Mikromanipulation von Hefezellen ist für meiotischen genetische Analyse oder diploiden Zygoten wählen erforderlich. Diese Mikromanipulationen werden mit dem Mikronadel einer Dissektionsmikroskop durchgeführt. Die Mikronadel wird verwendet, um Zellen zu verlagern und wird durch einen Mikromanipulator, die mit verschiedenen Graden der Automatisierung gesteuert werden.
Abstract
Hefe ist ein sehr praktische Zwecke geeigneten Modells, das verwendet werden, um viele verschiedene zelluläre Prozesse zu studieren. Das gemeinsame Labor-Stamm<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Gibt es entweder in einer haploiden oder diploiden Zustand. Die Fähigkeit, Allele von zwei Haploiden kombinieren und die Möglichkeit, Änderungen an dem Genom einzuführen erfordert die Herstellung und Präparation von Asci. Asci Produktion von haploiden Zellen beginnt mit der Paarung von zwei Hefe haploiden Stämmen mit kompatiblen Paarungstypen eine diploide Stamm zu produzieren. Dies kann in eine Reihe von Möglichkeiten entweder auf einem festen Medium oder in flüssiger erreicht werden. Es ist vorteilhaft, für den Diploiden in Medium, das selektiv fördert ihr Wachstum im Vergleich zu entweder der haploiden Stämme auszuwählen. Die Diploiden sind dann erlaubt, auf nährstoffarmen Medium sporulieren zu Asci, ein Bündel von vier haploide Tochterzellen, die aus meiotischen Reproduktion der diploiden Form. Eine Mischung aus vegetativen Zellen und Asci wird dann mit dem Enzym Zymolyase zu verdauen entfernt die Membran sac um die Ascosporen der Asci behandelt. Mit Mikromanipulation mit einem Mikronadel unter einem Dissektionsmikroskop ein aufzuheben können einzelne Asci und trennen und verlagern die vier ascopores. Dissected Asci sind für mehrere Tage gewachsen und getestet für die Marker oder Allele von Interesse durch Replika-Plattierung auf geeigneten selektiven Medien.
Protocol
Bau der diploiden Stämme Protokoll für die Herstellung von Diploiden durch Paarung Die ersten Stämme sollte auf YPD oder selektiven Medium getroffen werden, wenn nötig, einzelne Kolonien zu produzieren. Die beiden haploiden Stämmen sollte der entgegengesetzten Paarungstyps (dh Mata und MATα) werden. Mit einer sterilen Impföse holen einen kleinen Teil einer Kolonie von einer der beiden haploiden Stämmen. Auf einer neuen YPD Platte Streifen die Schleife einmal in einer geraden Linie üb…
Discussion
Hefe Dissektion ist ein nützliches Werkzeug, um neue Sorten mit den gewünschten Marker auszuwählen. Bei der Ermittlung des theoretischen Wachstumsmuster von vier Ascosporen ist es wichtig, bei der Genotyp des vegetativen Zelle aussehen. Wenn ein Plasmid vorhanden ist, muss man wissen, wenn es einzelne, niedrige oder hohe Kopie ist, da dies Auswirkungen auf die Ascosporen (s) das Plasmid erhalten und wird Prognosen und Schlussfolgerungen in Bezug auf die Stämme manipuliert zu beeinflussen.
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Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeiten in Laboratorium des Autors wird von der Canadian Institutes of Health Research, der Canada Foundation for Innovation, der Natural Sciences and Engineering Research Council und der Concordia University gefördert.