Dissecção da Saccharomyces cerevisiae Asci

Summary

Micromanipulação de células de levedura é necessária para a análise genética meiótica ou para selecionar zigotos diplóides. Estes micromanipulations são realizadas com a microneedle de um microscópio de dissecação. O microagulhas é usado para deslocar as células e é controlado por um micromanipulador, que estão disponíveis com vários graus de automação.

Abstract

A levedura é um sistema modelo altamente tratável que é usado para estudar diversos processos celulares. A cepa comum de laboratório<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Existe em qualquer um haplóide ou estado diplóide. A capacidade de combinar a partir de dois alelos haplóides ea capacidade de introduzir modificações no genoma requer a produção e dissecção de ascos. Asci produção de células haplóides começa com o acasalamento de duas cepas de levedura haplóide com tipos de acasalamento compatíveis para produzir uma cepa diplóide. Isso pode ser feito em um número de maneiras, tanto em meio sólido ou no estado líquido. É vantajoso para selecionar para o diplóides no meio que, seletivamente, promova o seu crescimento em relação a qualquer uma das cepas haplóides. Os diplóides são, então, permissão para esporular em meio de pobres em nutrientes para formar ascos, um conjunto de quatro células-filhas haplóides resultantes de reprodução meiótica do diplóides. Uma mistura de células vegetativas e ascos é então tratado com a zymolyase enzima para digerir o saco do membrana que envolve os ascósporos do ascos. Usando micromanipulação com microagulhas em um microscópio de dissecação um pode pegar ascos individuais e separadas e realocar os quatro ascopores. Ascos dissecados são cultivadas por vários dias e testados para os marcadores ou alelos de interesse por plaqueamento em réplica adequada meios seletivos.

Protocol

Construção de linhagens diplóides Protocolo para a produção de diplóides de reprodução sexuada As cepas inicial deve ser riscado em meio YPD, ou seletivos, se necessário, para produzir colônias único. As duas cepas haplóides deve ser do tipo de acasalamento oposto (isto é, MATA e MATα). Usando um loop de inoculação estéril escolher uma pequena porção de uma colônia de uma das duas estirpes haplóides. Em uma raia novo prato YPD o loop uma vez em uma linha reta ao longo da …

Discussion

Dissecção levedura é uma ferramenta útil para selecionar novas cepas com marcadores desejada. Ao determinar o padrão de crescimento teórico de quatro ascósporos, é importante olhar para o genótipo da célula vegetativa. Se um plasmídeo está presente, é preciso saber se é exemplar único, baixa ou alta, pois isso afetará quais ascósporos (s) receberá o plasmídeo e vai afetar as previsões e conclusões sobre as cepas sendo manipulado.

Certas cepas podem esporular melhor do qu…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop	SOR508
Tris	Reagent	BioShop	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop	POA 301
Agar	Reagent	BioShop	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop	LEU 222