Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Summary

Mikromanipulation von Hefezellen ist für meiotischen genetische Analyse oder diploiden Zygoten wählen erforderlich. Diese Mikromanipulationen werden mit dem Mikronadel einer Dissektionsmikroskop durchgeführt. Die Mikronadel wird verwendet, um Zellen zu verlagern und wird durch einen Mikromanipulator, die mit verschiedenen Graden der Automatisierung gesteuert werden.

Abstract

Hefe ist ein sehr praktische Zwecke geeigneten Modells, das verwendet werden, um viele verschiedene zelluläre Prozesse zu studieren. Das gemeinsame Labor-Stamm<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Gibt es entweder in einer haploiden oder diploiden Zustand. Die Fähigkeit, Allele von zwei Haploiden kombinieren und die Möglichkeit, Änderungen an dem Genom einzuführen erfordert die Herstellung und Präparation von Asci. Asci Produktion von haploiden Zellen beginnt mit der Paarung von zwei Hefe haploiden Stämmen mit kompatiblen Paarungstypen eine diploide Stamm zu produzieren. Dies kann in eine Reihe von Möglichkeiten entweder auf einem festen Medium oder in flüssiger erreicht werden. Es ist vorteilhaft, für den Diploiden in Medium, das selektiv fördert ihr Wachstum im Vergleich zu entweder der haploiden Stämme auszuwählen. Die Diploiden sind dann erlaubt, auf nährstoffarmen Medium sporulieren zu Asci, ein Bündel von vier haploide Tochterzellen, die aus meiotischen Reproduktion der diploiden Form. Eine Mischung aus vegetativen Zellen und Asci wird dann mit dem Enzym Zymolyase zu verdauen entfernt die Membran sac um die Ascosporen der Asci behandelt. Mit Mikromanipulation mit einem Mikronadel unter einem Dissektionsmikroskop ein aufzuheben können einzelne Asci und trennen und verlagern die vier ascopores. Dissected Asci sind für mehrere Tage gewachsen und getestet für die Marker oder Allele von Interesse durch Replika-Plattierung auf geeigneten selektiven Medien.

Protocol

Bau der diploiden Stämme Protokoll für die Herstellung von Diploiden durch Paarung Die ersten Stämme sollte auf YPD oder selektiven Medium getroffen werden, wenn nötig, einzelne Kolonien zu produzieren. Die beiden haploiden Stämmen sollte der entgegengesetzten Paarungstyps (dh Mata und MATα) werden. Mit einer sterilen Impföse holen einen kleinen Teil einer Kolonie von einer der beiden haploiden Stämmen. Auf einer neuen YPD Platte Streifen die Schleife einmal in einer geraden Linie üb…

Discussion

Hefe Dissektion ist ein nützliches Werkzeug, um neue Sorten mit den gewünschten Marker auszuwählen. Bei der Ermittlung des theoretischen Wachstumsmuster von vier Ascosporen ist es wichtig, bei der Genotyp des vegetativen Zelle aussehen. Wenn ein Plasmid vorhanden ist, muss man wissen, wenn es einzelne, niedrige oder hohe Kopie ist, da dies Auswirkungen auf die Ascosporen (s) das Plasmid erhalten und wird Prognosen und Schlussfolgerungen in Bezug auf die Stämme manipuliert zu beeinflussen.

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Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop	SOR508
Tris	Reagent	BioShop	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop	POA 301
Agar	Reagent	BioShop	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop	LEU 222