Summary
Het huidige protocol beschrijft de herprogrammering van ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC) en normale ductale epitheelcellen van de pancreas tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). We bieden een geoptimaliseerde en gedetailleerde, stapsgewijze procedure, van het bereiden van lentivirus tot het opzetten van stabiele iPSC-lijnen.
Abstract
De generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) met behulp van transcriptiefactoren is bereikt uit bijna elk gedifferentieerd celtype en is zeer waardevol gebleken voor onderzoek en klinische toepassingen. Interessant is dat iPSC-herprogrammering van kankercellen, zoals ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC), is aangetoond dat het het invasieve PDAC-fenotype omkeert en het kankerepigenoom opheft. De differentiatie van PDAC-afgeleide iPSC's kan PDAC-progressie recapituleren van de vroege voorloper van intra-epitheliale neoplasie (PanIN) van de pancreas, waardoor de moleculaire en cellulaire veranderingen worden onthuld die vroeg optreden tijdens PDAC-progressie. Daarom kunnen PDAC-afgeleide iPSC's worden gebruikt om de vroegste stadia van PDAC te modelleren voor de ontdekking van diagnostische markers voor vroege detectie. Dit is vooral belangrijk voor PDAC-patiënten, die doorgaans worden gediagnosticeerd in de late metastatische stadia vanwege een gebrek aan betrouwbare biomarkers voor de eerdere PanIN-stadia. Het herprogrammeren van kankercellijnen, waaronder PDAC, in pluripotentie blijft echter een uitdaging, arbeidsintensief en zeer variabel tussen verschillende lijnen. Hier beschrijven we een consistenter protocol voor het genereren van iPSC's uit verschillende menselijke PDAC-cellijnen met behulp van bicistronische lentivirale vectoren. De resulterende iPSC-lijnen zijn stabiel en vertonen geen afhankelijkheid van de exogene expressie van herprogrammerende factoren of induceerbare geneesmiddelen. Over het algemeen vergemakkelijkt dit protocol het genereren van een breed scala aan PDAC-afgeleide iPSC's, wat essentieel is voor het ontdekken van vroege biomarkers die specifieker en representatiever zijn voor PDAC-gevallen.
Introduction
Ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC) is een van de meest fatale maligniteiten en een vroege diagnose blijft een uitdaging vanwege de asymptomatische aard van de ziekte. De meerderheid van de PDAC-patiënten wordt gediagnosticeerd in het gevorderde gemetastaseerde stadium wanneer zeer beperkte behandelingsopties beschikbaar zijn 1,2. Dit is voornamelijk te wijten aan het gebrek aan betrouwbare biomarkers voor de vroege stadia, zoals die welke gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd als eiwitten die in de bloedbaan vrijkomen.
PDAC kan zich zeer vroeg tijdens de progressie verspreiden en een betere prognose is in verband gebracht met vroege detectie van kanker wanneer PDAC is gelokaliseerd in de alvleesklier3. Minder dan een tiende van de PDAC-patiënten wordt echter gediagnosticeerd met een gunstige prognose, waardoor chirurgische resectie mogelijk is. Desalniettemin zijn die weinigen met resectabele tumoren ook vatbaar voor tumorrecidief binnen 12 maanden4.
In de afgelopen vijf decennia zijn opmerkelijke verbeteringen aangebracht in chirurgische technieken, patiëntenzorg en behandelingsmodaliteiten 5,6. De 5-jaarsoverleving bij chirurgisch verwijderde PDAC-patiënten is echter nauwelijks gestegen tot 17%. Dit is echter nog steeds beter dan dat bij niet-gereseceerde patiënten, dat vrijwel onveranderd is gebleven (0,9%)4,7. Chemotherapie is de enige andere alternatieve PDAC-behandeling. Toch is deze optie zeer beperkt, aangezien de overgrote meerderheid van de PDAC-patiënten een sterke resistentie vertoont tegen chemotherapiemedicijnen zoals Gemcitabine 7,8. Andere geneesmiddelen, zoals erlotinib, zijn alleen beschikbaar voor een kleine groep PDAC-patiënten met specifieke mutaties, van wie de meesten erlotinib-resistentie vertonen9. De nadelige bijwerkingen die gepaard gaan met chemotherapie bij de meeste PDAC-patiënten zijn nog een ander nadeel van dezebehandeling10. Onlangs hebben veelbelovende strategieën aangetoond dat immuuncheckpointremmers (ICI's) en small molecule kinaseremmers (SMKI's) effectief kunnen zijn bij de behandeling van PDAC, maar duurzame reacties op deze gerichte therapieën blijven beperkt tot een minderheid van de patiënten11,12. Over het algemeen kan de ontdekking van PDAC-specifieke vroege biomarkers nieuwe wegen effenen voor vroege diagnose en behandeling.
PDAC ontwikkelt zich uit voorloperlaesies van intra-epitheliale neoplasmata van de pancreas (PanIN) die het gevolg zijn van niet-invasieve proliferaties van het epitheel van de ductus pancreaticus13,14. Hoewel de vorming van PanIN wordt geïnitieerd door oncogenmutaties zoals KRAS, zijn aanvullende genetische en epigenetische veranderingen vereist voor de progressie naar PDAC. Er is voorspeld dat de progressie van PanIN door de verschillende stadia naar invasieve PDAC ongeveer 10 jaar duurt 13,15,16,17. Dit tijdsbestek biedt een geweldige kans om te profiteren van een vroege PDAC-diagnose. Daarom is er uitgebreid onderzoek gedaan om tumor-xenotransplantaatdiermodellen en organoïdeculturen vast te stellen om PDAC-progressie 18,19,20,21 te bestuderen. Deze modellen zijn zeer nuttig geweest voor het bestuderen van de invasieve stadia van PDAC, hoewel niet de overgang van de vroege PanIN-fasen. Het is daarom belangrijk om experimentele modellen te ontwikkelen die de vroege progressie van PanIN-stadia kunnen samenvatten om de ontdekking van biomarkers voor vroege detectie mogelijk te maken.
Het herprogrammeren van somatische cellen tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) met behulp van de vier transcriptiefactoren OCT4, SOX2, KLF4 en c-MYC (OSKM) heeft de mate van cellulaire plasticiteit geïllustreerd22. De plasticiteit van kankercellen is goed gedocumenteerd en het herprogrammeren van menselijke kankercellen in iPSC's is met succes gebruikt om cellen terug te zetten naar hun oorspronkelijke cellulaire toestand, waardoor veel van de epigenetische beledigingen die zich tijdens de progressie van kanker hebben opgehoopt, zijn verwijderd 23,24,25,26,27,28,29. De mogelijkheid om deze herprogrammeringsstrategie te gebruiken om de identiteit van kankercellen te manipuleren, is daarom veelbelovend bij de behandeling van kanker30,31. We hebben inderdaad eerder aangetoond dat de differentiatie van iPSC's afgeleid van PDAC's de PDAC-progressie door de vroege PanIN-stadia kan recapituleren32. Door genen en routes te identificeren die specifiek zijn voor de vroege tot intermediaire stadia van PDAC, werden kandidaat-biomarkers geïdentificeerd die klinisch kunnen worden gebruikt voor vroege PDAC-diagnose32,33. De biomarkers die werden ontdekt met behulp van een enkele iPSC-lijn vertoonden echter een beperkte dekking bij de meerderheid van de PDAC-patiënten32. De uitdagingen van het genereren van iPSC-lijnen van andere PDAC-patiënten hebben het vermogen om betrouwbaardere biomarkers te ontdekken tot stilstand gebracht. Dit is te wijten aan vele technische factoren, waaronder de heterogeniteit van OSKM-afgifte, aangezien slechts een klein deel van de menselijke primaire PDAC-cellen alle vier de factoren bevatte en met succes reageerde op herprogrammering. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het herprogrammeren van primaire PDAC-cellen met behulp van een efficiëntere en consistentere dubbele lentivirale toediening van OSKM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de OHSU Institutional Review Board. Alle methoden zijn uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften. Alle dierproeven voor PDX-tumoren werden uitgevoerd met goedkeuring van het OHSU Institutional Animal Use and Care Committee (IACUC). Dit protocol werd getest in primaire PDAC-cellen van van de patiënt afgeleid xenotransplantaat (PDX), BxPc3-cellijn met epitheelmorfologie die werd geïsoleerd uit het pancreasweefsel van een 61-jarige vrouwelijke patiënt met adenocarcinoom, de H6C7 onsterfelijke epitheelcellijn afgeleid van normaal menselijk pancreasepitheel en primaire menselijke fibroblasten afgeleid van huidbiopsie van gezonde personen. Menselijke PDAC-monsters werden verkregen in het kader van de Oregon Pancreas Tissue Registry-studie (IRB00003609). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle proefpersonen. Menselijke primaire fibroblasten werden afgeleid in RBiomedical, Edinburgh, VK, uit huidmonsters van anonieme donoren die routinechirurgie ondergingen in de Edinburgh Royal Infirmary, Little France, VK, onder hun toestemming en ethische goedkeuring (09/MRE00/91). Al het lentiviruswerk is uitgevoerd in het kader van onderzoeksactiviteit van klasse 2 (GM207/16.6) en goedgekeurd door de afdeling Gezondheid en Veiligheid van de Universiteit van Edinburgh en aangemeld bij de HSE-bevoegde autoriteit van de Schotse regering. Alle herprogrammeringsexperimenten met behulp van menselijke alvleeskliercellen werden uitgevoerd onder de ethische goedkeuring van de ethische commissie van de School of Biological Sciences van de Universiteit van Edinburgh (referentie # asoufi-0002).
1. Bereiding van lentivirussen
- Bereid voor de bereiding van lentivirussen hoogwaardige verpakkings- en expressieplasmiden (endotoxinevrij) met concentraties tussen 1-2 μg/μL, waaronder psPAX2, pMDG34 en twee RES-bevattende bicistronische vectoren; de pSIN4-EF1a-O2S-codering voor OCT4- en SOX2-expressie aangedreven door EF-1α-promotor, en pSIN4-CMV-K2M voor KLF4- en c-MYC-expressie onder de CMV-enhancer/promotor35 (zie materiaaltabel). Bereid ook pWPT-GFP-plasmide voor om te gebruiken als transfectiecontrole.
- Ontdooien Human Embryonic Kidney cellijn (293T) en kweek in Glasgow's Minimum Essential Medium (GMEM), aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 1x niet-essentiële aminozuren, 1 mM natriumpyruvaat en 1 mM glutamine bij (zie Materiaaltabel) 37 °C en 5% CO2.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 293T-cellen binnen vier passages na ontdooiing te gebruiken. - Zaad 293T met een dichtheid van 3 miljoen cellen per schaal van 15 cm, 24 uur voor transfectie. Er zijn in totaal drie gerechten nodig. Het verdient de voorkeur om later in de middag cellen te zaaien ~16:00 uur.
- De volgende dag (~16:00), wanneer cellen ~40%-50% confluentie bereiken, bereidt u het volgende voor op drie transfectiereacties:
OPMERKING: Houd altijd rekening met pipetteerfouten door 10% extra volume toe te voegen.- Label drie plastic buisjes van 15 ml met de juiste lentivirusnaam (pSIN4-EF1a-O2S, pSIN4-CMV-K2M en pwPT-GFP-controle). Voeg 1.710 ml gereduceerd serummedium (zie Materiaaltabel) toe aan elke tube.
- Verdun 90 μL transfectiereagens (zie materiaaltabel) in 1.710 ml gereduceerd serummedium, meng door middel van vertexing gedurende 2 s en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Meng de verpakkingsvectoren; 5,1 μg psPAX2 en 2,4 μg pMDG (7,5 μg totaal).
- Voeg het verpakkingsvectormengsel toe aan het transfectiemedium (uit stap 1.4.2) en draai gedurende 2 s.
- Voeg 7,5 μg van elke herprogrammeringsvector: pSIN4-EF1a-O2S en pSIN4-CMV-K2M en de pwPT-GFP-regeling toe aan het transfectiemengsel van stap (1.4.4) en vortex gedurende 2 s.
OPMERKING: Gebruik de expressievector: virale vector in een verhouding van 1:1.
- Incubeer de transfectiebuisjes gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Transfecteer de 293T-cellen met elk lentivirus door het transfectie-DNA-mengsel van stap (1.4.5) druppelsgewijs aan de media toe te voegen. Draai de schaal rond om een gelijkmatige verdeling over het hele oppervlak te garanderen.
- Incubeer de getransfecteerde cellen een nacht in een incubator van 37 °C, 5% CO2 .
NOTITIE: Gebruik virusspecifiek afval, een metalen afvalemmer, dubbele zak met autoclaafzakken en neem een container voor vloeibaar afval voor virussen en voeg een desinfecterende tablet toe. Gooi alle pipetten, tips en buisjes weg in een metalen emmer. Gooi oude media weg in een virus-vloeibare afvalcontainer. Vermijd het gebruik van glazen pipetten en glaswerk om onbedoelde virusbesmetting te voorkomen. - Vervang na 14-16 uur na transfectie het medium door 30 ml vers 293T-medium.
- Incubeer de getransfecteerde cellen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 60-72 uur na de gemiddelde verandering. Observeer de cellen dagelijks en controleer de transfectie-efficiëntie door GFP-fluorescentie.
OPMERKING: Idealiter zou de transfectie-efficiëntie >90% moeten zijn door GFP. Voor de andere virussen moet men duidelijke morfologische veranderingen van 293T-cellen waarnemen, omdat ze de neiging hebben om ronder te worden bij het produceren van virusdeeltjes. - Verzamel de media van elke virustransfectiecultuur in buisjes van 50 ml en draai ze naar beneden om celresten op te ruimen bij 1932 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Filtreer elk lentivirus-supernatans door een spuitfilter van 0,45 μM om kleiner vuil te verwijderen en op te vangen in nieuwe buisjes van 50 ml.
- Verdeel elk lentivirussupernatans in aliquots van 6 ml en vries elk snel in vloeibare stikstof in.
- Bewaar de lentivirus aliquots bij -80 °C tot gebruik.
2. Herprogrammering van lentivirustransductie
- Ontdooi primaire PDAC-cellen en kweek in volledig gedefinieerde Keratinocyte Serum Free Medium (KSFM), aangevuld met Boviene Hypofyse Extract (BPE), humane recombinante epidermale groeifactor (EGF) bij 5 ng/ml en choleratoxine bij 50 ng/ml in een incubator van 37 °C, 5% CO2 en 5% O2 (hypoxie) (zie Materiaaltabel).
- Ontdooi BxPc3, een cellijn van ductaal adenocarcinoom van plaveiselcelcreas van de pancreas, en kweek in RPMI 1640-medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS) bij 37 °C en 5% CO2.
- Ontdooi H6C7-cellen, ductale epitheelcellen van de pancreas en kweek in KSFM aangevuld met BPE en EGF bij 5 ng/ml, bij 37 °C en 5% CO2.
- Ontdooien Humaan fibroblast (hFib) en kweek in Glasgow's Minimum Essential Medium (GMEM), aangevuld met 10% FCS, 1x niet-essentiële aminozuren, 1 mM natriumpyruvaat en 1 mM glutamine, en 0,05 mM (definitief) Bèta-mercaptoethanol bij 37 °C en 5% CO2.
- Bereid een dag voorafgaand aan de lentivirustransductie (bij voorkeur laat in de middag) twee putjes voor van een plaat met 6 putjes met 100.000 cellen per putje van elk PDAC-, BxPc3-, H6C7- en hFib-cellen. Infecteer een bron met OSKM-lentivirussen en gebruik de tweede als niet-geïnfecteerde controle.
OPMERKING: Gebruik een aparte plaat voor elk celtype. - Zorg er de volgende dag, 's middags (ongeveer 24 uur later), voor dat de celconfluentie ten minste 70% bereikt voordat u doorgaat naar de volgende stap van de lentivirusinfectie.
3. Lentivirustransductie van PDAC
- Ontdooi 5 ml van elk lentivirussupernatans in een virusincubator van 37 °C.
- Bereid twee buisjes van 15 ml voor, elk met 2 ml voorverwarmd PDAC-kweekmedium.
- Voeg aan het eerste buisje 6 ml van elk herprogrammerend lentivirus (pSIN4-CMV-K2M en pSIN4-EF1a-O2S) en 12 μl van 4,5 mg/ml polybreen (laatste 4,5 μg/ml, zie materiaaltabel) toe en meng.
- Voeg aan het tweede buisje 2 μL van 4,5 mg/ml polybreen (laatste 4,5 μg/ml) toe.
- Gooi het medium uit elk putje weg en was het eenmaal met PBS op kamertemperatuur.
- Voeg het herprogrammerende infectiemedium (buis 1) toe aan het eerste putje.
- Voeg het mengsel van buis 2 toe aan het tweede kuiltje. Dit zal de niet-geïnfecteerde controle zijn.
- Incubeer de PDAC-cellen 's nachts in een incubator van 37 °C, 5% CO2 en 5% O2 (hypoxie).
- De volgende dag, 's middags, gooi je de media uit beide putten weg en vervang je deze door vers PDAC-kweekmedium.
- Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2 en 5% O2 (hypoxie) gedurende 48 uur.
4. Lentivirustransductie van BxPc3-cellen
- Ontdooi 3 ml van elk lentivirussupernatans in een virusincubator van 37 °C.
- Bereid twee buisjes van 15 ml voor, elk met 2 ml BxPc3-kweekmedium.
- Voeg aan het eerste buisje 3 ml van elk herprogrammeringslentivirus (pSIN4-CMV-K2M en pSIN4-EF1a-O2S) en 6 μl van 4,5 mg/ml polybreen (laatste 4,5 μg/ml) toe en meng.
- Voeg aan het tweede buisje 2 μL van 4,5 mg/ml polybreen (laatste 4,5 μg/ml) toe.
- Gooi het medium uit elk putje weg en was het eenmaal met PBS.
- Voeg het herprogrammerende infectiemedium (buis 1) toe aan het eerste putje.
- Voeg het mengsel van buis 2 toe aan het tweede kuiltje. Dit zal de niet-geïnfecteerde controle zijn.
- Incubeer de geïnfecteerde BxPc3-cellen bij 37 °C virus en 5% CO2 's nachts.
- Gooi de volgende dag, 's middags, de media uit beide putten weg en vervang deze door vers BxPc3-kweekmedium.
- Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 48 uur.
5. Lentivirus-transductie van H6c7-celinfectie
- Ontdooi 4 ml van elk lentivirus-supernatans in een virusincubator van 37 °C.
- Bereid twee buisjes van 15 ml voor, elk met 2 ml H6c7 kweekmedium.
- Voeg aan het eerste buisje 4 ml van elk herprogrammeringslentivirus (pSIN4-CMV-K2M en pSIN4-EF1a-O2S) en 8 μl van 4,5 mg/ml polybreen (laatste 4,5 μg/ml) toe en meng.
- Voeg aan het tweede buisje 2 μL van 4,5 mg/ml polybreen (laatste 4,5 μg/ml) toe.
- Gooi het medium uit beide putjes weg en was het eenmaal met PBS.
- Voeg het herprogrammerende infectiemedium (buis 1) toe aan het eerste putje.
- Voeg het mengsel van buis 2 toe aan het tweede kuiltje. Dit zal de niet-geïnfecteerde controle zijn.
- Incubeer de geïnfecteerde H6C7-cellen bij 37 °C virus en 5% CO2 's nachts.
- Gooi de volgende dag, 's middags, de media uit beide putten weg en vervang ze door een vers H6c7-kweekmedium.
- Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 48 uur.
6. Lentivirustransductie van hFib-cellen
- Ontdooi 2 ml van elk lentivirussupernatans in een virusincubator van 37 °C.
- Bereid twee buisjes van 15 ml voor, elk met 2 ml hFib-kweekmedium.
- Voeg aan het eerste buisje 2 ml van elk herprogrammeringsvirus toe (pSIN4-CMV-K2M en pSIN4-EF1a-O2S) en voeg 4 μL van 4,5 mg/ml polybreen (laatste 4,5 μg/ml) toe en meng.
- Voeg aan het tweede buisje 2 μL 4,5 mg/ml polybreen (laatste 4,5 μg/ml) toe en meng.
- Gooi het medium uit elk putje weg en was het eenmaal met PBS.
- Voeg het herprogrammerende infectiemedium (buis 1) toe aan het eerste putje.
- Voeg het mengsel van buis 2 toe aan het tweede kuiltje. Dit zal de niet-geïnfecteerde controle zijn.
- Incubeer de geïnfecteerde hFib-cellen bij 37 °C en 5% CO2 's nachts.
- Gooi de volgende dag, 's middags, het medium uit beide putten weg en vervang het door vers hFib-kweekmedium.
- Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende nog eens 48 uur.
OPMERKING: Voor een efficiënte lentivirustransductie moet u de hoeveelheid lentivirus zorgvuldig titeren, aangezien dit sterk varieert tussen de verschillende celtypen. Voor sommige celtypen kunnen meerdere lentivirustransducties nodig zijn. PDAC-cellijnen vereisen maximaal drie doses, terwijl één dosis voldoende was voor het herprogrammeren van BxPc3-, H6C7- en hFib-lijnen.
7. Bereiding van iMEF-toevoercellen
- Bereid 40 ml 0,2% gelatineoplossing door 1% gelatinebouillonoplossing te verdunnen met PBS.
- Smeer vier platen met 6 putjes in door elk putje te bedekken met 2 ml 0,2% gelatineoplossing.
- Incubeer de met gelatine beklede platen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende ten minste 30 min.
- Zuig de overtollige gelatine-oplossing op en laat de platen drogen onder de stroomkap.
- Ontdooi twee injectieflacons (~ 4 miljoen cellen per flacon) bestraalde embryonale fibroblast van muizen (iMEF's) door deze in een waterbad van 37 °C rond te draaien.
NOTITIE: Om de kans op besmetting te verkleinen, moet u ervoor zorgen dat er geen water in de buurt van de dopopening spat. Droog de injectieflacon af met keukenpapier en spuit deze in met 70% ethanol. - Pipetteer in de weefselkweekkap de inhoud van elke ontdooide iMEFs-injectieflacon druppelsgewijs in een buisje van 15 ml met 10 ml voorverwarmd hFib-kweekmedium en meng goed door het buisje voorzichtig om te keren.
- Draai de celsuspensie af op 309 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatans uit elke buis. Resuspendeer elke celpellet in 12 ml hFib-medium.
- Plaat: 2 ml van de celsuspensie per putje van de met gelatine omhulde platen met 6 putjes. Verdeel de cellen gelijkmatig door de platen zachtjes in alle richtingen te schudden.
- Incubeer de platen een nacht bij 37 °C en 5% CO2 .
NOTITIE: Bereid 24 uur voordat u nieuwe iMEF-platen voor gebruik voor het herprogrammeerexperiment voor.
8. Overbrengen van de geïnfecteerde cellen naar de iMEF-toevoerlaag
- Gooi media weg van de geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde PDAC-, BxPc3-, H6c7- en hFib-cellen. Was elk putje twee keer met PBS op kamertemperatuur.
- Dissocieer de cellen van de plaat door 0,5 ml trypsine aan elk putje toe te voegen. Incubeer PDAC-cellen in een incubator van 37 °C, 5% CO2 en 5% O2 (hypoxie) gedurende 15 minuten.
- Incubeer BxPc3-cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 5 min.
- Incubeer H6c7- en hFib-cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 4 min.
- Breng de gedissocieerde celsuspensie van elk putje over in buisjes van 15 ml die dienovereenkomstig zijn gelabeld als geïnfecteerd of niet-geïnfecteerd.
- Oogst de cellen door centrifugeren als volgt: voor PDAC, centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 300 x g ; voor BxPc3 draait u de celsuspensie gedurende 5 minuten op 120 x g ; voor H6C7 draait u de celsuspensie gedurende 4 minuten op 112 x g ; voor hFib, draai de celsuspensie op 161 x g gedurende 3 minuten. Voer alle centrifugaties uit bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer elke pellet van het celtype in 1 ml van de juiste kweekmedia.
- Was iMEF-platen die in stap 7 zijn voorbereid met elk celtype kweekmedium twee keer. d.w.z. was één plaat met PDAC-media, één met BxPc3-media, één met H6C7-medium en de andere met hFib-medium.
- Plaat 50.000 geïnfecteerde cellen per putje in vijf putjes iMEF 6-putjes plaat. Plaat 50.000 niet-geïnfecteerde controlecellen in de resterende één put van iMEF 6-wells plaat.
OPMERKING: Optimaliseer het aantal geïnfecteerde cellen dat moet worden geplateerd van 1.000 tot 50.000 cellen per putje. - Incubeer PDAC-cellen bij 37 °C, 5% CO2 en 5% O2 (hypoxie) gedurende een nacht.
- Incubeer BxPc3-, H6C7- en hFib-cellen bij 37 °C en 5% CO2 's nachts.
- Bereid de volgende dag het herprogrammeringsmedium als volgt voor: voeg 100 ml knock-out serumvervanging (25% definitief), 5 ml 200 mM glutamine (1 mM definitief), 5 ml 100x niet-essentiële aminozuren (100 μM definitief), 1,5 ml bèta-mercaptoethanol (0,1 mM definitief) toe aan 400 ml Modified Eagle Medium (DMEM).
- Bewaar de herprogrammeermedia maximaal 4 weken in aliquots van 100 ml bij 4 °C of langer bij -20 °C.
- Als u klaar bent voor gebruik, voegt u 100 μl 10 mg/ml basisfibroblastgroeifactor (bFGF) (10 ng/ml definitief) toe aan één 100 ml herprogrammeermediaaliquot.
- Verwarm de herprogrammeermedia in een waterbad van 37 °C.
- Was de cellen die groeien op iMEF-feeders twee keer met voorverwarmde herprogrammeermedia.
Voeg 2 ml herprogrammeermedium toe aan elk putje. - Breng de herprogrammeerplaten over in een incubator van 37 °C, 5% CO2en 3% O2 (hypoxie).
OPMERKING: De dag waarop herprogrammeermedia worden toegevoegd, wordt beschouwd als dag 1 van het herprogrammeren. - Voed de cellen dagelijks met verse herprogrammeermedia totdat iPSC-kolonies beginnen te verschijnen.
OPMERKING: Identificeer iPSC-kolonies aan de hand van hun ESC-achtige morfologie (compacte kolonies met goed gedefinieerde randen en bestaande uit cellen met een hoge kern/cytoplasma-verhouding). - Houd de iPSC-kolonies dagelijks in de gaten en nadat er voldoende aantal is gevormd, passeer ze als een poel.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de iPSC-kolonies elkaar niet raken, omdat dit zou leiden tot differentiatie en hun stabiliteit op lange termijn zou beïnvloeden. - Om klonale lijnen vast te stellen, passeer je de iPSC-pool ongeveer 5 keer en kies je vervolgens robuuste kolonies die hun ESC-achtige morfologie behouden.
- Om volledig geherprogrammeerde iPSC-kolonies te identificeren, voert u levende kleuring uit met TRA-160 (zie Materiaaltabel) en oogst u RNA van iPSC-kolonies voor karakterisering van genexpressie.
9. Passatie van iPSC-kolonies
- Bereid 24 uur voor het passeren van de iPSC-voederplaten voldoende iMEF-toevoerplaten voor, zoals beschreven in stap 7.
- Was de iMEF-toevoerplaten twee keer met voorverwarmde herprogrammeermedia.
- Voeg 2 ml herprogrammeermedia aangevuld met ROCK-remmer (Y2) (10 μM) toe aan elk putje van de iMEF-plaat.
- Incubeer de iMEF-platen in een incubator van 37 °C, 5% CO2 en 3% O2 tot ze klaar zijn voor gebruik.
- Bereid een ethyleendiaminetetra-azijnzuur/fosfaatgebufferde zoutoplossing (EDTA/PBS) door 0,5 M EDTA 1:1000 te verdunnen in PBS (0,5 mM definitief).
- Vervang de herprogrammeerbare kweekmedia door 0,5 ml EDTA/PBS in elk putje.
- Incubeer in een incubator van 37 °C, 5% CO2 en 3% O2 of bij kamertemperatuur, afhankelijk van het celtype. BxPc3 en PDAC iPSC's vereisen een incubatietijd van 15 minuten bij 37 °C. H6C7 en hFib iPSC's moeten gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur worden geïncubeerd.
- Controleer de iPSC-cellen onder de microscoop totdat ze gelijkmatig beginnen te dissociëren van de voedingslaag in de hele kolonie.
- Vang de gedissocieerde iPSC-celsuspensie op in een centrifugebuisje van 15 ml. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer de celpellet in 1 ml herprogrammeermedia aangevuld met Y2 (10 μM).
- Plaat de cellen op de iMEF-toevoerlaag door elke 1 ml iPSC-celsuspensie over te brengen naar drie putjes van de iMEF-plaat.
OPMERKING: De splitsingsverhouding kan variëren afhankelijk van het aantal geoogste iPSC-kolonies. - Incubeer in een incubator van 37 °C, 5% CO2 en 3% O2 .
10. Levende kleuring van iPSC-kolonies met TRA-1-60
- Bereid 0,5 ml per putje 4 μg/ml TRA-1-60-antilichaam in herprogrammeermedia.
- Gooi herprogrammeermedia weg en vervang deze door een antilichaammengsel van 0,5 ml in elk putje. Incubeer gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C, 5% CO2 en 3% O2 .
- Was de cellen twee keer met de herprogrammeermedia.
- Leg fluorescentiebeelden vast met een celbeeldvormingssysteem met behulp van het GFP-filter.
- Controleer de beeldkwaliteit door rekening te houden met het negatieve controlekanaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve afbeeldingen van de morfologie van iPSC-kolonies afgeleid van PDAC-, BXPc3-, H6C7- en hFib-cellen worden weergegeven in figuur 1. PDAC-iPSC-kolonies begonnen zich te vormen op dag 25 van de herprogrammering. Robuuste iPSC-kolonies met een meer gevestigde ESC-achtige morfologie werden geïdentificeerd op dag 40 van de herprogrammering (Figuur 1). Evenzo begon de vorming van BxPc3-iPSC's op dag 23 en werd meer ingeburgerd op dag 35. De vorming van H6C7-iPSC was vergelijkbaar met PDAC-iPSC's en begon zich op dag 45 te vestigen. hFib-iPSC-kolonies begonnen zich te vormen op dag 15 van de herprogrammering.
Figuur 1: Representatieve beelden van iPSC-kolonies. De afbeeldingen tonen een vastgestelde hESC-achtige morfologie die is afgeleid van (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 en (D) hFib. De dagen van herprogrammering staan boven elke afbeelding aangegeven. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Klonale iPSC-lijnen werden vastgesteld op basis van elke herprogrammering van PDAC-, BxPc3-, H6C7- en hFib-cellen. Alle gevestigde iPSC-lijnen kleurden positief voor TRA-1-60, een ongedifferentieerde hESC-celoppervlaktemarker, wat hun herprogrammering tot pluripotentie bevestigt (Figuur 2).
Figuur 2: Representatieve beelden van klonale iPSC-lijnen. De afbeeldingen zijn afgeleid van (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 en (D) hFib met ESC-achtige morfologie (bovenste panelen) en positieve kleuring voor TRA-1-60 (onderste paneel). Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om het gebruik van iPSC-herprogrammering voor het bestuderen van kankerprogressie te vergemakkelijken, is een robuust protocol opgesteld voor het herprogrammeren van alvleesklierkankercellen. Het herprogrammeren van kankercellen tot pluripotentie is tot nu toe een grote uitdaging gebleken, aangezien slechts enkele onderzoeken met succes iPSC's hebben gegenereerd uit kankercellen 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. De meeste van deze onderzoeken gebruikten onsterfelijke kankercellijnen om iPSC-lijnen te genereren, geen primaire van patiënten afgeleide cellen 36,37,38,40,42,43,44,46. Er werd bijvoorbeeld geprobeerd vier verschillende leverkankercellijnen te herprogrammeren met behulp van de retrovirale introductie van OSKM-factoren, maar slechts één cellijn werd met succes geherprogrammeerd41. De gegenereerde iPSC-lijn voor leverkanker vertoonde echter een verlies van stamheid na een paar passages, wat de hoge weerstand van kankercellen tegen OSKM-herprogrammering benadrukte41. Eerder werden pogingen ondernomen om PDAC-cellen te herprogrammeren met behulp van lentivirale toediening van OSKM individueel; er werd echter slechts één iPSC-lijn gegenereerd, afhankelijk van exogene OSKM-expressie en daarom niet volledig geherprogrammeerd37. Een andere studie gebruikte episomale vectoren om OSKM-factoren af te leveren zonder genomische integratie, maar slaagde er slechts in om een enkele iPSC-kloon van PDAC39 te genereren. Het beperkte succes bij het herprogrammeren van kankercellen draagt bij aan de vele uitdagingen die het gebruik van iPSC-technologie in kankeronderzoek belemmeren.
Hier wordt het genereren van iPSC's uit primaire PDAC-monsters afkomstig van twee verschillende patiënten en één gevestigde PDAC-cellijn (BxPc3) uitgelegd. Bovendien zijn er ook iPSC's gegenereerd uit H6c7, een ductale epitheelcellijn van de pancreas. Voor zover wij weten, is dit het eerste rapport van succesvol afgeleide stabiele iPSC-lijnen van BxPc3 en H6c7. Volgens dit protocol zijn iPSC's ook met succes gegenereerd uit primaire menselijke fibroblasten die zijn afgeleid van gezonde individuen, waardoor de toepasbaarheid van de methode verder gaat dan kankeronderzoek.
Een van de belangrijkste elementen achter het succes van het protocol is het gebruik van bicistronische lentivirale vectoren om OS- en KM-factoren samen tot expressie te brengen. Deze vectoren bevatten de interne ribosoomingangsplaats 2 (IRES2) om OCT4 en SOX2 in de ene vector tot expressie te brengen en KLF4 en cMYC in de andere. Meerdere studies waarbij monocistronische vectoren werden gebruikt, waarbij elke herprogrammeringsfactor afzonderlijk werd geleverd, hebben aangetoond dat de opname van elke vector anders is, wat van invloed is op de OSKM-stoichiometrie en de efficiëntie van herprogrammering47. Het gebruik van bicistronische vectoren kan dit probleem helpen verminderen. Bovendien heeft het gebruik van IRES in lentivirale vectoren een aanzienlijke toename van de herprogrammeringsefficiëntie laten zien48. In dit lentivirussysteem wordt de OS-expressie aangestuurd door de EF1a-promotor, terwijl de KM-expressie onder controle staat van een CMV-promotor. Het is bekend dat de CMV-promotor kan worden onderworpen aan zeer efficiënte uitschakeling door DNA-methylering en histondeacetylering, in tegenstelling tot EF1a49,50. Daarom kan het vroegtijdig tot zwijgen brengen van KM vóór het besturingssysteem tijdens het herprogrammeren een sleutelfactor zijn voor het succes van het protocol. Dit komt overeen met eerdere studies die het belang van OSKM-expressiedynamiek aantonen tijdens het herprogrammeren van 51,52,53,54,55. De bicistronische vector is dus ook voordeliger dan de polycistronische vector, waarbij alle OSKM-factoren worden uitgedrukt vanuit een enkele promotor56. Andere factoren die bijdragen aan het succes van het protocol zijn onder meer de doses lentivirusinfectie en het aantal geïnfecteerde cellen dat wordt gebruikt voor herprogrammering, die voor elk celtype zijn aangepast.
Samengevat wordt een geoptimaliseerde methode gepresenteerd voor het herprogrammeren van primaire PDAC-cellen samen met andere cellijnen en normale cellen. Deze methode zal helpen het gebruik van iPSC-herprogrammering uit te breiden om kankerprogressie te modelleren en, in dit geval, vroege PDAC-biomarkers te ontdekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
A.S en J.K willen Cancer Research UK en OHSU bedanken voor de financiering (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S wordt ondersteund door een MRC career development award (MR/N024028/1). AA wordt gefinancierd door een Ph.D. beurs (Scholarship ref. 1078107040) van King Abdulaziz City for Science and Technology. JK wordt gefinancierd door MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) en Knight CEDAR grant (68182-933-000, 68182-939-000). Wij danken Prof. Keisuke Kaji voor het beschikbaar stellen van de herprogrammeervector pSIN4-EF1a-O2S en pSIN4-CMV-K2M. Ten behoeve van open access heeft de auteur een Creative Commons Attribution (CC BY)-licentie toegepast op elke door de auteur geaccepteerde manuscriptversie die voortkomt uit deze inzending.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 | |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 | |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 | |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 | |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 | |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 | |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 | |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML | |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B | |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP | |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V | |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 | |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | |
| pMDG | AddGene | 187440 | |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G | |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 | |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 | |
| psPAX2 | AddGene | 12260 | |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 | |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 | |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 | |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
References
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Hu, J. X., et al. Pancreatic cancer: A review of epidemiology, trend, and risk factors. World Journal of Gastroenterology. 27 (27), 4298 (2021).
- Howlader, N., et al. SEER cancer statistics review, 1975-2013. National Cancer Institute. 19, Bethesda, MD. (2016).
- Bengtsson, A., Andersson, R., Ansari, D. The actual 5-year survivors of pancreatic ductal adenocarcinoma based on real-world data. Scientific Reports. 10 (1), 16425 (2020).
- He, J., et al. 2564 resected periampullary adenocarcinomas at a single institution: trends over three decades. HPB. 16 (1), 83-90 (2014).
- Dusch, N., et al. Factors predicting long-term survival following pancreatic resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas: 40 years of experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 18 (4), 674-681 (2014).
- Principe, D. R., et al. The current treatment paradigm for pancreatic ductal adenocarcinoma and barriers to therapeutic efficacy. Frontiers in Oncology. 11, 688377 (2021).
- Papademetrio, D. L., et al. Interplay between autophagy and apoptosis in pancreatic tumors in response to gemcitabine. Targeted Oncology. 9 (2), 123-134 (2014).
- Ng, S. S., Tsao, M. S., Nicklee, T., Hedley, D. W. Effects of the epidermal growth factor receptor inhibitor OSI-774, Tarceva, on downstream signaling pathways and apoptosis in human pancreatic adenocarcinoma 1 supported by the National Cancer Institute of Canada and the Pat Myhal Fund for Pancreatic Cancer Research. Molecular Cancer Therapeutics. 1 (10), 777-783 (2002).
- Sultana, A., et al. Meta-analyses of chemotherapy for locally advanced and metastatic pancreatic cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (18), 2607-2615 (2007).
- Sun, J., Russell, C. C., Scarlett, C. J., McCluskey, A. Small molecule inhibitors in pancreatic cancer. RSC Medicinal Chemistry. 11 (2), 164-183 (2020).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Hruban, R. H., et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. The American Journal of Surgical Pathology. 25 (5), 579-586 (2001).
- Maitra, A., Hruban, R. H.
- Vincent, A., Herman, J., Schulick, R., Hruban, R. H., Goggins, M.
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Lennon, A. M., et al. The early detection of pancreatic cancer: what will it take to diagnose and treat curable pancreatic neoplasia. Cancer Research. 74 (13), 3381-3389 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Research. 67 (3), 1030-1037 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Suvà, M. L., et al. Reconstructing and reprogramming the tumor-propagating potential of glioblastoma stem-like cells. Cell. 157, 580-594 (2014).
- Kotini, A. G., et al. Stage-specific human induced pluripotent stem cells map the progression of myeloid transformation to transplantable leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Stricker, S. H., et al. Widespread resetting of DNA methylation in glioblastoma-initiating cells suppresses malignant cellular behavior in a lineage-dependent manner. Genes Development. 27 (6), 654-669 (2013).
- Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
- Aparicio, L. A., et al. Clinical implications of epithelial cell plasticity in cancer progression. Cancer letters. 366 (1), 1-10 (2015).
- Grimont, A., Leach, S. D., Chandwani, R. Uncertain beginnings: acinar and ductal cell plasticity in the development of pancreatic cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (2), 369-382 (2022).
- Greenspan, L. J., Weinstein, B. M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 24 (2), 251-269 (2021).
- Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
- Zhang, X., Cruz, F. D., Terry, M., Remotti, F., Matushansky, I. Terminal differentiation and loss of tumorigenicity of human cancers via pluripotency-based reprogramming. Oncogene. 32 (18), 2249-2260 (2013).
- Kim, J., et al. An iPSC line from human pancreatic ductal adenocarcinoma undergoes early to invasive stages of pancreatic cancer progression. Cell Reports. 3 (6), 2088-2099 (2013).
- Kim, J., et al. Detection of early pancreatic ductal adenocarcinoma with thrombospondin-2 and CA19-9 blood markers. Science Translational Medicine. 9 (398), (2017).
- Susac, L., et al. Structure of a fully assembled tumor-specific T cell receptor ligated by pMHC. Cell. 185 (17), 3201-3213 (2022).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Carette, J. E., et al. Generation of iPSCs from cultured human malignant cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 115 (20), 4039-4042 (2010).
- Choi, S. M., et al. Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 118 (7), 1801-1805 (2011).
- Hochedlinger, K., et al. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes & Development. 18 (15), 1875-1885 (2004).
- Hu, K., et al. Efficient generation of transgene-free induced pluripotent stem cells from normal and neoplastic bone marrow and cord blood mononuclear cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 117 (14), e109-e119 (2011).
- Iskender, B., Izgi, K., Canatan, H. Reprogramming bladder cancer cells for studying cancer initiation and progression. Tumor Biology. 37, 13237-13245 (2016).
- Khoshchehreh, R., et al. Epigenetic reprogramming of primary pancreatic cancer cells counteracts their in vivo tumourigenicity. Oncogene. 38 (34), 6226-6239 (2019).
- Kim, H. J., et al. Establishment of hepatocellular cancer induced pluripotent stem cells using a reprogramming technique. Gut and Liver. 11 (2), 261 (2017).
- Lin, S. L., et al. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA. 14 (10), 2115-2124 (2008).
- Miyoshi, N., et al. Defined factors induce reprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 40-45 (2010).
- Singovski, G., et al. In vivo epigenetic reprogramming of primary human colon cancer cells enhances metastases. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 157-173 (2016).
- Zhao, H., et al. A highly optimized protocol for reprogramming cancer cells to pluripotency using nonviral plasmid vectors. Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells". 17 (1), 7-18 (2015).
- Lo, C. A., et al. Quantification of protein levels in single living cells). Cell Reports. 13 (11), 2634-2644 (2015).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Prösch, S., et al. Inactivation of the very strong HCMV immediate early promoter by DNA CpG methylation in vitro. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 377 (3), 195-201 (1996).
- Mehta, A. K., Majumdar, S. S., Alam, P., Gulati, N., Brahmachari, V. Epigenetic regulation of cytomegalovirus major immediate-early promoter activity in transgenic mice. Gene. 428 (1-2), 20-24 (2009).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Chronis, C., et al. Cooperative binding of transcription factors orchestrates reprogramming. Cell. 168 (3), 442-459 (2017).
- Li, D., et al. Chromatin accessibility dynamics during iPSC reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (6), 819-833 (2017).
- Soufi, A., Donahue, G., Zaret, K. S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors' initial engagement with the genome. Cell. 151 (5), 994-1004 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
