific Reports. 10 (1), 16425 (2020).
  5. He, J., et al. 2564 resected periampullary adenocarcinomas at a single institution: trends over three decades. HPB. 16 (1), 83-90 (2014).
  6. Dusch, N., et al. Factors predicting long-term survival following pancreatic resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas: 40 years of experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 18 (4), 674-681 (2014).
  7. Principe, D. R., et al. The current treatment paradigm for pancreatic ductal adenocarcinoma and barriers to therapeutic efficacy. Frontiers in Oncology. 11, 688377 (2021).
  8. Papademetrio, D. L., et al. Interplay between autophagy and apoptosis in pancreatic tumors in response to gemcitabine. Targeted Oncology. 9 (2), 123-134 (2014).
  9. Ng, S. S., Tsao, M. S., Nicklee, T., Hedley, D. W. Effects of the epidermal growth factor receptor inhibitor OSI-774, Tarceva, on downstream signaling pathways and apoptosis in human pancreatic adenocarcinoma 1 supported by the National Cancer Institute of Canada and the Pat Myhal Fund for Pancreatic Cancer Research. Molecular Cancer Therapeutics. 1 (10), 777-783 (2002).
  10. Sultana, A., et al. Meta-analyses of chemotherapy for locally advanced and metastatic pancreatic cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (18), 2607-2615 (2007).
  11. Sun, J., Russell, C. C., Scarlett, C. J., McCluskey, A. Small molecule inhibitors in pancreatic cancer. RSC Medicinal Chemistry. 11 (2), 164-183 (2020).
  12. Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
  13. Hruban, R. H., et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. The American Journal of Surgical Pathology. 25 (5), 579-586 (2001).
  14. Maitra, A., Hruban, R. H. Pancreatic cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 157-188 (2008).
  15. Vincent, A., Herman, J., Schulick, R., Hruban, R. H., Goggins, M. Pancreatic cancer. The Lancet. 378 (9791), 607-620 (2011).
  16. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  17. Lennon, A. M., et al. The early detection of pancreatic cancer: what will it take to diagnose and treat curable pancreatic neoplasia. Cancer Research. 74 (13), 3381-3389 (2014).
  18. Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
  19. Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Research. 67 (3), 1030-1037 (2007).
  20. Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
  21. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  22. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  23. Suvà, M. L., et al. Reconstructing and reprogramming the tumor-propagating potential of glioblastoma stem-like cells. Cell. 157, 580-594 (2014).
  24. Kotini, A. G., et al. Stage-specific human induced pluripotent stem cells map the progression of myeloid transformation to transplantable leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
  25. Stricker, S. H., et al. Widespread resetting of DNA methylation in glioblastoma-initiating cells suppresses malignant cellular behavior in a lineage-dependent manner. Genes Development. 27 (6), 654-669 (2013).
  26. Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
  27. Aparicio, L. A., et al. Clinical implications of epithelial cell plasticity in cancer progression. Cancer letters. 366 (1), 1-10 (2015).
  28. Grimont, A., Leach, S. D., Chandwani, R. Uncertain beginnings: acinar and ductal cell plasticity in the development of pancreatic cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (2), 369-382 (2022).
  29. Greenspan, L. J., Weinstein, B. M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 24 (2), 251-269 (2021).
  30. Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
  31. Zhang, X., Cruz, F. D., Terry, M., Remotti, F., Matushansky, I. Terminal differentiation and loss of tumorigenicity of human cancers via pluripotency-based reprogramming. Oncogene. 32 (18), 2249-2260 (2013).
  32. Kim, J., et al. An iPSC line from human pancreatic ductal adenocarcinoma undergoes early to invasive stages of pancreatic cancer progression. Cell Reports. 3 (6), 2088-2099 (2013).
  33. Kim, J., et al. Detection of early pancreatic ductal adenocarcinoma with thrombospondin-2 and CA19-9 blood markers. Science Translational Medicine. 9 (398), (2017).
  34. Susac, L., et al. Structure of a fully assembled tumor-specific T cell receptor ligated by pMHC. Cell. 185 (17), 3201-3213 (2022).
  35. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  36. Carette, J. E., et al. Generation of iPSCs from cultured human malignant cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 115 (20), 4039-4042 (2010).
  37. Choi, S. M., et al. Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 118 (7), 1801-1805 (2011).
  38. Hochedlinger, K., et al. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes & Development. 18 (15), 1875-1885 (2004).
  39. Hu, K., et al. Efficient generation of transgene-free induced pluripotent stem cells from normal and neoplastic bone marrow and cord blood mononuclear cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 117 (14), e109-e119 (2011).
  40. Iskender, B., Izgi, K., Canatan, H. Reprogramming bladder cancer cells for studying cancer initiation and progression. Tumor Biology. 37, 13237-13245 (2016).
  41. Khoshchehreh, R., et al. Epigenetic reprogramming of primary pancreatic cancer cells counteracts their in vivo tumourigenicity. Oncogene. 38 (34), 6226-6239 (2019).
  42. Kim, H. J., et al. Establishment of hepatocellular cancer induced pluripotent stem cells using a reprogramming technique. Gut and Liver. 11 (2), 261 (2017).
  43. Lin, S. L., et al. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA. 14 (10), 2115-2124 (2008).
  44. Miyoshi, N., et al. Defined factors induce reprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 40-45 (2010).
  45. Singovski, G., et al. In vivo epigenetic reprogramming of primary human colon cancer cells enhances metastases. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 157-173 (2016).
  46. Zhao, H., et al. A highly optimized protocol for reprogramming cancer cells to pluripotency using nonviral plasmid vectors. Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells". 17 (1), 7-18 (2015).
  47. Lo, C. A., et al. Quantification of protein levels in single living cells). Cell Reports. 13 (11), 2634-2644 (2015).
  48. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  49. Prösch, S., et al. Inactivation of the very strong HCMV immediate early promoter by DNA CpG methylation in vitro. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 377 (3), 195-201 (1996).
  50. Mehta, A. K., Majumdar, S. S., Alam, P., Gulati, N., Brahmachari, V. Epigenetic regulation of cytomegalovirus major immediate-early promoter activity in transgenic mice. Gene. 428 (1-2), 20-24 (2009).
  51. Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
  52. Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
  53. Chronis, C., et al. Cooperative binding of transcription factors orchestrates reprogramming. Cell. 168 (3), 442-459 (2017).
  54. Li, D., et al. Chromatin accessibility dynamics during iPSC reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (6), 819-833 (2017).
  55. Soufi, A., Donahue, G., Zaret, K. S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors' initial engagement with the genome. Cell. 151 (5), 994-1004 (2012).
  56. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).

Tags

חקר הסרטן גיליון 204
תכנות מחדש של אדנוקרצינומה של צינור הלבלב לפלוריפוטנציה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alshaikh, A., Grygoryev, D., Keith,… More

Alshaikh, A., Grygoryev, D., Keith, D., Sheppard, B., Sears, R. C., Kim, J., Soufi, A. Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency. J. Vis. Exp. (204), e65811, doi:10.3791/65811 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter