Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המדגים את השימוש בהידרוג'ל כמסגרת תלת ממדית (3D) לתרבית תאי גזע שמקורם בשומן (ADSC) ומציגים פוטוביומודולציה (PBM) כדי להגביר את התפשטות ADSCs במסגרת התרבית התלת-ממדית.
Abstract
תאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs), בעלי תכונות מזנכימליות רב-עוצמה הדומות לתאי גזע, משמשים לעתים קרובות ברפואה רגנרטיבית בשל יכולתם למגוון רחב של התמיינות תאים ויכולתם להגביר את הנדידה, ההתרבות ולמתן דלקת. עם זאת, ADSCs לעתים קרובות להתמודד עם אתגרים בהישרדות וקליטה בתוך פצעים, בעיקר בשל תנאים דלקתיים שליליים. כדי לטפל בבעיה זו, הידרוג'לים פותחו כדי לשמור על כדאיות ADSC בפצעים ולזרז את תהליך ריפוי הפצע. כאן, שאפנו להעריך את ההשפעה הסינרגטית של פוטוביומודולציה (PBM) על התפשטות ADSC וציטוטוקסיות במסגרת תרבית תאים תלת-ממדית. ADSCs אימורטליים נזרעו לתוך הידרוג'לים של 10 μL בצפיפות של 2.5 x 103 תאים והיו נתונים לקרינה באמצעות דיודות 525 ננומטר ו 825 ננומטר בשטף של 5 J / cm2 ו 10 J / cm2. שינויים מורפולוגיים, ציטוטוקסיות והתפשטות הוערכו 24 שעות ו-10 ימים לאחר החשיפה ל-PBM. ה-ADSCs הציגו מורפולוגיה מעוגלת ופוזרו לאורך הג'ל כתאים בודדים או כאגרגטים ספרואידים. חשוב לציין, הן PBM והן מסגרת תרבית תלת-ממדית לא הציגו השפעות ציטוטוקסיות על התאים, בעוד PBM שיפר באופן משמעותי את שיעורי ההתרבות של ADSCs. לסיכום, מחקר זה מדגים את השימוש בהידרוג'ל כסביבה תלת-ממדית מתאימה לתרבית ADSC ומציג PBM כאסטרטגיית הגדלה משמעותית, במיוחד תוך התייחסות לקצב ההתרבות האיטי הקשור לתרבית תאים תלת-ממדית.
Introduction
ADSCs הם תאי אב מזנכימליים רב-פוטנטיים בעלי יכולת לחדש את עצמם ולהתמיין למספר שושלות תאים. תאים אלה ניתן לקצור מן החלק כלי הדם סטרומה (SVF) של רקמת השומן במהלך הליך lipoaspiration1. ADSCs התגלו כסוג תאי גזע אידיאלי לשימוש ברפואה רגנרטיבית מכיוון שתאים אלה נמצאים בשפע, זעיר פולשניים לקציר, נגישים בקלות ומאופיינים היטב2. טיפול בתאי גזע מציע אפיק אפשרי לריפוי פצעים על ידי גירוי נדידת תאים, התפשטות, ניאו-וסקולריזציה והפחתת דלקת בתוך פצעים 3,4. כ-80% מיכולת ההתחדשות של ADSCs מיוחסת לאיתות פרקריני באמצעות ההפרשה5 שלהם. בעבר, הוצע כי הזרקה מקומית ישירה של תאי גזע או גורמי גדילה לרקמות פגועות יכולה להיות בלתי חוקית מספיק במנגנוני תיקון in vivo 6,7,8. עם זאת, גישה זו התמודדה עם מספר אתגרים, כגון הישרדות ירודה וקליטת תאי גזע מופחתת בתוך רקמות פגועות כתוצאה מהסביבה הדלקתית 9. יתר על כן, אחת הסיבות שצוינו הייתה היעדר מטריצה חוץ-תאית לתמיכה בהישרדות ובתפקוד של התאים המושתלים10. כדי להתגבר על אתגרים אלה, מושם כעת דגש על פיתוח נשאים ביו-חומריים לתמיכה בכדאיות תאי גזע ובתפקודם.
תרבית תאים תלת-ממדית (תלת-ממדית) משפרת את האינטראקציה בין תאים לתאים ותא למטריצה במבחנה כדי לספק סביבה הדומה יותר לסביבה in vivo 11. הידרוג'לים נחקרו בהרחבה כקבוצה של נשאים ביו-חומריים המספקים סביבה תלת-ממדית לתרבית תאי גזע. מבנים אלה עשויים מים ופולימרים מוצלבים12. לאנקפסולציה של ADSCs בהידרוג'ל אין כמעט השפעה ציטוטוקסית על התאים במהלך התרבית תוך שמירה על יכולת הקיום של התאים6. תאי גזע שגודלו בתרבית תלת-ממדית מפגינים שימור משופר של גזעם ויכולת התמיינות משופרת13. באופן דומה, ADSCs מזרעי הידרוג'ל הדגימו כדאיות מוגברת וסגירת פצעים מואצת במודלים של בעלי חיים14. יתר על כן, אנקפסולציית הידרוג'ל מגדילה באופן משמעותי את התפיסה והשמירה של ADSCs בפצעים15,16. TrueGel3D עשוי מפולימר, אלכוהול פוליוויניל או דקסטרן, שהתמצק על ידי קרוסלינקר, ציקלודקסטרין או פוליאתילן גליקול17. הג'ל הוא הידרוג'ל סינתטי שאינו מכיל מוצרים מן החי שעלולים להפריע לניסויים או לעורר תגובה חיסונית במהלך השתלת הג'ל למטופל תוך חיקוי יעיל של מטריצה חוץ-תאית18. הג'ל ניתן להתאמה אישית מלאה על ידי שינוי הרכב ורכיבים בודדים. הוא יכול להכיל תאי גזע שונים ולתמוך בהתמיינות של מספר סוגי תאים על ידי התאמת קשיחות הג'ל19. ניתן ליצור אתרי התקשרות באמצעות הוספת פפטידים20. הג'ל מתכלה על ידי הפרשת מטאלופרוטאזים, מה שמאפשר נדידת תאים21. לבסוף, זה ברור ומאפשר טכניקות הדמיה.
PBM היא צורה זעיר פולשנית וקלה לביצוע של טיפול לייזר ברמה נמוכה המשמש לגירוי כרומופורים תוך תאיים. אורכי גל שונים יוצרים השפעות שונות על תאים22. אור בתחום האדום עד קרוב לאינפרא אדום מעורר ייצור מוגבר של אדנוזין טריפוספט (ATP) ומיני חמצן תגובתי (ROS) על ידי הגברת השטף דרך שרשרת הובלת האלקטרונים23. האור בטווח הכחול והירוק מעורר תעלות יונים מגודרות אור, ומאפשר זרימה לא ספציפית של קטיונים, כגון סידן ומגנזיום, לתוך התאים, אשר ידוע כמגביר התמיינות24. ההשפעה נטו היא יצירת שליחים משניים המעוררים שעתוק של גורמים המפעילים תהליכים תאיים במורד הזרם כגון הגירה, התפשטות והתמיינות25. PBM יכול לשמש כדי להתנות מראש תאים כדי להתרבות או להתמיין לפני השתלת התאים לסביבה שלילית, למשל, רקמה פגומה26. חשיפה ל-PBM לפני ואחרי ההשתלה (630 ננומטר ו-810 ננומטר) של ADSCs שיפרה באופן משמעותי את הכדאיות והתפקוד של תאים אלה in vivo בחולדה סוכרתית מודל27. רפואה רגנרטיבית דורשת מספר מספיק של תאים לתיקון יעיל של רקמות28. בתרבית תאים תלת-ממדית, ADSCs נקשרו לקצב התפשטות איטי יותר בהשוואה לתרבית תאים דו-ממדית6. עם זאת, PBM יכול לשמש כדי להגדיל את תהליך תרבית התאים התלת-ממדית של ADSCs על ידי שיפור הכדאיות, ההתפשטות, ההגירה וההתמיינות29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה. הפרוטוקול סוכם באופן גרפי באיור 1.
1. תרבית תאים דו-ממדית (2D)
הערה: ADSCs אימורטליים (1 x106 תאים) מאוחסנים ב -195.8 ° C בחנקן נוזלי בבקבוקון הקפאה המכיל 1 מ"ל של מדיה להקפאת תאים.
- הכנת מדיום שחזור תאים דו-ממדי ובקבוק תרבית דו-ממדית
- מעבירים 39 מ"ל של התווך הבסיסי לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל
- העשירו את המדיום הבסיסי בסרום בקר עוברי 20% (FBS; 10 מ"ל) ואנטיביוטיקה (1 מ"ל) (0.5 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין ו-0.5 מ"ל אמפוטריצין B).
- התננו מראש בקבוק T75 על ידי העברת 6 מ"ל ממדיום התאוששות התא לתוך הבקבוק ודגרו עליו בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 ו-85% לחות למשך 45 דקות (ניתן לעשות זאת תוך ביצוע שלבי שחזור התא כדי לחסוך זמן).
הערה: יש לחמם את המדיום המלא ל-37°C לפני השימוש ולאחסן אותו ב-4°C לתקופה מקסימלית של שבוע אחד.
- שחזור תאים דו-ממדי
- הסר קריוביאל ממיכל אחסון החנקן הנוזלי והפשיר במהירות את הבקבוקון באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס, עד שהוא מופשר לחלוטין.
- סובב את הקריוביאל באמצעות צנטריפוגה ב 1006 x גרם במשך 5 דקות (20 ° C) ולאחר מכן להסיר את supernatant.
- השהה מחדש את התאים הכדוריים באמצעות 1 מ"ל של מדיום שחזור תאים שחומם מראש.
- מפזרים באופן שווה את התאים המרחפים בבקבוק המותנה מראש (נפח סופי של 7 מ"ל) ודגרים בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 ו-85% לחות.
- לאחר 24 שעות, יש להשליך ולהחליף את מדיום שחזור התא.
- מחליפים את מדיום התרבית כל 2-3 ימים עד שהבקבוק הופך למפגש עם תאים.
- קציר של בקבוק תרבית דו-ממדית בתרחיף של תא בודד ובספירת תאים
- הוציאו את בקבוק התרבית הדו-ממדית מהחממה והשליכו את מדיית התרבות למיכל פסולת מתאים.
- העבירו 10 מ"ל של תמיסת שטיפה לתוך הבקבוק כדי לשטוף את התאים ולהסיר פסולת והצטברות חלבון. לאחר מכן, יש להשליך את תמיסת השטיפה.
- הוסף 6 מ"ל של תמיסת ניתוק לבקבוק התרבית כדי לנתק את התאים. יש לדגור על הבקבוק בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 ו-85% לחות למשך 2 דקות.
הערה: התבונן בבקבוק תחת מיקרוסקופ כדי לאשר שכל התאים נותקו. אם לא, טפחו בעדינות על הבקבוק ודגרו עוד דקה. - לאחר שכל התאים נותקו, העבירו את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל והוסיפו 1 מ"ל של מדיית שחזור התא (המכילה 20% FBS) לצינור. זה ינטרל את ההשפעה של פתרון הניתוק.
- צנטריפוגה את הצינור במשך 5 דקות ב 1711 x גרם (20 ° C).
- הסר את supernatant ו resuspend את התאים ב 1 מ"ל של מדיה מלאה.
- הסר 10 μL של תרחיף התא, מניחים אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה 500 μL ומערבבים אותו עם 10 μL של כחול טריפאן ביחס של 1: 1.
- מניחים 10 μL של תערובת תמיסת התאים הכחולים טריפאן בתא ספירת תאים כפול.
- מקם את תא ספירת התאים במונה התאים האוטומטי. מונה התאים יציין את המספר הכולל של תאים לכל מ"ל, כמו גם את מספר התאים קיימא ומתים. חשב את ספירת התאים הקיימא הממוצעת ואת מספר התאים בני קיימא הדרושים להטמעה בהידרוג'ל התלת-ממדי (שלב 2.2.6).
2. 3D תרבית תאים
- הכנת מדיום התרבות השלם בתלת מימד
- העבר 44 מ"ל של המדיום הבסיסי לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
- להעשיר את התקשורת עם 10% FBS (5 מ"ל) ואנטיביוטיקה (1 מ"ל) (0.5 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין ו 0.5 מ"ל Amphotericin B).
הערה: יש לחמם את המדיה המלאה ל-37°C לפני השימוש ולאחסן אותה ב-4°C למשך שבוע לכל היותר.
- הכנת ההידרוג'ל
- הכינו את הדאקסטרן המהיר על ידי צנטריפוגה (1000 x גרם למשך 30 שניות ב-20 מעלות צלזיוס) את בקבוקון הדאקסטרן המהיר כדי לרכז את החומר. הוסיפו 175 מיקרוליטר מים לבקבוקון הדאקסטרן המהיר כדי להגיע לריכוז סופי של 30 מילימול / ליטר קבוצות תגובתיות.
- מערבבים את הצינור (מהירות בינונית למשך 30 שניות) המכיל את תמיסת הדאקסטרן המהיר עד להמסה מלאה של החומר. דוגרים על החומר המומס על קרח במשך 5 דקות. צנטריפוגו את הצינור, סובבו אותו לזמן קצר ושמרו אותו על קרח במהלך שימוש נוסף.
- צנטריפוגה את הקרוסלינקר (1000 x גרם למשך 30 שניות ב 20 ° C) כדי לרכז את החומר. הוסף 188 μL מים לבקבוקון crosslinker כדי להשיג ריכוז סופי של 20 mmol / L של קבוצות תיול.
- מערבלים את הצינור (מהירות בינונית למשך 30 שניות) המכיל את תמיסת הקרוסלינקר עד להמסת כל החומר. דגרו על הקרוסלינקר המומס בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות. צנטריפוגו את הצינור, מערבולות קצרות, ושמרו אותו ב-RT במהלך שימוש נוסף.
- התאימו את פרוטוקול ההידרוג'ל מ-30 μL ל-10 μL להפחתת עלויות (ראו טבלה 1 לפרטים ספציפיים).
- הכן את השעיית התא כדי להשיג צפיפות זריעה של 2.5 x 103 תאים לכל 10 מיקרוליטר הידרוג'ל.
- שלבו את הרכיבים לפי טבלה 1 ליצירת תערובת אב. מעבירים 9 μL של תערובת המאסטר לבאר בצלחת רצועה של 96 בארות.
- מצקו את הג'ל על ידי הוספת 1 מיקרוליטר של הקרוסלינקר המתכלה 3 דקות לאחר העברת תערובת המאסטר.
- כסו את ההידרוג'לים בתרבית מלאה של 170 μL שחוממה מראש. לדגור במשך 1 שעות. לאחר שעה אחת, החלף את מדיום התרבות.
הערה: התאים המשובצים בהידרוג'ל מוכנים לניסויים או ניתוח נוספים במערכת התרבית התלת-ממדית. עקוב אחר פרוטוקולים נוספים לפי הצורך עבור יישומים במורד הזרם.
3. חשיפה פוטוביומודולציה
- הגדרת הלייזר
- הגדר את מערכת הלייזר של דיודה עבור אורכי גל ירוקים (525 ננומטר) או אינפרא אדום קרוב (825 ננומטר). הפעילו את הלייזרים ואפשרו להם להתחמם למשך הזמן המומלץ.
- ייצב את תפוקת הכוח של הלייזרים בכך שתאפשר להם להגיע למצב יציב. זה מבטיח הקרנה עקבית ומדויקת.
- מדוד את תפוקת החשמל של הלייזרים באמצעות מד כוח לייזר. רשום את ערכי ההספק עבור כל אורך גל.
- השתמש במשוואה 1 ( זמן הקרנת לייזר) כדי לחשב את זמן הקרנת הלייזר. החלף את הערכים מטבלה 2 במשוואה 1 כדי לקבוע את זמן ההקרנה המתאים לכל שטף. במשוואה 1, "r" מייצג את רדיוס אזור הקרינה של הלייזר.
משוואה 1 - עיין בטבלה 2 לקבלת הפרמטרים הספציפיים הדרושים לחישוב, כולל שטף פעולה (5 J/cm² או 10 J/cm²) ופלט כוח לייזר.
- הקרנת תרביות תאים תלת ממדיות
- לאחר החלפת המדיה המלאה (שלב 2.2.9), הניחו את הצלחת בת 96 הקידוחים המכילה תאים משובצי הידרוג'ל תחת מערכת הלייזר של הדיודה. הקרינו את ההידרוג'לים עם זמן הקרנת הלייזר המחושב עבור השטף שנבחר (5 J/cm² או 10 J/cm²) באורך הגל שנבחר (ירוק או כמעט אינפרא אדום). לכן, התרביות יקבלו מנה אחת בלבד.
- ודא שכל קבוצת ניסוי מלווה בבקרה (n = 4), המורכבת מ- ADSCs המוטבעים בהידרוג'ל ללא חשיפה ל- PBM.
הערה: הרכיבו תמיד משקפי בטיחות המתאימים לאורך גל האור איתו אתם עובדים. הלייזרים משמשים מחוץ לארון בטיחות; לכן, חשוב ביותר לחטא את האזור לפני השימוש. - דגרו על לוחות התרבית בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 ו-85% לחות למשך הניסויים. לדגור את הצלחות במשך 24 שעות עבור הניתוח הראשון או 10 ימים עבור תקופת הניתוח השנייה, לאחר הקרינה.
4. מורפולוגיה
- מיקרוסקופ אור הפוך
- הפעל את מיקרוסקופ האור ההפוך ואפשר לו להתחמם במשך כמה דקות. ודא שהמיקרוסקופ מיושר ומכויל כראוי.
- הכינו את הדגימה לתצפית בשקופית מיקרוסקופ או בצלחת תרבית תאים מיוחדת, בהתאם למערך הניסוי. כיול המיקרוסקופ לתנאי הדמיה אופטימליים.
- כוונן את הגדרות המיקוד, הבהירות והניגודיות לפי הצורך. בחר את עדשת 20x אובייקטיבית במיקרוסקופ לתצפית ורישום מורפולוגיה של התא.
- הניחו את הדגימה על במת המיקרוסקופ והתמקדו בתאים המעניינים באמצעות העינית. באמצעות העינית או תצוגת המצלמה, התבונן ותעד את המורפולוגיה של התא. שים לב לצורת התא, לגודל ולכל התכונות הייחודיות.
- חבר את מודול המצלמה למיקרוסקופ. הגדר את המצלמה להדמיה דיגיטלית. הקפידו על חיבור ותקשורת תקינים בין המצלמה למיקרוסקופ.
- באמצעות עדשת 20x אובייקטיבית, צלם תמונות דיגיטליות של התאים הנצפים. השתמש בפקדי המצלמה כדי לכוונן את החשיפה, המיקוד והגדרות רלוונטיות אחרות.
הערה: ודא שהתמונות שצולמו הן באיכות גבוהה ומספקות תצוגה מייצגת של המורפולוגיה של התא. - הפעל את תוכנת ההדמיה במחשב. צלם את התמונה והשתמש בכלי הניתוח בתוך התוכנה כדי לנתח את המורפולוגיה של התא.
- למדוד את ממדי התא, לספור תאים או לבצע כל ניתוח רלוונטי המבוסס על מטרות הניסוי.
- הוסף סרגל קנה מידה מתאים לתמונות באמצעות התוכנה. השתמש בהגדלה הידועה של מטרת המיקרוסקופ כדי לייצג במדויק את קנה המידה של התמונות.
5. בדיקות ביוכימיות
- שחזור תאים
הערה: יש לשחזר את התאים מההידרוג'ל בתרחיף חד-תאי לצורך בדיקות ביוכימיות נוספות במורד הזרם.- הכן את תמיסת שחזור התאים האנזימטית. בסביבה סטרילית, הכינו פתרון עבודה על ידי דילול תמיסת שחזור התאים האנזימטית במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ביחס של 1:20 (פתרון: PBS). אם נדרש שחזור תאים ממספר מסוים של ג'לים או בארות, חשב את הנפח הכולל הנדרש בהתבסס על 30 μL של תמיסת התאוששות לכל ג'ל.
- הוסף 30 μL של פתרון העבודה לכל ג'ל או באר המכילה את התאים הזקוקים להתאוששות. הקפידו על פיזור יסודי ואחיד של תמיסת השחזור על ידי נדנוד או ערבול עדין של הצלחת. דוגרים על הצלחת עם תמיסת ההתאוששות בהתאם לזמן הדגירה המומלץ. בדרך כלל ניתן למצוא מידע זה בגליון הנתונים של המוצר או בפרוטוקול שסופק על-ידי הספק.
- לאחר תקופת הדגירה, בזהירות להסיר את הצלחת מן האינקובטור. צנטריפוגה את הלוחות ב 1409 x גרם במשך 5 דקות (20 ° C) כדי pellet את התאים. עיין בגליון הנתונים או בפרוטוקול המוצר לקבלת תנאי הצנטריפוגה המומלצים. לאחר השלמת הצנטריפוגה, יש להשליך בזהירות את הסופרנטנט, תוך זהירות שלא להפריע לכדורית התא.
- השהה מחדש בעדינות את התאים הכדוריים ב 220 μL של PBS סטרילי. הקפידו על ערבוב יסודי להשגת תרחיף הומוגני של תא אחד. התאים מוכנים כעת לבדיקות ביוכימיות במורד הזרם. עקוב אחר הפרוטוקולים הספציפיים עבור הבדיקות המיועדות, בהתחשב באופי התאים המשוחזרים ובדרישות מערך הניסוי.
- בדיקת ציטוטוקסיות לקטט דהידרוגנאז (LDH)
- עבור כל באר, בזהירות להסיר 50 μL של מדיה תרבית מלאה, הבטחת הפרעה מינימלית לשכבת התא.
- הוסף 50 μL של מגיב ציטוטוקסיות ישירות לכל באר המכילה את 50 μL הנותרים של מדיה תרבותית. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כדי להבטיח ערבוב יסודי של הדגימה עם המגיב.
- הכינו בקרה חיובית. הגדר בארות משולשות עם 5 μL של תמיסת ליזה 10x לכל 50 μL של תאי בקרה חיוביים הכלולים בערכה.
- דוגרים על הצלחת בטמפרטורה ובמשך המומלץ. שלב זה מאפשר למגיב ציטוטוקסיות ליזה את התאים ולשחרר LDH למדיה התרבית.
- לאחר תקופת הדגירה, הוסף 50 μL של תמיסת העצירה ישירות לכל באר המכילה מגיב ציטוטוקסיות וליזט התא. מערבבים בעדינות על ידי פיטום למעלה ולמטה כדי להבטיח עצירה נכונה של התגובה.
הערה: פתרון העצירה עוצר שחרור LDH נוסף ומבטיח את יציבות התפתחות הצבע. - הגדר את קורא הלוחות הספקטרופוטומטרי בהתאם להוראות היצרן. רשום את הספיגה של כל באר ב 490 ננומטר. אורך גל זה הוא ספציפי לזיהוי קולורימטרי של מכפלת הפורמזן הנוצרת על ידי תגובת LDH.
- החסרו קריאות ספיגת רקע הן מקבוצות הטיפול והן מבארות הבקרה. קבל קריאות רקע מבארות המכילות מדיה וריאגנטים ציטוטוקסיים ללא תאים.
- נתח את ערכי הספיגה המתוקנים עבור כל דגימה כדי לקבוע את רמת ציטוטוקסיות. ערכי ספיגה גבוהים יותר מצביעים על שחרור LDH מוגבר, וכתוצאה מכך, ציטוטוקסיות גבוהה יותר.
- ודא שכל קבוצת ניסוי ובקרה כללו ארבע חזרות (שלב 3.2.2) לדיוק סטטיסטי. לחשב ולייבא את הספיגה הממוצעת של כל קבוצה ובקרה לתוכנית סטטיסטית מתאימה.
- השווה את התוצאות בין קבוצות טיפול ובקרות מתאימות כדי להעריך את ההשפעות ציטוטוקסיות במדויק ולתעד את כל קריאות הספיגה, החישובים ותנאי הניסוי להתייחסות עתידית.
- בדיקת התפשטות ATP
- בסביבה סטרילית, מערבבים 50 μL של התאים שהתאוששו עם 50 μL של מגיב ATP בכל באר.
הערה: התאם את נפח התאים והריאגנטים בהתבסס על מספר הבארות ותכנון הניסוי. שמור על יחסים עקביים לקבלת תוצאות מדויקות. - מניחים את הצלחת על שייקר ומנערים במרץ בחושך במשך 5 דקות. שלב זה מבטיח ערבוב יסודי של התאים עם מגיב. לאחר הניעור, דוגרים על הצלחת למשך 25 דקות נוספות ב-RT. תקופת דגירה זו מאפשרת למגיב לשכב את התאים ולייצר אות זוהר פרופורציונלי לכמות ה- ATP הקיימת.
- הגדר את קורא הלוחות בהתאם להוראות היצרן לזיהוי הארה. מדדו את עוצמת האור מכל באר המכילה את התא ליזט ואת מגיב ה-ATP. ודא שקורא הלוחות מוגדר למדידת עוצמת הארה עם הגדרות מתאימות.
- החסרו קריאות הארה ברקע הן מקבוצות הטיפול והן מבארות הבקרה. קבל קריאות רקע מבארות המכילות רק מגיב ATP ו- PBS ללא תאים.
- נתח את ערכי ההארה המתוקנים עבור כל דגימה כדי לקבוע רמות ATP, המשקפות את התפשטות התאים או את יכולת הכדאיות שלהם.
- ודא שכל קבוצת ניסוי ובקרה כללו ארבע חזרות (שלב 3.2.2) לדיוק סטטיסטי. לחשב ולייבא את הבהירות הממוצעת של כל קבוצה ובקרה לתוכנית סטטיסטית מתאימה.
- השווה את התוצאות בין קבוצות טיפול לבקרות רלוונטיות כדי להעריך את התפשטות ה- ATP במדויק. רשום את כל קריאות הזוהר, החישובים ותנאי הניסוי לעיון עתידי.
הערה: עבור כל הניתוחים הביוכימיים בצורת ערכה, פעל בהתאם למדריך הערכה או לפרוטוקול שסופק על-ידי היצרן לקבלת פרטים ספציפיים, כגון זמני הדגירה המומלצים, ריכוזים וכל צעד או שיקול נוסף. הקפידו תמיד על הנחיות בטיחות מעבדה בעת טיפול בכימיקלים ובחומרים ביולוגיים.
- בסביבה סטרילית, מערבבים 50 μL של התאים שהתאוששו עם 50 μL של מגיב ATP בכל באר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להעריך את המורפולוגיה ולבחון חזותית את צפיפות התאים של ההידרוג'לים, נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך (איור 2). ה-ADSCs שמרו על מורפולוגיה מעוגלת 24 שעות לאחר הזריעה והחשיפה ל-PBM. התאים היו מפוזרים ברחבי הג'ל כתאים בודדים או באשכולות דמויי ענבים. המורפולוגיה נותרה ללא שינוי לאחר 10 ימים בתרבות תלת ממדית. לא נצפה הבדל מוחלט במורפולוגיה בין קבוצות הניסוי והבקרות או בין קבוצות הניסוי השונות.
כדי להעריך את ההשפעות ציטוטוקסיות של חשיפה ל-PBM ותרבית תלת-ממדית באמצעות הידרוג'ל, נמדדה דליפת LDH (איור 3). לא היו הבדלים משמעותיים בין קבוצות הניסוי וקבוצת הביקורת לאחר 24 שעות או 10 ימים, דבר המצביע על כך שלחשיפה ל-PBM ולתרבית הידרוג'ל לא הייתה השפעה מזיקה על התאים.
שיעורי התרבות התאים נמדדו על-ידי מדידת תכולת ה-ATP של ADSCs (איור 4). חשיפה ל-PBM הביאה לשיעורי התפשטות מוגברים בכל קבוצות הניסוי בהשוואה לקבוצת הביקורת. בחשיפה של 24 שעות לאחר PBM, אורך הגל של 525 ננומטר עורר את שיעורי ההתפשטות הגבוהים ביותר. עם זאת, בסימן 10 הימים, אורך הגל של 825 ננומטר הראה שיעורי התפשטות טובים יותר בהשוואה לאורך הגל של 525 ננומטר. בסוף תקופת התרבית בת 10 הימים, קבוצת 825 ננומטר, 10 J/cm2 הראתה את שיעור ההתפשטות הגבוה ביותר.
איור 1: סקירה כללית של הפרוטוקול. פרוטוקול מסכם המדגיש את הכנת ההידרוג'ל ב-96 לוחות בארות, חשיפה ל-PBM ומדידת מורפולוגיה ובדיקות ביוכימיות ב-24 שעות ו-10 ימים לאחר החשיפה ל-PBM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ADSCs מצטברים מעצמם לאחר הזריעה. התאים שמרו על מורפולוגיה עגולה עד אליפסה ופוזרו בהידרוג'ל כתאים בודדים או כאגרגטים בעלי מראה אשכול דמוי ענבים ב-(A) 24 שעות ו-(B) 10 ימים לאחר הזריעה והחשיפה ל-PBM. לא נצפה שינוי מוחלט לאחר 10 ימי דגירה. שימוש בפקדים (1 ו- 4), 525 ננומטר ב- 5 J/cm2 (2) ו- 10 J/cm2 (5) או 825 nm ב- 5 J/cm2 (3) ו- 10 J/cm2 (6), בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: דליפת LDH תאי כמדידה של ציטוטוקסיות 24 שעות ו-10 ימים לאחר חשיפה ל-PBM, באמצעות דיודה של 525 ננומטר ו-825 ננומטר (5 J/cm2 ו-10 J/cm2) בהידרוג'ל. לא נצפתה עלייה משמעותית בציטוטוקסיות בהשוואה לקבוצת הביקורת הניסויית. הבקרה החיובית ייצגה מוות תאי מלא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ATP תאי כמדד להתפשטות 24 שעות ו-10 ימים לאחר חשיפה ל-PBM, באמצעות דיודה של 525 ננומטר ו-825 ננומטר (5 J/cm2 ו-10 J/cm2) בהידרוג'ל. חשיפה ל-PBM עוררה שיעורי התפשטות מוגברים בכל קבוצות הניסוי בשתי נקודות הזמן ובשתי השטף. הבדלים משמעותיים (P < 0.001) מסומנים על ידי ***. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| רכיב | נפח (μL) לכל באר |
| פולימר SLO-דקסטרן (30 מילימול/ליטר) | 0.7 |
| השעיית תאים | 2 |
| מאגר | 0.8 |
| מים | 5.5 |
| קרוסלינקר | 1 |
| עוצמת קול כוללת | 10 |
טבלה 1: נפחי מגיב הידרוג'ל (10 מיקרוליטר).
| פרמטרים של לייזר | ירוק (G) | ליד אינפרא אדום (NIR) |
| מקור אור | דיודה לייזר | דיודה לייזר |
| אורך גל (nm) | 525 | 825 |
| הספק (mW) | 553 | 515 |
| צפיפות הספק (mW/cm2) | 57.48 | 53.53 |
טבלה 2: פרמטרים של לייזר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ADSCs הם סוג תא אידיאלי לשימוש ברפואה רגנרטיבית מכיוון שהם מעוררים תהליכים שונים המסייעים בריפוי פצעים 3,4. עם זאת, ישנם מספר אתגרים שיש לעקוף, למשל, שיעורי הישרדות ירודים וקליטה לא יעילה של התאים באתר פציעה9. תאים אימורטליים שימשו כקו תאים זמין מסחרית, מכיוון שניתן לעבור אותם במשך דורות רבים יותר בהשוואה לתאים ראשוניים, אין צורך לקצור אותם, הם מאופיינים היטב, והם אוכלוסיות הומוגניות המבטיחות תוצאות עקביות31. מטרת מחקר זה הייתה לקבוע את הפוטנציאל המוגבר של PBM על ההתרבות והציטוטוקסיות של ADSCs, באמצעות תרבית תאים תלת-ממדית. פרוטוקול היצרן עבור הידרוג'ל 30 μL הותאם ל 10 μL כדי לחסוך עלות32. עם זאת, נפח מופחת זה עשה את ההכנה והטיפול של הג'ל קשה יותר.
ADSCs הוכחו כמצטברים מעצמם בסביבה תלת-ממדית33. באופן דומה במחקר זה, התאים יצרו צברי תאים בעלי מראה דמוי ענבים. עם זאת, זוהו גם תאים מטילים בודדים. שפיכת תאים היא תכונה ידועה של ספרואידים שבה תאים מתנתקים מהגוף הספרואידי הראשי או מהגוף המצטבר ומשוחררים לסביבת התרבית. שפיכת תאים יכולה לנבוע מהתרבות תאים, שבה תאים בני קיימא נשפכים במהלך מיטוזה ומאפשרים נדידה34. לחלופין, נשירה יכולה להיגרם עקב מוות תאי ואובדן של ספרואיד או צורה מצטברת35, במיוחד בכדורידים גדולים מאוד עקב ליבה נמקית גדלה. התאים אימצו מורפולוגיה מעוגלת בתרבית תלת-ממדית, בהשוואה לצורת ציר בתרביות דו-ממדיות. בהתאם לממצאים של מחקרים דומים, תוצאות אלה נובעות ממחסור באתרי התקשרות או מטריצה חוץ-תאית עבור התאים להיצמד ל 6,9. יתר על כן, התאים לא הראו נדידה משמעותית בג'ל, מה שמרמז עוד יותר על הצורך באתרי התקשרות36. מומלץ להוסיף פפטיד הידבקות או חלבון מטריצה חוץ-תאי אחר כדי להקל על התקשרות, היצמדות ונדידה. מגבלה של המחקר הייתה השימוש במיקרוסקופ אור הפוך כדי לבחון את המורפולוגיה התלת-ממדית של ADSCs במקום Z-stacking. לחשיפה ל-PBM ולתרבית תלת-ממדית לא הייתה השפעה משמעותית על ציטוטוקסיות של ADSCs הן ב-24 שעות והן ב-10 ימים לאחר החשיפה, מה שמצביע על כך שתרבית הידרוג'ל ו-PBM בטוחים ואין להם השפעה שלילית על התאים 6,26. בתרבית תאים תלת-ממדית, ADSCs נקשרו לקצב התפשטות איטי יותר בהשוואה לתרבית תאים דו-ממדית. זה נתמך על ידי שיעורי ההתרבות הנמוכים של הבקרות הרגילות במחקר הנוכחי6. PBM (525 ננומטר ו-825 ננומטר) הגדיל באופן משמעותי את שיעורי ההתרבות של ADSCs בתרבות תלת-ממדית. בתחילה, האור הירוק (525 ננומטר) הן בשטף 5 J/cm2 והן בשטף 10 J/cm2 עורר את שיעורי ההתפשטות הגבוהים ביותר בהשוואה לאור האינפרא-אדום הקרוב (825 ננומטר). עם זאת, בסימן 10 ימים, לאור האינפרא אדום הקרוב (825 ננומטר) יש את שיעורי ההתפשטות הגבוהים ביותר הן בשטף של 5 J/cm2 והן בשטף של 10 J/cm2. באופן דומה, PBM (525 ננומטר ו-825 ננומטר) הוכח כמגביר את שיעורי ההתפשטות בתרבויות דו-ממדיות37. מומלץ לכלול גם קבוצת שילוב של אורכי גל, שכן מחקרים אחרים דיווחו על השפעה סינרגטית של אור ירוק ואינפרא אדום קרוב.
לסיכום, ההידרוג'ל המשמש הוא הידרוג'ל סינתטי עם יכולת התאמה אישית אדירה כדי להתאים לצרכים של יישומים שונים. המחקר הנוכחי הוכיח כי לג'ל אין השפעה ציטוטוקסית על תאים בתרבית במשך תקופה של 10 ימים. יתר על כן, PBM הדגימה פוטנציאל אוגמנטטיבי חיובי על ידי ויסות משמעותי של שיעורי ההתרבות של ADSCs, למרות היותה בסביבת תרבות תלת ממדית. לכן, הידרוג'ל זה יכול לשמש נשא ביו-חומר אפשרי להשתלה לפצעים. מחקרים עתידיים צריכים להיות מכוונים לבחון את היכולת הפוטנציאלית של הג'ל לסייע בריפוי פצעים באמצעות מחקרים בבעלי חיים. אם תוצאות הניסויים בבעלי חיים יהיו חיוביות, ניתן יהיה לקצור, לעטוף ולהגדיל עם PBM ADSCs שמקורם במטופלים לפני ההשתלה בפצעים כדי לסייע בריפוי פצעים ביישומים קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי קרן המחקר הלאומית של דרום אפריקה Thuthuka Instrument, מענק מספר TTK2205035996; מרכז הלייזר האפריקאי (ALC) במימון המחלקה למדע וחדשנות (DSI), מספר מענק HLHA23X המשימה ALC-R007; מועצת המחקר האוניברסיטאית, מענק מספר 2022URC00513; יוזמת קתדרות המחקר של המחלקה למדע וטכנולוגיה בדרום אפריקה (DST-NRF/SARChI), מענק מספר 98337. הגופים המממנים לא מילאו כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף, בניתוח, בפענוח הנתונים או בכתיבת כתב היד. המחברים מודים לאוניברסיטת יוהנסבורג (UJ) ולמרכז לחקר לייזר (LRC) על השימוש שלהם במתקנים ובמשאבים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 525 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | EN 60825-1:2007 | |
| 825 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | SN 101080908ADR-1800 | |
| 96 Well Strip Plates | Sigma-Aldrich | BR782301 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | ATP reagent, Proliferation assay Kit |
| Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430659 | cryovial |
| CryoSOfree | Sigma-Aldrich | C9249 | Cell freezing media |
| CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | Cytotoxicity reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Media | Sigma-Aldrich | D5796 | Basal medium (39 mL/44 mL) |
| FieldMate Laser Power Meter | Coherent | 1098297 | |
| Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate | Sigma-Aldrich | CLS3370 | |
| Foetal bovine serum | Biochrom | S0615 | Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%) |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | Rinse solution |
| Heracell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51026280 | |
| Heraeus Labofuge 400 | Thermo Scientific | 75008371 | Plate spinner for 96 well plates |
| Heraeus Megafuge 16R centrifuge | ThermoFisher | 75004270 | |
| Immortalized ADSCs | ATCC | ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 | Passage 37 |
| Invitrogen Countess 3 | Invitrogen | AMQAX2000 | Automated cell counter for Trypan Blue |
| Julabo TW20 waterbath | Sigma-Aldrich | Z615501 | Waterbath used to warm media to 37 °C |
| Olympus CellSens Entry | Olympus | Version 3.2 (23706) | Imaging software: digital image acquisition |
| Olympus CKX41 | Olympus | SN9B02019 | Inverted light microscope |
| Olympus SC30 camera | Olympus | SN57000530 | Camera attached to inverted light microscope |
| Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates | Sigma-Aldrich | CLS3912 | Opaque well used for ATP luminescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| SigmaPlot 12.0 | Systat Software Incorporated | ||
| TrueGel3D – True3 | Sigma-Aldrich | TRUE3-1KT | 10 µL |
| TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution | Sigma-Aldrich | TRUEENZ | 01:20 |
| Trypan Blue Stain | Thermo Fisher - Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Gibco | 12563029 | Cell detachment solution |
| Victor Nivo Plate Reader | Perkin Elmer | HH3522019094 | Spectrophotometric plate reader |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. Burns Trauma. 10, (2022).
- Nilforoushzadeh, M. A., et al. Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).
- Yang, M., et al. Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).
- Chimenti, I., et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).
- Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid. Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32 (2013).
- Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart. The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Koivunotko, E., et al. Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel. Biomedicines. 10 (10), 2584 (2022).
- Dong, Y., et al. Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing. Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619 (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Sung, T. -C., et al. 3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities. J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).
- Garg, R. K., et al. Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing. Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).
- Dong, Y., et al. Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury. Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).
- Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d (2024).
- Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling. Int J Mol Sci. 23 (6), 3265 (2022).
- Mashinchian, O., et al. In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging. eLife. 11, e57393 (2022).
- Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice. Theriogenology. 183, 120-131 (2022).
- Marx, V. How some labs put more bio into biomaterials. Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).
- Marques, M. M.
- Hamblin, M. R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).
- Chen, J., et al. Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1. J Photochem Photobiol B. 233, 112472 (2022).
- Chang, S. -Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine. Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).
- Bikmulina, P. Y., et al. Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems. J Biomed Opt. 25 (4), 048001 (2020).
- Ahmadi, H., et al. Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494 (2020).
- Mao, A. S., Mooney, D. J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).
- De Andrade, A. L. M., et al. Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures. Lasers Med Sci. 38 (1), 221 (2023).
- Diniz, I. M., et al. Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering. J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).
- Carter, M., Shieh, J. C. Guide to Research Techniques in Neuroscience. , Elsevier, Academic Press. (2015).
- Lutolf, M. P., et al. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).
- Robledo, F., et al. Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70 (2023).
- Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth. J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).
- Bogacheva, M. S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations. Front Cell Dev Biol. 9, 726499 (2021).
- Chen, X., Thibeault, S. L. Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture. Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).
- Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors. Biochimie. 196, 225-233 (2022).
