Summary
在这里，我们提出了一个方案，演示了使用水凝胶作为脂肪来源干细胞 （ADSC） 培养的三维 （3D） 细胞培养框架，并引入光生物调节 （PBM） 以增强 ADSC 在 3D 培养环境中的增殖。
Abstract
脂肪干细胞 （ADSC） 具有类似于干细胞的多能间充质特性，由于其具有多种细胞分化的能力以及增强迁移、增殖和减轻炎症的能力，因此经常被用于再生医学。然而，ADSC在伤口内的存活和植入方面经常面临挑战，主要是由于不利的炎症条件。为了解决这个问题，已经开发了水凝胶来维持ADSC在伤口中的活力并加速伤口愈合过程。在这里，我们旨在评估光生物调节 （PBM） 在 3D 细胞培养框架内对 ADSC 增殖和细胞毒性的协同影响。将永生化的ADSC接种到密度为2.5 x 103 个细胞的10 μL水凝胶中，并使用525 nm和825 nm二极管以5 J/cm2 和10 J/cm2的流度进行照射。在 PBM 暴露后 24 小时和 10 天评估形态学变化、细胞毒性和增殖。ADSC表现出圆形形态，并作为单个细胞或球状聚集体分散在整个凝胶中。重要的是，PBM和3D培养框架均未显示出对细胞的细胞毒性作用，而PBM显著增强了ADSC的增殖速率。总之，本研究证明了使用水凝胶作为 ADSC 培养的合适 3D 环境，并引入了 PBM 作为一种重要的增强策略，特别是解决了与 3D 细胞培养相关的缓慢增殖速率。
Introduction
ADSC是间充质多能祖细胞，具有自我更新和分化成多个细胞谱系的能力。这些细胞可以在脂肪抽吸过程中从脂肪组织的基质血管部分 （SVF） 中收获1。ADSC已成为用于再生医学的理想干细胞类型，因为这些细胞含量丰富，收获微创，易于获取，并且表征良好2。干细胞疗法通过刺激细胞迁移、增殖、新生血管形成和减少伤口内的炎症，为伤口愈合提供了一种可能的途径 3,4。大约 80% 的 ADSC 再生能力可归因于通过其分泌组5 的旁分泌信号传导。以前，有人建议将干细胞或生长因子直接局部注射到受损组织中可以非法充分的体内修复机制6,7,8。然而，这种方法面临着一些挑战，例如由于炎症环境导致的存活率低和受损组织内干细胞植入减少 9。此外，引用的原因之一是缺乏细胞外基质来支持移植细胞的存活和功能10。为了克服这些挑战，现在的重点是开发生物材料载体，以支持干细胞的活力和功能。
三维 （3D） 细胞培养在体外增强了细胞间和细胞间与基质的相互作用，以提供更类似于体内环境的环境 11。水凝胶作为一类生物材料载体已被广泛研究，可为干细胞培养提供 3D 环境。这些结构由水和交联聚合物12制成。在培养过程中，将ADSC封装在水凝胶中对细胞几乎没有细胞毒性作用，同时保持细胞的活力6。在 3D 中培养的干细胞表现出增强的干性保留和更高的分化能力13。同样，水凝胶接种的ADSC在动物模型中显示出更高的活力和加速的伤口闭合14。此外，水凝胶包封显着增加了ADSC在伤口中的植入和保留15,16。TrueGel3D由聚乙烯醇或葡聚糖聚合物制成，通过交联剂（环糊精或聚乙二醇17）固化。该凝胶是一种合成水凝胶，不含任何动物产品，这些动物产品在将凝胶移植到患者体内时可能会干扰实验或引发免疫反应，同时有效地模拟细胞外基质18。凝胶完全可通过改变成分和单个成分进行定制。它可以容纳不同的干细胞，并通过调整凝胶的刚度来支持几种细胞类型的分化19。可以通过添加肽20来创建附着位点。凝胶可通过分泌金属蛋白酶降解，允许细胞迁移21。最后，它很清楚，允许成像技术。
PBM 是一种微创且易于执行的低水平激光疗法，用于刺激细胞内发色团。不同的波长对细胞产生不同的影响22.红色至近红外范围内的光通过增强通过电子传递链的通量来刺激增加三磷酸腺苷 （ATP） 和活性氧 （ROS） 的产生23。蓝色和绿色范围内的光刺激光门控离子通道，允许阳离子（如钙和镁）非特异性流入细胞，这已知可以增强分化24。净效应是次级信使的产生，这些信使刺激触发下游细胞过程（如迁移、增殖和分化）的因子的转录25。PBM可用于在将细胞移植到不利环境（例如受损组织）之前预处理细胞增殖或分化26。在糖尿病大鼠模型中，移植前和移植后 PBM（630 nm 和 810 nm）暴露 ADSC 显着增强了这些细胞在体内的活力和功能27。再生医学需要足够数量的细胞来有效修复组织28.在 3D 细胞培养中，与二维细胞培养相比，ADSC 的增殖速率较慢6。然而，PBM 可用于通过增强活力、增殖、迁移和分化来增强 ADSC 的 3D 细胞培养过程29,30。
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Protocol
注意：有关本协议中使用的所有材料、试剂和软件的详细信息 ，请参阅材料表 。该协议已在 图 1 中以图形方式总结。
1. 二维（2D）细胞培养
注意：永生化的ADSC（1x106 个细胞）在-195.8°C的液氮中储存在含有1mL细胞冷冻培养基的冷冻保存瓶中。
- 制备2D细胞回收培养基和2D培养瓶
- 将 39 mL 基础培养基转移到 50 mL 离心管中
- 用 20% 胎牛血清 （FBS;10 mL） 和抗生素 （1 mL）（0.5 mL 青霉素-链霉素和 0.5 mL 两性霉素 B）富集基础培养基。
- 通过将 6 mL 细胞回收培养基转移到培养瓶中来预处理 T75 培养瓶，并在 37 °C、5% CO2 和 85% 湿度下孵育 45 分钟（这可以在执行细胞回收步骤时完成以节省时间）。
注意：使用前将整个培养基加热至37°C，并将其储存在4°C下最多1周。
- 2D细胞回收
- 从液氮储罐中取出冷冻管，并在37°C的水浴中快速解冻小瓶，直至完全解冻。
- 使用离心机在1006× g 下旋转冷冻管5分钟（20°C），然后除去上清液。
- 使用 1 mL 预热的细胞回收培养基重悬沉淀细胞。
- 将悬浮细胞均匀分布在预调节的烧瓶（终体积为7mL）中，并在37°C，5%CO2和85%湿度下孵育。
- 24小时后，弃去并更换细胞回收培养基。
- 每 2-3 天更换一次培养基，直到培养瓶与细胞汇合。
- 在单细胞悬液中收获 2D 培养瓶和细胞计数
- 从培养箱中取出2D培养瓶，并将培养基倒入适当的废物容器中。
- 将 10 mL 漂洗液转移到烧瓶中以冲洗细胞并去除废物和蛋白质堆积。之后，丢弃漂洗液。
- 向培养瓶中加入 6 mL 分离溶液以分离细胞。将烧瓶在37°C，5%CO2和85%湿度下孵育2分钟。
注意：在显微镜下观察烧瓶以确认所有细胞都已分离。如果没有，轻轻敲击烧瓶并再孵育一分钟。 - 分离所有细胞后，将细胞悬液转移到 15 mL 离心管中，并向管中加入 1 mL 细胞回收培养基（含有 20% FBS）。这将中和分离溶液的作用。
- 将管在1711×g（20°C）下离心5分钟。
- 取出上清液并将细胞重悬于 1 mL 完全培养基中。
- 取出 10 μL 细胞悬液，将其放入 500 μL 微量离心管中，并以 1：1 的比例与 10 μL 台盼蓝混合。
- 将 10 μL 台盼蓝细胞溶液混合物一式两份放入细胞计数室中。
- 将细胞计数室放入自动细胞计数器中。细胞计数器将指示每 mL 的细胞总数以及活细胞和死细胞的数量。计算平均活细胞计数和需要嵌入 3D 水凝胶中的活细胞数（步骤 2.2.6）。
2. 3D细胞培养
- 制备3D完整培养基
- 将 44 mL 基础培养基转移到 50 mL 离心管中。
- 用 10% FBS （5 mL） 和抗生素 （1 mL）（0.5 mL 青霉素-链霉素和 0.5 mL 两性霉素 B）富集培养基。
注意：使用前将整个培养基加热至37°C，并在4°C下储存最多一周。
- 制备水凝胶
- 通过离心（1000× g 在20°C下30秒）快速葡聚糖小瓶来制备快速葡聚糖以浓缩材料。向快速葡聚糖小瓶中加入 175 μL 水，以达到 30 mmol/L 反应性基团的最终浓度。
- 涡旋含有快旋葡聚糖溶液的管子（中速30秒），直到材料完全溶解。将溶解的材料在冰上孵育5分钟。离心试管，短暂涡旋，并在进一步使用时将其保持在冰上。
- 离心交联剂（1000× g 在20°C下30秒）以浓缩材料。向交联剂小瓶中加入 188 μL 水，以达到 20 mmol/L 硫醇基团的终浓度。
- 涡旋含有交联剂溶液的试管（中速30秒），直到所有材料溶解。将溶解的交联剂在室温（RT）下孵育5分钟。离心管，短暂涡旋，并在进一步使用时将其保持在室温。
- 将水凝胶方案从 30 μL 调整为 10 μL 以降低成本（具体细节见 表 1 ）。
- 制备细胞悬液，使接种密度达到每 10 μL 水凝胶 2.5 x 103 个细胞。
- 根据 表 1 组合组分以创建预混液。将 9 μL 预混液转移到 96 孔条板中的孔中。
- 在转移预混液后 3 分钟加入 1 μL 可降解交联剂固化凝胶。
- 用 170 μL 预热的完全培养基覆盖水凝胶。孵育1小时。1小时后，更换培养基。
注意：水凝胶包埋的细胞已准备好在3D培养系统中进行进一步的实验或分析。根据下游应用的需要遵循其他协议。
3. 光生物调节暴露
- 设置激光器
- 设置绿光 （525 nm） 或近红外 （825 nm） 波长的二极管激光系统。打开激光器并让它们在推荐的时间内预热。
- 通过允许激光器达到稳定状态来稳定激光器的功率输出。这确保了一致和准确的辐照。
- 使用激光功率计测量激光器的功率输出。记录每个波长的功率值。
- 使用公式 1（激光照射时间）计算激光照射时间。将 表 2 中的值代入公式 1，以确定每种流利度的适当照射时间。在公式 1 中，“r”表示激光照射区的半径。
等式 1 - 有关计算所需的具体参数，请参阅 表 2 ，包括流通度（5 J/cm² 或 10 J/cm²）和激光功率输出。
- 辐照 3D 细胞培养物
- 更换完整培养基（步骤2.2.9）后，将含有水凝胶包埋电池的96孔板置于二极管激光系统下。在所选波长（绿色或近红外）下，用所选流畅度（5 J / cm²或10 J / cm²）计算的激光照射时间照射水凝胶。因此，培养物将只接受单剂量。
- 确保每个实验组都附有一个对照（n = 4），该对照由嵌入水凝胶中的ADSC组成，没有PBM暴露。
注意： 始终佩戴适合您正在使用的光波长的安全眼镜。激光器在安全柜外使用;因此，在使用前对该区域进行消毒至关重要。 - 在实验期间，将培养板在37°C，5%CO2和85%湿度下孵育。辐照后，将板孵育24小时进行第一次分析，或将板孵育10天进行第二次分析。
4. 形态学
- 倒置光学显微镜
- 打开倒置光学显微镜，让它预热几分钟。确保显微镜正确对准和校准。
- 根据实验设置，准备样品在显微镜载玻片或专用细胞培养皿上观察。校准显微镜以获得最佳成像条件。
- 根据需要调整焦点、亮度和对比度设置。在显微镜上选择20倍物镜，用于观察和记录细胞形态。
- 将样品放在显微镜载物台上，并使用目镜聚焦在感兴趣的细胞上。使用目镜或相机视图，观察并记录细胞形态。注意细胞形状、大小和任何显着特征。
- 将相机模块连接到显微镜。设置相机进行数字成像。确保相机和显微镜之间的正确连接和通信。
- 使用20倍物镜，捕获观察到的细胞的数字图片。使用相机控制来调整曝光、对焦和其他相关设置。
注意：确保捕获的图像是高质量的，并提供细胞形态的代表性视图。 - 在计算机上启动成像软件。捕获图像并使用软件中的分析工具来分析细胞形态。
- 测量细胞尺寸，计数细胞，或根据实验目标进行任何相关分析。
- 使用该软件为图像添加适当的比例尺。使用显微镜物镜的已知放大倍率来准确表示图像的比例。
5. 生化检测
- 细胞回收
注意：需要从单细胞悬浮液中的水凝胶中回收细胞，以进行进一步的下游生化测定。- 制备酶促细胞回收溶液。在无菌环境中，通过用磷酸盐缓冲盐水（PBS）以1：20的比例稀释酶细胞回收溶液来制备工作溶液（溶液：PBS）。如果需要从特定数量的凝胶或孔中回收细胞，请根据每块凝胶 30 μL 的回收溶液计算所需的总体积。
- 向每个凝胶或含有需要回收的细胞的孔中加入 30 μL 工作溶液。通过轻轻摇晃或旋转板来确保回收溶液的彻底和均匀分布。根据推荐的孵育时间将板与回收溶液一起孵育。这些信息通常可以在供应商提供的产品数据表或实验方案中找到。
- 孵育期过后，小心地将板从培养箱中取出。将板以1409× g 离心5分钟（20°C）以沉淀细胞。有关推荐的离心条件，请参阅产品数据表或实验方案。离心完成后，小心地丢弃上清液，注意不要干扰细胞沉淀。
- 轻轻地将沉淀的细胞重悬于220μL无菌PBS中。确保充分混合，以获得均匀的单细胞悬浮液。这些细胞现在已准备好进行下游生化检测。考虑到回收细胞的性质和实验设置的要求，遵循预期测定的特定方案。
- 乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性测定
- 对于每个孔，小心地除去 50 μL 完全培养基，确保对细胞层的干扰最小。
- 将 50 μL 细胞毒性试剂直接加入到含有剩余 50 μL 培养基的每个孔中。通过上下移液轻轻混合，以确保样品与试剂充分混合。
- 准备阳性对照。每试剂盒中包含的每 50 μL 阳性对照细胞中含有 5 μL 10x 裂解溶液，设置一式三份孔。
- 在推荐的温度和持续时间下孵育板。该步骤允许细胞毒性试剂裂解细胞并将 LDH 释放到培养基中。
- 孵育期后，将 50 μL 终止液直接加入到含有细胞毒性试剂和细胞裂解物的每个孔中。通过上下移液轻轻混合，以确保反应正确停止。
注意： 终止溶液可阻止 LDH 的进一步释放并确保显色的稳定性。 - 根据制造商的说明设置分光光度法酶标仪。记录每个孔在490nm处的吸光度。该波长特异于对LDH反应产生的甲甒产物进行比色检测。
- 从治疗组和对照孔中减去背景吸光度读数。从含有培养基和不含细胞的细胞毒性试剂的孔中获取背景读数。
- 分析每个样品的校正吸光度值以确定细胞毒性水平。吸光度值越高，表明 LDH 释放增加，因此细胞毒性越高。
- 确保每个实验组和对照由四个重复（步骤3.2.2）组成，以确保统计准确性。计算每组的平均吸光度并将其导入到适当的统计程序中。
- 比较治疗组和适当对照组之间的结果，以准确评估细胞毒性作用，并记录所有吸光度读数、计算和实验条件以备将来参考。
- ATP增殖试验
- 在无菌环境中，将 50 μL 回收的细胞与每个孔中的 50 μL ATP 试剂混合。
注意：根据孔数和实验设计调整细胞和试剂的体积。保持一致的比率以获得准确的结果。 - 将板放在摇床上，在黑暗中剧烈摇晃 5 分钟。此步骤可确保细胞与试剂充分混合。振荡后，将板在室温下再孵育25分钟。该孵育期允许试剂裂解细胞并产生与存在的 ATP 量成正比的发光信号。
- 根据制造商的发光检测说明设置读板器。测量含有细胞裂解物和ATP试剂的每个孔的发光。确保将酶标仪设置为使用适当的设置测量发光。
- 从处理组和对照孔中减去背景发光读数。从仅含有 ATP 试剂和不含细胞的 PBS 的孔中获取背景读数。
- 分析每个样品的校正发光值以确定 ATP 水平，反映细胞增殖或活力。
- 确保每个实验组和对照由四个重复（步骤3.2.2）组成，以确保统计准确性。计算每组的平均发光并将其导入到适当的统计程序中。
- 比较治疗组和相关对照组之间的结果，以准确评估 ATP 增殖。记录所有发光读数、计算和实验条件以备将来参考。
注意：对于试剂盒形式的所有生化分析，请遵循试剂盒的手册或制造商提供的方案，了解具体细节，例如推荐的孵育时间、浓度以及任何其他步骤或注意事项。在处理化学品和生物材料时，请始终遵守实验室安全准则。
- 在无菌环境中，将 50 μL 回收的细胞与每个孔中的 50 μL ATP 试剂混合。
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Representative Results
为了评估水凝胶的形态并目视检查细胞密度，使用反向显微镜（图2）。ADSCs在接种和PBM暴露后24小时保持圆形形态。这些细胞以单个细胞或葡萄状簇的形式散布在整个凝胶中。3D培养10天后形态无变化。实验组和对照组之间或不同实验组之间在形态学上没有明确的差异。
为了评估PBM暴露和使用水凝胶进行3D培养的细胞毒性作用，测量了LDH泄漏（图3）。实验组和对照组在24 h或10 d时无显著差异，表明PBM暴露和水凝胶培养对细胞无不利影响。
通过测量ADSC的ATP含量来测量细胞增殖速率（图4）。与对照组相比，PBM暴露导致所有实验组的增殖率增加。在PBM暴露后24小时，525nm波长刺激最高的增殖速率。然而，在 10 天时，与 525 nm 波长相比，825 nm 波长显示出更高的增殖速率。 在10 d培养期结束时，825 nm，10 J/cm2 组的增殖速率最高。
图 1：协议概述。 总结方案重点介绍了在 96 孔板中制备水凝胶、PBM 暴露以及 PBM 暴露后 24 小时和 10 天形态学和生化测定的测量。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：播种后自聚集的 ADSC。 细胞保留圆形至椭圆形形态，并在接种和PBM暴露后（A）24小时和（B）10天以单细胞或聚集体的形式分布在水凝胶中，具有葡萄状簇状外观。孵育 10 天后未观察到明确变化。使用对照（1 和 4），分别在 5 J/cm2 （2） 和 10 J/cm2 （5） 处为 525 nm，在 5 J/cm2 （3） 和 10 J/cm2 （6） 处为 825 nm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：在水凝胶中使用 525 nm 和 825 nm 二极管（5 J/cm2 和 10 J/cm2）测量 PBM 暴露后 24 小时和 10 天细胞毒性的细胞 LDH 泄漏。 与实验对照相比，未观察到细胞毒性显着增加。阳性对照代表细胞完全死亡。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：在水凝胶中使用 525 nm 和 825 nm 二极管（5 J/cm2 和 10 J/cm2）测量 PBM 暴露后 24 小时和 10 天的增殖量。 PBM暴露刺激了所有实验组在两个时间点和两个流利度的增殖速率增加。显著差异（P < 0.001）用***表示。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 元件 | 每孔体积 （μL） |
| SLO-葡聚糖聚合物（30 mmol/L） | 0.7 |
| 细胞悬液 | 2 |
| 缓冲区 | 0.8 |
| 水 | 5.5 |
| 交联剂 | 1 |
| 总体积 | 10 |
表 1：水凝胶 （10 μL） 试剂体积。
| 激光器参数 | 绿色 （G） | 近红外 （NIR） |
| 光源 | 二极管激光器 | 二极管激光器 |
| 波长 （nm） | 525 | 825 |
| 功率输出 （mW） | 553 | 515 |
| 功率密度 （mW/cm2） | 57.48 | 53.53 |
表 2：激光参数。
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Discussion
ADSC是用于再生医学的理想细胞类型，因为它们会刺激各种过程以帮助伤口愈合3,4。然而，有几个挑战需要规避，例如，存活率低和细胞在损伤部位的植入无效9.永生化细胞被用作市售细胞系，因为与原代细胞相比，它们可以传代更多代，不需要收获，表征良好，并且是同质群体，确保结果一致31。本研究的目的是使用 3D 细胞培养确定 PBM 对 ADSC 增殖和细胞毒性的增强潜力。制造商对 30 μL 水凝胶的方案已调整为 10 μL 以节省成本32。然而，这种体积的减少使得凝胶的制备和处理更加困难。
ADSC已被证明可以在3D环境中自聚集33。同样，在这项研究中，细胞形成了具有葡萄状外观的细胞聚集体。然而，也鉴定出单产细胞。细胞脱落是球状体的已知特性，其中细胞与主球体或聚集体分离并释放到培养环境中。细胞脱落可由细胞增殖引起，其中活细胞在有丝分裂期间脱落并允许迁移34。或者，由于细胞死亡和球状体或聚集体形状35 的丧失，可能导致脱落，尤其是在由于坏死核心生长而导致的非常大的球体中。与2D培养物中的纺锤体形状相比，细胞在3D培养中采用圆形形态。与类似研究的结果一致，这些结果是由于细胞粘附在6,9上缺乏附着位点或细胞外基质。此外，细胞在凝胶中没有显示出明显的迁移，进一步暗示需要附着位点36。建议添加粘附肽或其他细胞外基质蛋白，以促进附着、粘附和迁移。该研究的一个局限性是使用逆光显微镜来观察ADSC的3D形态，而不是Z堆叠。PBM 暴露和 3D 培养对暴露后 24 h 和 10 d 时 ADSC 的细胞毒性均无显著影响，表明水凝胶培养和 PBM 是安全的，对细胞没有负面影响 6,26。在 3D 细胞培养中，与 2D 细胞培养相比，ADSC 的增殖速率较慢。当前研究中正常对照的低增殖率支持了这一点 6.PBM（525 nm 和 825 nm）显著提高了 ADSC 在 3D 培养物中的增殖速率。最初，与近红外光（825 nm）相比，5 J/cm2和10 J/cm2流利度的绿光（525 nm）引起的增殖速率最高。然而，在 10 天标记处，近红外光 （825 nm） 在 5 J/cm2 和 10 J/cm2 的波动度下具有最高的增殖速率。同样，PBM（525 nm 和 825 nm）已被证明可以提高 2D 培养物的增殖速率37。建议还包括一个波长组合组，因为其他研究已经报道了绿光和近红外光的协同作用。
总之，所使用的水凝胶是一种合成水凝胶，具有巨大的定制能力，可以满足各种应用的需求。目前的研究表明，该凝胶在 10 天内对培养中的细胞没有细胞毒性作用。此外，尽管处于 3D 培养环境中，PBM 通过显着上调 ADSC 的增殖速率表现出积极的增强潜力。因此，这种水凝胶可以作为移植到伤口中的可能的生物材料载体。未来的研究应旨在通过动物研究测试凝胶帮助伤口愈合的潜在能力。如果动物试验结果良好，则可以设想在移植到伤口之前，可以收获、封装和增强患者来源的 ADSC，并用 PBM 增强，以帮助临床应用中的伤口愈合。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
这项研究由南非国家研究基金会 Thuthuka Instrument 资助，资助号为 TTK2205035996;科学与创新部 （DSI） 资助的非洲激光中心 （ALC），拨款编号HLHA23X任务 ALC-R007;大学研究委员会，资助号 2022URC00513;科学技术部的南非研究主席计划（DST-NRF/SARChI），批准号98337。资助机构在研究设计、收集、分析、数据解释或撰写手稿方面没有发挥任何作用。作者感谢约翰内斯堡大学（UJ）和激光研究中心（LRC）使用这些设施和资源。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 525 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | EN 60825-1:2007 | |
| 825 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | SN 101080908ADR-1800 | |
| 96 Well Strip Plates | Sigma-Aldrich | BR782301 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | ATP reagent, Proliferation assay Kit |
| Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430659 | cryovial |
| CryoSOfree | Sigma-Aldrich | C9249 | Cell freezing media |
| CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | Cytotoxicity reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Media | Sigma-Aldrich | D5796 | Basal medium (39 mL/44 mL) |
| FieldMate Laser Power Meter | Coherent | 1098297 | |
| Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate | Sigma-Aldrich | CLS3370 | |
| Foetal bovine serum | Biochrom | S0615 | Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%) |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | Rinse solution |
| Heracell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51026280 | |
| Heraeus Labofuge 400 | Thermo Scientific | 75008371 | Plate spinner for 96 well plates |
| Heraeus Megafuge 16R centrifuge | ThermoFisher | 75004270 | |
| Immortalized ADSCs | ATCC | ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 | Passage 37 |
| Invitrogen Countess 3 | Invitrogen | AMQAX2000 | Automated cell counter for Trypan Blue |
| Julabo TW20 waterbath | Sigma-Aldrich | Z615501 | Waterbath used to warm media to 37 °C |
| Olympus CellSens Entry | Olympus | Version 3.2 (23706) | Imaging software: digital image acquisition |
| Olympus CKX41 | Olympus | SN9B02019 | Inverted light microscope |
| Olympus SC30 camera | Olympus | SN57000530 | Camera attached to inverted light microscope |
| Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates | Sigma-Aldrich | CLS3912 | Opaque well used for ATP luminescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| SigmaPlot 12.0 | Systat Software Incorporated | ||
| TrueGel3D – True3 | Sigma-Aldrich | TRUE3-1KT | 10 µL |
| TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution | Sigma-Aldrich | TRUEENZ | 01:20 |
| Trypan Blue Stain | Thermo Fisher - Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Gibco | 12563029 | Cell detachment solution |
| Victor Nivo Plate Reader | Perkin Elmer | HH3522019094 | Spectrophotometric plate reader |
References
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