Summary
Här presenterar vi ett protokoll som demonstrerar användningen av hydrogel som ett tredimensionellt (3D) cellodlingsramverk för fetthärledd stamcellsodling (ADSC) och introducerar fotobiomodulering (PBM) för att förbättra spridningen av ADSC inom 3D-odlingsmiljön.
Abstract
Fetthärledda stamceller (ADSC), som har multipotenta mesenkymala egenskaper som liknar stamceller, används ofta inom regenerativ medicin på grund av deras förmåga till ett brett spektrum av celldifferentiering och deras förmåga att förbättra migration, proliferation och mildra inflammation. ADSC står dock ofta inför utmaningar när det gäller överlevnad och ingrepp i sår, främst på grund av ogynnsamma inflammatoriska tillstånd. För att ta itu med detta problem har hydrogeler utvecklats för att upprätthålla ADSC-livskraften i sår och påskynda sårläkningsprocessen. Här syftade vi till att bedöma den synergistiska effekten av fotobiomodulering (PBM) på ADSC-proliferation och cytotoxicitet inom ett 3D-cellodlingsramverk. Odödliga ADSC såddes in i 10 μL hydrogeler med en densitet av 2,5 x 103 celler och utsattes för bestrålning med 525 nm och 825 nm dioder vid fluenser på 5 J/cm2 och 10 J/cm2. Morfologiska förändringar, cytotoxicitet och proliferation utvärderades 24 timmar och 10 dagar efter PBM-exponering. ADSC:erna uppvisade en rundad morfologi och var spridda i gelen som enskilda celler eller sfäroidaggregat. Det är viktigt att notera att både PBM och 3D-odlingsramverket inte visade några cytotoxiska effekter på cellerna, medan PBM signifikant förbättrade proliferationshastigheten för ADSC. Sammanfattningsvis visar denna studie användningen av hydrogel som en lämplig 3D-miljö för ADSC-odling och introducerar PBM som en betydande förstärkningsstrategi, särskilt för att ta itu med de långsamma proliferationshastigheterna i samband med 3D-cellodling.
Introduction
ADSC är mesenkymala multipotenta stamceller med kapacitet att förnya sig själva och differentiera till flera cellinjer. Dessa celler kan skördas från den stromala vaskulära fraktionen (SVF) av fettvävnad under en lipoaspirationsprocedur1. ADSC har visat sig vara en idealisk stamcellstyp att använda inom regenerativ medicin eftersom dessa celler är rikliga, minimalt invasiva att skörda, lättillgängliga och väl karakteriserade2. Stamcellsterapi erbjuder en möjlig väg för sårläkning genom att stimulera cellmigration, proliferation, neovaskularisering och minska inflammation i sår 3,4. Ungefär 80 % av den regenerativa kapaciteten hos ADSC kan hänföras till parakrin signalering via deras sekretom5. Tidigare har det föreslagits att en direkt lokal injektion av stamceller eller tillväxtfaktorer i skadad vävnad skulle kunna leda till tillräckliga in vivo-reparationsmekanismer 6,7,8. Detta tillvägagångssätt stod dock inför flera utmaningar, såsom dålig överlevnad och minskad stamcellsingrepp i skadade vävnader som ett resultat av den inflammatoriska miljön 9. Dessutom var en av de angivna orsakerna att det saknades en extracellulär matris för att stödja överlevnaden och funktionaliteten hos de transplanterade cellerna10. För att övervinna dessa utmaningar läggs nu tonvikten på utveckling av biomaterialbärare för att stödja stamcellernas livskraft och funktion.
Tredimensionell (3D) cellodling förbättrar cell-till-cell- och cell-till-matris-interaktionen in vitro för att ge en miljö som bättre liknar in vivo-miljön 11. Hydrogeler har studerats utförligt som en klass av biomaterialbärare som ger en 3D-miljö för stamcellsodling. Dessa strukturer är gjorda av vatten och tvärbundna polymerer12. Inkapsling av ADSC i hydrogel har praktiskt taget ingen cytotoxisk effekt på cellerna under odling samtidigt som cellernas livskraft bibehålls6. Stamceller odlade i 3D visar ökad retention av deras stam och förbättrad differentieringsförmåga13. På liknande sätt visade hydrogelfröade ADSC:er ökad viabilitet och snabbare sårförslutning i djurmodeller14. Dessutom ökar hydrogelinkapsling signifikant engraftment och retention av ADSC i sår15,16. TrueGel3D är tillverkad av en polymer, antingen polyvinylalkohol eller dextran, stelnad av en tvärbindare, antingen cyklodextrin eller polyetylenglykol17. Gelen är en syntetisk hydrogel som inte innehåller några animaliska produkter som kan störa experimenten eller utlösa en immunreaktion under transplantationen av gelen till en patient samtidigt som den effektivt efterliknar en extracellulär matris18. Gelen är helt anpassningsbar genom att ändra sammansättningen och enskilda komponenter. Den kan hysa olika stamceller och stödja differentieringen av flera celltyper genom att justera styvheten hos gel19. Fästställen kan skapas genom tillsats av peptider20. Gelen är nedbrytbar genom utsöndring av metalloproteaser, vilket möjliggör cellmigration21. Slutligen är det tydligt och möjliggör avbildningstekniker.
PBM är en minimalinvasiv och lättarbetad form av lågnivålaserterapi som används för att stimulera intracellulära kromoforer. Olika våglängder framkallar olika effekter på celler22. Ljus i det röda till nära infraröda området stimulerar ökad produktion av adenosintrifosfat (ATP) och reaktiva syreradikaler (ROS) genom att öka flödet genom elektrontransportkedjan23. Ljus i de blå och gröna områdena stimulerar ljusstyrda jonkanaler, vilket möjliggör ett icke-specifikt inflöde av katjoner, såsom kalcium och magnesium, i cellerna, vilket är känt för att förbättra differentieringen24. Nettoeffekten är generering av sekundära budbärare som stimulerar transkriptionen av faktorer som utlöser nedströms cellulära processer såsom migration, proliferation och differentiering25. PBM kan användas för att förkonditionera celler så att de förökar sig eller differentieras innan cellerna transplanteras till en ogynnsam miljö, t.ex. skadad vävnad26. Exponering av ADSC före och efter transplantation (630 nm och 810 nm) förbättrade signifikant dessa cellers livskraft och funktion in vivo i en diabetisk råttmodell27. Regenerativ medicin kräver ett tillräckligt antal celler för effektiv reparation av vävnader28. I 3D-cellodling har ADSC associerats med långsammare proliferationshastigheter jämfört med tvådimensionell cellodling6. PBM kan dock användas för att förstärka 3D-cellodlingsprocessen för ADSC:er genom att förbättra viabilitet, proliferation, migration och differentiering29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material, reagenser och programvara som används i detta protokoll. Protokollet har sammanfattats grafiskt i figur 1.
1. Tvådimensionell (2D) cellodling
ANM.: Odödliga ADSC (1 x 106 celler) förvaras vid -195,8 °C i flytande kväve i en kryokonserveringsflaska som innehåller 1 ml cellfrysmedel.
- Beredning av 2D-cellåtervinningsmediet och 2D-odlingskolven
- Överför 39 ml av basalmediet till ett 50 ml centrifugrör
- Berika basalmediet med 20 % fetalt bovint serum (FBS; 10 ml) och antibiotika (1 ml) (0,5 ml penicillin-streptomycin och 0,5 ml amfotericin B).
- Förkonditionera en T75-kolv genom att överföra 6 ml av cellåtervinningsmediet till kolven och inkubera den vid 37 °C, 5 % CO 2 och 85 % luftfuktighet i 45 minuter (detta kan göras medan du utför cellåterställningsstegen för att spara tid).
OBS: Värm hela mediet till 37 °C före användning och förvara det vid 4 °C i högst 1 vecka.
- Återvinning av 2D-celler
- Ta bort en kryovial från förvaringstanken för flytande kväve och tina snabbt injektionsflaskan i ett vattenbad vid 37 °C tills den är helt upptinad.
- Centrifugera kryovialen med en centrifug vid 1006 x g i 5 minuter (20 °C) och avlägsna därefter supernatanten.
- Återsuspendera de pelleterade cellerna med 1 ml förvärmt cellåtervinningsmedium.
- Fördela de suspenderade cellerna jämnt i den förkonditionerade kolven (slutlig volym 7 ml) och inkubera vid 37 °C, 5 % CO 2 och 85 % luftfuktighet.
- Efter 24 timmar, kassera och byt ut cellåtervinningsmediet.
- Byt ut odlingsmediet var 2-3:e dag tills kolven blir sammanflytande med celler.
- Skörd av 2D-odlingskolv i encellssuspension och celltal
- Ta ut 2D-odlingskolven ur inkubatorn och kassera odlingsmediet i en lämplig avfallsbehållare.
- Överför 10 ml sköljlösning till kolven för att skölja cellerna och avlägsna avfall och proteinansamlingar. Kassera sedan sköljlösningen.
- Tillsätt 6 ml lösgörande lösning till odlingskolven för att lossa cellerna. Inkubera kolven vid 37 °C, 5 % CO2 och 85 % luftfuktighet i 2 min.
OBS: Observera kolven under ett mikroskop för att bekräfta att alla celler har lossnat. Om inte, knacka försiktigt på kolven och inkubera i ytterligare en minut. - När alla celler har lossnat, överför cellsuspensionen till ett 15 ml centrifugrör och tillsätt 1 ml av cellåtervinningsmediet (innehållande 20 % FBS) till röret. Detta kommer att neutralisera effekten av lösgörande lösningen.
- Centrifugera röret i 5 minuter vid 1711 x g (20 °C).
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml komplett substrat.
- Ta bort 10 μl av cellsuspensionen, placera den i ett 500 μL mikrocentrifugrör och blanda den med 10 μL trypanblått i förhållandet 1:1.
- Placera 10 μl av trypanlösningen av de blå blodkropparna i en cellräkningskammare i två exemplar.
- Placera cellräkningskammaren i den automatiska cellräknaren. Cellräknaren kommer att indikera det totala antalet celler per ml samt antalet livskraftiga och döda celler. Beräkna det genomsnittliga antalet livsdugliga celler och antalet livsdugliga celler som behövs för att bäddas in i 3D-hydrogelen (steg 2.2.6).
2. 3D cellodling
- Förberedelse av det kompletta 3D-odlingsmediet
- Överför 44 ml av basalmediet till ett 50 ml centrifugrör.
- Berika mediet med 10 % FBS (5 ml) och antibiotika (1 ml) (0,5 ml penicillin-streptomycin och 0,5 ml amfotericin B).
OBS: Värm hela mediet till 37 °C före användning och förvara det vid 4 °C i högst en vecka.
- Förberedelse av hydrogelen
- Bered fastedextran genom centrifugering (1000 x g i 30 s vid 20 °C) av injektionsflaskan med fast-dextran för att koncentrera materialet. Tillsätt 175 μl vatten till injektionsflaskan med snabbt dextran för att uppnå en slutlig koncentration på 30 mmol/l reaktiva grupper.
- Virvla röret (medelhastighet i 30 s) som innehåller den snabba dextranlösningen tills materialet är helt upplöst. Inkubera det upplösta materialet på is i 5 minuter. Centrifugera röret, virvla det kort och håll det på is under vidare användning.
- Centrifugera tvärbindaren (1000 x g i 30 s vid 20 °C) för att koncentrera materialet. Tillsätt 188 μl vatten till tvärbindarflaskan för att uppnå en slutlig koncentration på 20 mmol/l tiolgrupper.
- Virvla röret (medelhastighet i 30 s) som innehåller tvärbindarlösningen tills allt material är upplöst. Inkubera den upplösta tvärbindaren i rumstemperatur (RT) i 5 minuter. Centrifugera röret, virvla kort och håll det vid RT under vidare användning.
- Anpassa hydrogelprotokollet från 30 μL till 10 μL för kostnadsminskning (se tabell 1 för specifika detaljer).
- Bered cellsuspensionen för att uppnå en sådddensitet på 2,5 x 103 celler per 10 μL hydrogel.
- Kombinera komponenterna enligt tabell 1 för att skapa en mastermix. Överför 9 μl av masterblandningen till en brunn i en stripplatta med 96 brunnar.
- Stelna gelén genom att tillsätta 1 μL av den nedbrytbara tvärbindaren 3 minuter efter att masterblandningen har överförts.
- Täck hydrogelerna med 170 μl förvärmda helodlingssubstrat. Inkubera i 1 timme. Byt ut odlingsmediet efter 1 timme.
OBS: De hydrogelinbäddade cellerna är redo för ytterligare experiment eller analys inom 3D-odlingssystemet. Följ ytterligare protokoll efter behov för underordnade program.
3. Exponering för fotobiomodulering
- Ställa in lasern
- Ställ in diodlasersystemet för antingen gröna (525 nm) eller nära infraröda (825 nm) våglängder. Slå på lasrarna och låt dem värmas upp under den rekommenderade tiden.
- Stabilisera lasrarnas uteffekt genom att låta dem nå ett stabilt tillstånd. Detta säkerställer konsekvent och exakt bestrålning.
- Mät laserns uteffekt med hjälp av en lasereffektmätare. Anteckna effektvärdena för varje våglängd.
- Använd ekvation 1 ( Laserbestrålningstid) för att beräkna laserbestrålningstiden. Ersätt värdena från tabell 2 med ekvation 1 för att bestämma lämplig bestrålningstid för varje flyt. I ekvation 1 representerar "r" radien för laserns bestrålningszon.
Ekvation 1 - Se tabell 2 för de specifika parametrar som behövs för beräkningen, inklusive fluenser (5 J/cm² eller 10 J/cm²) och lasereffekt.
- Bestrålning av 3D-cellkulturer
- Efter att ha bytt ut hela mediet (steg 2.2.9), placera 96-hålsplattan som innehåller hydrogelinbäddade celler under diodlasersystemet. Bestråla hydrogelerna med den beräknade laserbestrålningstiden för den valda fluensen (5 J/cm² eller 10 J/cm²) vid den valda våglängden (grön eller nära infraröd). Därför kommer kulturerna bara att få en enda dos.
- Se till att varje försöksgrupp åtföljs av en kontroll (n = 4) som består av ADSC inbäddade i hydrogel utan PBM-exponering.
OBS: Bär alltid skyddsglasögon som är lämpliga för den våglängd av ljus du arbetar med. Lasrarna används utanför ett säkerhetsskåp; Därför är det mycket viktigt att desinficera området före användning. - Inkubera odlingsplattorna vid 37 °C, 5 % CO2 och 85 % luftfuktighet under försöken. Inkubera plattorna i 24 timmar för den första analysen eller 10 dagar för den andra analysperioden, efter bestrålning.
4. Morfologi
- Inverterad ljusmikroskopi
- Slå på det inverterade ljusmikroskopet och låt det värmas upp i några minuter. Se till att mikroskopet är korrekt inriktat och kalibrerat.
- Förbered provet för observation på ett objektglas eller en specialiserad cellodlingsskål, beroende på experimentuppställningen. Kalibrera mikroskopet för optimala avbildningsförhållanden.
- Justera inställningarna för fokus, ljusstyrka och kontrast efter behov. Välj 20x objektivlinsen på mikroskopet för att observera och registrera cellmorfologi.
- Placera provet på mikroskopet stage och fokusera på cellerna av intresse med hjälp av okularet. Använd okularet eller kameran view, observera och registrera cellmorfologin. Var uppmärksam på cellform, storlek och eventuella särdrag.
- Fäst kameramodulen på mikroskopet. Ställ in kameran för digital bildbehandling. Säkerställ korrekt anslutning och kommunikation mellan kameran och mikroskopet.
- Använd 20x objektivlinsen för att ta digitala bilder av de observerade cellerna. Använd kamerakontrollerna för att justera exponering, fokus och andra relevanta inställningar.
OBS: Se till att de tagna bilderna är av hög kvalitet och ger en representativ bild av cellmorfologin. - Starta bildbehandlingsprogrammet på datorn. Ta bilden och använd analysverktygen i programvaran för att analysera cellmorfologi.
- Mät celldimensioner, räkna celler eller utför någon relevant analys baserat på de experimentella målen.
- Lägg till en lämplig skalstapel till bilderna med hjälp av programvaran. Använd den kända förstoringen av mikroskopobjektivet för att exakt representera bildernas skala.
5. Biokemiska analyser
- Cellåtervinning
OBS: Cellerna måste återvinnas från hydrogelen i en encellssuspension för ytterligare nedströms biokemiska analyser.- Bered den enzymatiska cellåtervinningslösningen. I en steril miljö, bered en arbetslösning genom att späda den enzymatiska cellåtervinningslösningen med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i förhållandet 1:20 (lösning: PBS). Om det krävs återvinning av celler från ett visst antal geler eller brunnar, beräkna den totala volym som krävs baserat på 30 μl återvinningslösning per gel.
- Tillsätt 30 μl av arbetslösningen till varje gel eller brunn som innehåller de celler som behöver återvinnas. Säkerställ en noggrann och jämn fördelning av återvinningslösningen genom att försiktigt gunga eller virvla plattan. Inkubera plattan med återvinningslösningen enligt den rekommenderade inkubationstiden. Denna information finns vanligtvis i produktdatabladet eller protokollet som tillhandahålls av leverantören.
- Efter inkubationstiden tar du försiktigt bort plattan från inkubatorn. Centrifugera plattorna vid 1409 x g i 5 minuter (20 °C) för att pelletera cellerna. Se produktens datablad eller protokoll för rekommenderade centrifugeringsförhållanden. När centrifugeringen är klar, kassera försiktigt supernatanten, var försiktig så att du inte stör cellpelleten.
- Återsuspendera försiktigt de pelleterade cellerna i 220 μL steril PBS. Säkerställ noggrann blandning för att uppnå en homogen encellssuspension. Cellerna är nu redo för nedströms biokemiska analyser. Följ de specifika protokollen för de avsedda analyserna, med hänsyn till de återvunna cellernas beskaffenhet och kraven för den experimentella uppställningen.
- Cytotoxicitetsanalys av laktatdehydrogenas (LDH)
- För varje brunn avlägsnas försiktigt 50 μL komplett odlingssubstrat för att säkerställa minimal störning av celskiktet.
- Tillsätt 50 μl av cytotoxicitetsreagenset direkt till varje brunn som innehåller de återstående 50 μl odlingssubstratet. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner för att säkerställa noggrann blandning av sample med reagensen.
- Förbered en positiv kontroll. Sätt upp tre brunnar med 5 μL 10x lyslösning per 50 μL positiva kontrollceller som ingår i satsen.
- Inkubera plattan vid rekommenderad temperatur och varaktighet. Detta steg gör det möjligt för cytotoxicitetsreagenset att lysera cellerna och frigöra LDH i odlingsmediet.
- Efter inkubationstiden tillsätts 50 μl av stopplösningen direkt till varje brunn som innehåller cytotoxicitetsreagenset och celllysatet. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner för att säkerställa att reaktionen stoppas ordentligt.
OBS: Stopplösningen stoppar ytterligare LDH-frisättning och säkerställer stabiliteten i färgutvecklingen. - Ställ in den spektrofotometriska plattläsaren enligt tillverkarens instruktioner. Registrera absorbansen för varje brunn vid 490 nm. Denna våglängd är specifik för den kolorimetriska detektionen av formazanprodukten som genereras av LDH-reaktionen.
- Subtrahera bakgrundsabsorbansavläsningar från både behandlingsgrupper och kontrollbrunnar. Få bakgrundsavläsningar från brunnar som innehåller media och cytotoxicitetsreagenser utan celler.
- Analysera de korrigerade absorbansvärdena för varje sample för att bestämma cytotoxicitetsnivån. Högre absorbansvärden indikerar ökad LDH-frisättning och därmed högre cytotoxicitet.
- Se till att varje försöksgrupp och kontroll består av fyra upprepningar (steg 3.2.2) för statistisk noggrannhet. Beräkna och importera den genomsnittliga absorbansen för varje grupp och kontroll till ett lämpligt statistiskt program.
- Jämför resultaten mellan behandlingsgrupper och lämpliga kontroller för att bedöma de cytotoxiska effekterna noggrant och registrera alla absorbansavläsningar, beräkningar och experimentella förhållanden för framtida referens.
- ATP-proliferationstest
- Blanda 50 μl av de återvunna cellerna med 50 μl av ATP-reagenset i varje brunn i steril miljö.
OBS: Justera volymen av celler och reagenser baserat på antalet brunnar och experimentell design. Upprätthåll konsekventa förhållanden för korrekta resultat. - Lägg tallriken på en shaker och skaka kraftigt i mörkret i 5 min. Detta steg säkerställer noggrann blandning av cellerna med reagensen. Efter omskakning, inkubera plattan i ytterligare 25 minuter vid RT. Denna inkubationstid gör det möjligt för reagenset att lysera cellerna och generera en luminescerande signal som är proportionell mot mängden ATP som finns.
- Ställ in plattläsaren enligt tillverkarens instruktioner för luminiscensdetektering. Mät luminiscensen från varje brunn som innehåller celllysatet och ATP-reagensen. Se till att plattläsaren är inställd på att mäta luminiscens med lämpliga inställningar.
- Subtrahera bakgrundsluminiscensavläsningar från både behandlingsgrupper och kontrollbrunnar. Få bakgrundsavläsningar från brunnar som endast innehåller ATP-reagenset och PBS utan celler.
- Analysera de korrigerade luminiscensvärdena för varje sample för att bestämma ATP-nivåer, som återspeglar cellproliferation eller viabilitet.
- Se till att varje försöksgrupp och kontroll består av fyra upprepningar (steg 3.2.2) för statistisk noggrannhet. Beräkna och importera den genomsnittliga luminiscensen för varje grupp och kontroll till ett lämpligt statistiskt program.
- Jämför resultaten mellan behandlingsgrupper och relevanta kontroller för att bedöma ATP-proliferation korrekt. Registrera alla luminiscensavläsningar, beräkningar och experimentella förhållanden för framtida referens.
OBS: För alla biokemiska analyser i kitform, följ satsens manual eller protokoll som tillhandahålls av tillverkaren för specifika detaljer, såsom rekommenderade inkubationstider, koncentrationer och eventuella ytterligare steg eller överväganden. Följ alltid laboratoriesäkerhetsriktlinjerna vid hantering av kemikalier och biologiska material.
- Blanda 50 μl av de återvunna cellerna med 50 μl av ATP-reagenset i varje brunn i steril miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bedöma morfologin och visuellt inspektera celldensiteten hos hydrogelerna användes inversmikroskopi (Figur 2). ADSC:erna behöll en rundad morfologi 24 timmar efter sådd och PBM-exponering. Cellerna var utspridda i gelen som enstaka celler eller i druvliknande kluster. Morfologin var oförändrad efter 10 dagar i 3D-kultur. Ingen definitiv skillnad i morfologi noterades mellan experimentgrupperna och kontrollgrupperna eller mellan de olika experimentgrupperna.
För att bedöma de cytotoxiska effekterna av PBM-exponering och 3D-odling med hydrogel mättes LDH-läckage (Figur 3). Det fanns inga signifikanta skillnader mellan experimentgrupperna och kontrollerna efter 24 timmar eller 10 dagar, vilket tyder på att PBM-exponering och hydrogelodling inte hade någon skadlig effekt på cellerna.
Cellulär proliferation mättes genom att mäta ATP-halten i ADSC (Figur 4). PBM-exponering resulterade i ökad spridningshastighet i alla experimentgrupper jämfört med kontrollerna. Vid 24 timmar efter PBM-exponering stimulerade våglängden 525 nm de högsta spridningshastigheterna. Men vid 10-dagarsstrecket visade 825 nm våglängden överlägsna proliferationshastigheter jämfört med 525 nm våglängden. I slutet av den 10 dagar långa odlingsperioden uppvisade gruppen 825 nm, 10 J/cm2 den högsta spridningshastigheten.
Bild 1: Översikt över protokollet. Sammanfattat protokoll som belyser beredningen av hydrogelen i 96 brunnsplattor, PBM-exponering och mätning av morfologi och biokemiska analyser 24 timmar och 10 dagar efter PBM-exponering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: ADSC:er självaggregerade efter seeding. Cellerna bibehöll en rund till oval morfologi och fördelades i hydrogelen som antingen enskilda celler eller aggregat med ett druvliknande klusterutseende vid (A) 24 timmar och (B) 10 dagar efter sådd och PBM-exponering. Ingen definitiv förändring observerades efter 10 dagars inkubation. Med hjälp av reglage (1 och 4), 525 nm vid 5 J/cm2 (2) och 10 J/cm2 (5) eller 825 nm vid 5 J/cm2 (3) respektive 10 J/cm2 (6). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Cellulärt LDH-läckage som ett mått på cytotoxicitet 24 timmar och 10 dagar efter PBM-exponering, med användning av en 525 nm och 825 nm diod (5 J/cm2 och 10 J/cm2) i hydrogelen. Ingen signifikant ökning av cytotoxicitet observerades jämfört med den experimentella kontrollen. Den positiva kontrollen var representativ för fullständig celldöd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Cellulär ATP som ett mått på proliferation 24 timmar och 10 dagar efter PBM-exponering, med användning av en 525 nm och 825 nm diod (5 J/cm2 och 10 J/cm2) i hydrogelen. PBM-exponering stimulerade ökad proliferationshastighet i alla experimentella grupper vid båda tidpunkterna och båda fluenserna. Signifikanta skillnader (P < 0,001) indikeras med ***. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Komponent | Volym (μL) per brunn |
| SLO-Dextran-polymer (30 mmol/L) | 0.7 |
| Cellsuspension | 2 |
| Buffert | 0.8 |
| Vatten | 5.5 |
| Tvärbindare | 1 |
| Total volym | 10 |
Tabell 1: Hydrogelreagensvolymer (10 μL).
| Laserparametrar | Grön (G) | Nära infrarött (NIR) |
| Ljuskälla | Diod Laser | Diod Laser |
| Våglängd (nm) | 525 | 825 |
| Uteffekt (mW) | 553 | 515 |
| Effekttäthet (mW/cm2) | 57.48 | 53.53 |
Tabell 2: Laserparametrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ADSC är en idealisk celltyp att använda för regenerativ medicin eftersom de stimulerar olika processer för att hjälpa till med sårläkning 3,4. Det finns dock flera utmaningar som måste kringgås, t.ex. dålig överlevnad och ineffektiv ingrepp av cellerna i ett skadeområde9. Odödliga celler användes som en kommersiellt tillgänglig cellinje, eftersom de kan passera i fler generationer jämfört med primära celler, de behöver inte skördas, är väl karakteriserade och är homogena populationer som säkerställer konsekventa resultat31. Syftet med denna studie var att bestämma den augmentativa potentialen hos PBM på proliferation och cytotoxicitet av ADSC, med hjälp av 3D-cellodling. Tillverkarens protokoll för en 30 μL hydrogel har anpassats till en 10 μL för att spara32 kostnader. Denna minskade volym gjorde dock beredningen och hanteringen av gelen svårare.
ADSC:er har visat sig aggregera sig själva i en 3D-miljö33. På samma sätt i denna studie bildade cellerna cellaggregat med ett druvliknande utseende. Men även enkelliggande celler identifierades. Cellutsöndring är en känd egenskap hos sfäroider där celler lossnar från huvudsfäroiden eller aggregatkroppen och släpps ut i odlingsmiljön. Cellutsöndring kan bero på cellulär proliferation, där livskraftiga celler utsöndras under mitos och möjliggör migration34. Alternativt kan utsöndring uppstå på grund av celldöd och förlust av sfäroid eller aggregatform35, särskilt i mycket stora sfäroider på grund av en växande nekrotisk kärna. Cellerna antog en rundad morfologi i 3D-kultur, jämfört med en spindelform i 2D-kulturer. I linje med resultaten från liknande studier beror dessa resultat på en brist på fästställen eller extracellulär matris för cellerna att fästa vid 6,9. Dessutom visade cellerna ingen signifikant migration i gelen, vilket ytterligare tyder på behovet av fästställen36. Det rekommenderas att lägga till en vidhäftningspeptid eller ett annat extracellulärt matrixprotein för att underlätta fäste, vidhäftning och migration. En begränsning i studien var användningen av invers ljusmikroskopi för att observera 3D-morfologin hos ADSC:erna istället för Z-stacking. PBM-exponering och 3D-odling hade ingen signifikant effekt på cytotoxiciteten hos ADSC varken 24 timmar eller 10 dagar efter exponering, vilket tyder på att hydrogelodling och PBM är säkra och inte har någon negativ inverkan på cellerna 6,26. I 3D-cellodling har ADSC associerats med långsammare proliferationshastigheter jämfört med 2D-cellodling. Detta stöds av den låga spridningstakten för de normala kontrollerna i den aktuella studien6. PBM (525 nm och 825 nm) ökade signifikant spridningshastigheten av ADSC i 3D-kultur. Initialt framkallade det gröna ljuset (525 nm) vid både 5 J/cm2 och 10 J/cm2 fluenser de högsta spridningshastigheterna jämfört med det nära infraröda ljuset (825 nm). Men vid 10-dagarsstrecket har det nära infraröda ljuset (825 nm) de högsta spridningshastigheterna vid både 5 J/cm2 och 10 J/cm2 fluenser. På liknande sätt har PBM (525 nm och 825 nm) visat sig öka spridningshastigheten i 2D-kulturer37. Det rekommenderas att även inkludera en våglängdskombinationsgrupp, eftersom andra studier har rapporterat en synergistisk effekt av grönt och nära-infrarött ljus.
Sammanfattningsvis är hydrogelen som används en syntetisk hydrogel med enorm anpassningskapacitet för att passa behoven hos olika applikationer. Den aktuella studien har visat att gelen inte har någon cytotoxisk effekt på celler i odling under en 10-dagarsperiod. Dessutom visade PBM en positiv förstärkningspotential genom att avsevärt uppreglera spridningshastigheten för ADSC, trots att de befann sig i en 3D-odlingsmiljö. Således kan denna hydrogel fungera som en möjlig bärare av biomaterial för transplantation i sår. Framtida undersökningar bör syfta till att testa gelens potentiella förmåga att hjälpa till med sårläkning med hjälp av djurstudier. Om resultaten från djurförsöken är gynnsamma, är det tänkt att patient-härledda ADSC:er kan skördas, kapslas in och förstärkas med PBM före transplantation i sår för att hjälpa till med sårläkning i kliniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna redovisar inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av National Research Foundation of South Africa Thuthuka Instrument, anslagsnummer TTK2205035996; Institutionen för vetenskap och innovation (DSI) finansierad African Laser Centre (ALC), anslagsnummer HLHA23X uppgift ALC-R007; universitetets forskningsråd, anslagsnummer 2022URC00513; Department of Science and Technology's South African Research Chairs Initiative (DST-NRF/SARChI), anslagsnummer 98337. Finansiärerna hade ingen roll i utformningen av studien, insamlingen, analysen, tolkningen av data eller skrivandet av manuskriptet. Författarna tackar University of Johannesburg (UJ) och Laser Research Centre (LRC) för deras användning av faciliteterna och resurserna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 525 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | EN 60825-1:2007 | |
| 825 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | SN 101080908ADR-1800 | |
| 96 Well Strip Plates | Sigma-Aldrich | BR782301 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | ATP reagent, Proliferation assay Kit |
| Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430659 | cryovial |
| CryoSOfree | Sigma-Aldrich | C9249 | Cell freezing media |
| CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | Cytotoxicity reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Media | Sigma-Aldrich | D5796 | Basal medium (39 mL/44 mL) |
| FieldMate Laser Power Meter | Coherent | 1098297 | |
| Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate | Sigma-Aldrich | CLS3370 | |
| Foetal bovine serum | Biochrom | S0615 | Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%) |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | Rinse solution |
| Heracell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51026280 | |
| Heraeus Labofuge 400 | Thermo Scientific | 75008371 | Plate spinner for 96 well plates |
| Heraeus Megafuge 16R centrifuge | ThermoFisher | 75004270 | |
| Immortalized ADSCs | ATCC | ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 | Passage 37 |
| Invitrogen Countess 3 | Invitrogen | AMQAX2000 | Automated cell counter for Trypan Blue |
| Julabo TW20 waterbath | Sigma-Aldrich | Z615501 | Waterbath used to warm media to 37 °C |
| Olympus CellSens Entry | Olympus | Version 3.2 (23706) | Imaging software: digital image acquisition |
| Olympus CKX41 | Olympus | SN9B02019 | Inverted light microscope |
| Olympus SC30 camera | Olympus | SN57000530 | Camera attached to inverted light microscope |
| Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates | Sigma-Aldrich | CLS3912 | Opaque well used for ATP luminescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| SigmaPlot 12.0 | Systat Software Incorporated | ||
| TrueGel3D – True3 | Sigma-Aldrich | TRUE3-1KT | 10 µL |
| TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution | Sigma-Aldrich | TRUEENZ | 01:20 |
| Trypan Blue Stain | Thermo Fisher - Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Gibco | 12563029 | Cell detachment solution |
| Victor Nivo Plate Reader | Perkin Elmer | HH3522019094 | Spectrophotometric plate reader |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. Burns Trauma. 10, (2022).
- Nilforoushzadeh, M. A., et al. Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).
- Yang, M., et al. Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).
- Chimenti, I., et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).
- Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid. Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32 (2013).
- Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart. The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Koivunotko, E., et al. Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel. Biomedicines. 10 (10), 2584 (2022).
- Dong, Y., et al. Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing. Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619 (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Sung, T. -C., et al. 3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities. J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).
- Garg, R. K., et al. Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing. Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).
- Dong, Y., et al. Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury. Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).
- Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d (2024).
- Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling. Int J Mol Sci. 23 (6), 3265 (2022).
- Mashinchian, O., et al. In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging. eLife. 11, e57393 (2022).
- Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice. Theriogenology. 183, 120-131 (2022).
- Marx, V. How some labs put more bio into biomaterials. Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).
- Marques, M. M.
- Hamblin, M. R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).
- Chen, J., et al. Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1. J Photochem Photobiol B. 233, 112472 (2022).
- Chang, S. -Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine. Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).
- Bikmulina, P. Y., et al. Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems. J Biomed Opt. 25 (4), 048001 (2020).
- Ahmadi, H., et al. Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494 (2020).
- Mao, A. S., Mooney, D. J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).
- De Andrade, A. L. M., et al. Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures. Lasers Med Sci. 38 (1), 221 (2023).
- Diniz, I. M., et al. Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering. J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).
- Carter, M., Shieh, J. C. Guide to Research Techniques in Neuroscience. , Elsevier, Academic Press. (2015).
- Lutolf, M. P., et al. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).
- Robledo, F., et al. Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70 (2023).
- Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth. J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).
- Bogacheva, M. S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations. Front Cell Dev Biol. 9, 726499 (2021).
- Chen, X., Thibeault, S. L. Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture. Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).
- Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors. Biochimie. 196, 225-233 (2022).
