La disección de Saccharomyces cerevisiae Asci

Summary

Micromanipulación de células de levadura que se necesita para el análisis genético meiótica o para seleccionar cigotos diploides. Estos micromanipulaciones se llevan a cabo con la microaguja de un microscopio de disección. La microaguja se utiliza para trasladar las células y es controlado por un micromanipulador que están disponibles con diferentes grados de automatización.

Abstract

La levadura es un sistema modelo muy manejable que se utiliza para estudiar muchos procesos celulares diferentes. La cepa de laboratorio común<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Existe, ya sea en un estado haploide o diploide. La capacidad de combinar los alelos de dos haploides y la posibilidad de introducir modificaciones en el genoma requiere la producción y la disección de los ascos. La producción de células haploides ascos comienza con el apareamiento de dos cepas de levaduras haploides con tipos de acoplamiento compatible para producir una cepa diploide. Esto se puede lograr de varias maneras, ya sea en un medio sólido o líquido. Es ventajoso para seleccionar a los diploides en un medio que promueve selectivamente su crecimiento en comparación con cualquiera de las cepas haploides. Los diploides se dejan de esporas en medio pobre en nutrientes para formar ascos, un paquete de cuatro células hijas haploides resultantes de reproducción meiótica de los diploides. Una mezcla de células vegetativas y ascos se trata con la enzima para digerir zymolyase de distancia de la membrana del saco que rodea el ascosporas de los ascos. El uso de micromanipulación con una microaguja bajo un microscopio de disección se puede recoger y separar cada ascos y reubicar a los cuatro ascopores. Ascos disecados se cultivan durante varios días y la prueba de los marcadores o alelos de interés por la chapa adecuada réplica en los medios selectivos.

Protocol

Construcción de cepas diploides Protocolo para la producción de diploides en el apareamiento Las cepas inicial debe ser ponchado en medio YPD, o selectiva, si es necesario, para producir colonias aisladas. Las dos cepas haploides debe ser de tipo de apareamiento opuesto (es decir, Mata y MATα). El uso de un asa de siembra estéril recoger una pequeña parte de una colonia de una de las dos cepas haploides. En una racha de nueva placa YPD el circuito una vez en una línea recta a través de…

Discussion

Disección de la levadura es una herramienta útil para seleccionar nuevas variedades con marcadores deseado. Al determinar el patrón de crecimiento teórico de cuatro ascosporas es importante tener en cuenta el genotipo de la célula vegetativa. Si un plásmido está presente, hay que saber si es solo ejemplar, de baja o alta ya que esto afectará la que las ascosporas (s) recibe el plásmido, y afectará a las predicciones y conclusiones con respecto a las cepas siendo manipulados.

Cierta…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop	SOR508
Tris	Reagent	BioShop	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop	POA 301
Agar	Reagent	BioShop	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop	LEU 222