Dissezione di Saccharomyces cerevisiae Asci

Summary

Micromanipolazione di cellule di lievito è necessaria per l'analisi genetica meiotica o per selezionare zigoti diploidi. Queste micromanipolazioni vengono effettuate utilizzando il microago di un microscopio dissezione. Il microago viene utilizzato per trasferire le cellule ed è controllato da un micromanipolatore che sono disponibili con diversi gradi di automazione.

Abstract

Il lievito è un sistema modello altamente trattabile che viene utilizzato per studiare molti processi cellulari diversi. Il ceppo di laboratorio comune<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Esiste sia in una aploide o stato diploide. La possibilità di combinare gli alleli di due haploids e la possibilità di apportare modifiche al genoma richiede la produzione e la dissezione di aschi. Produzione di aschi da cellule aploidi inizia con l'accoppiamento di due ceppi di lievito aploidi con tipi di accoppiamento compatibile per la produzione di un ceppo diploide. Questo può essere ottenuto in diversi modi, sia su terreno solido o liquido. È vantaggioso per selezionare i diploidi in mezzo che favorisce selettivamente la crescita rispetto ad uno dei due ceppi aploidi. I diploidi sono poi permesso di sporulare sul poveri di nutrienti medio per formare aschi, un fascio di quattro cellule figlie aploidi derivanti dalla riproduzione meiotica della diploide. Una miscela di cellule vegetative e aschi viene poi trattata con l'enzima per digerire zymolyase via la membrana che circonda il sacco ascospore di aschi. Mediante micromanipolazione con un microago al microscopio dissezione si può raccogliere e separare i singoli aschi e ricollocare i quattro ascopores. Aschi sezionato sono coltivate per diversi giorni e testati per i marcatori o alleli di interesse da parte placcatura replica su appropriati terreni selettivi.

Protocol

Costruzione di ceppi diploidi Protocollo per la produzione di diploidi con l'accoppiamento I ceppi iniziale deve essere colpito sulla media YPD, o selettivo, se necessario, per la produzione di singole colonie. I due ceppi aploidi dovrebbe essere di tipo accoppiamento opposto (cioè Mata e MATα). Utilizzando un'ansa sterile inoculazione raccogliere una piccola porzione di una colonia da uno dei due ceppi aploidi. Su una striscia nuova piastra YPD il ciclo una volta in linea retta tut…

Discussion

Dissezione lievito è un utile strumento per selezionare nuove varietà con marcatori desiderato. Nel determinare il modello teorico di crescita di quattro ascospore è importante guardare al genotipo della cellula vegetativa. Se un plasmide è presente, si deve sapere se è solo esemplare, alto o basso, come questo influirà che ascospore (s) ricevono il plasmide e influenzerà le previsioni e conclusioni per quanto riguarda i ceppi manipolati.

Alcuni ceppi possono sporulare meglio di altri…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop	SOR508
Tris	Reagent	BioShop	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop	POA 301
Agar	Reagent	BioShop	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop	LEU 222