Время изображений в заданный промежуток первичной предраковых эпителиальные клетки молочной железы, полученных из генно-инженерных мышей модели рака молочной железы

Summary

Время изображений в заданный промежуток используется для оценки поведения первичной предраковых молочной эпителиальных клеток, полученных из генетически модифицированных мышей моделей риска рака молочной железы, чтобы определить, есть ли корреляция между конкретных поведенческих параметров и различных генетических поражений.

Abstract

Время изображений в заданный промежуток может быть использован для сравнения поведения культурного первичной предраковых эпителиальные клетки молочной железы, полученных из различных генно-инженерных мышей модели рака молочной железы. Например, время между клеточных делений (ячейка жизни), апоптозе числа клеток, эволюцию морфологических изменений, и механизм образования колоний может быть определена количественно и по сравнению с клетками, несущими специфических генетических поражений. Первичный молочной эпителиальных клеточных культур создаются из молочных желез без ощутимой опухоли. Железы тщательно резекции с четким разделением от соседних мышц, лимфатических узлах удаляют, и одно-клеточные суспензии обогащенных молочных эпителиальные клетки порождаются измельчения ткани молочных желез следует ферментативного разложения и фильтрации. Single-клеточной суспензии высевали и помещаются непосредственно под микроскопом в камере инкубатора для живых клеток изображений. Шестнадцать 650 мкм х 700 мкм поля в конфигурации 4x4 друг от WELL из 6-луночный планшет загружаются через каждые 15 мин в течение 5 дней. Покадровый изображения рассматриваются непосредственно измерить сотовой поведения, которое может включать в себя механизм и частоты образования клеток колонии в течение первых 24 ч посеве клеток (агрегации по сравнению с клеточной пролиферации), частота апоптоза, и постепенно морфологических изменений. Single-клетки слежения используется для создания клеточной судьбы карт для измерения индивидуальной жизни клетки и исследование моделей клеточного деления. Количественные данные статистически проанализированы на предмет существенных различий в поведении связаны с определенными генетическими повреждениями.

Introduction

Генно-инженерные модели мыши являются инструментами, изучить и понять, как различные генетические повреждения вклад в риск развития рака молочной железы. Например, генетически модифицированных мышах показали, что сочетание трех факторов: потеря полнометражный рака молочной железы 1, раннее начало (BRCA1) ген в эпителиальные клетки молочной железы, опухоли белка р53 (ТР53) зародышевой линии гаплонедостаточность и молочной эпителиальных целевые клетки до регулируемого альфа-рецептора эстрогена (ERA) выражение результатов в развитии рака молочной железы в 100% BRCA1 ^{floxed (F) 11/f11/Mouse молочной Вирус опухоли (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( тет-ор) -ER/MMTV-reverse тетрациклин трансактиватор (rtTA} мышей в возрасте 12 месяцев по сравнению с более низких процентах сообщили в BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + /} - мышей без эпоху чрезмерной экспрессии (~ 50 - 60%) и BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} мышей без гена ТР53 haploinsufтивность (<5%) ^1.

Динамические покадровой визуализации поведения предраковых первичной эпителиальные клетки молочной железы показывает различия в поведении клетки, которые не так легко оценены в статических срезов. Изменения в пролиферации и дифференцировки наблюдается в первичных клеток молочной железы из человеческих носителей мутации BRCA1. ² Создание одноклеточных суспензий первичных эпителиальные клетки молочной железы из нормальных и генетически модифицированных мышей формируются путем ферментативного диссоциации удаленной ткани молочной железы. ³ замедленной просмотре изображений для оценки механизма и сроков появления клетки колонии и заболеваемости морфологические изменения в клетках, в том числе эпителиальных мезенхимальных перехода (EMT) и апоптоза. Генерация карт судьбы клеток, количественное промежуток времени между клеточных делений (ячейка жизни), и определение моделей клеточного деления облегчена за счет использования одноклеточных слежения. TimmОтслеживание Tool 'ы (ТТТ) является общедоступной программного обеспечения, используемого для создания одной ячейки карты судьбы. Его полезность для выяснения механизмов клеточной судьбе было установлено ^4,5 изучение нормальных гемопоэтических стволовых клеток, развитие ^6-9 и генерации нейронов ^10.

Protocol

1. Общая схема

1. Создание первичных культур предраковых эпителиальные клетки молочной железы из молочных желез генной инженерии и управления мышей дикого типа.
2. Захват живых клеток изображения каждые 15 минут, используя Volocity получения изображений программное обеспечение (версия 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) на срок до 5 дней.
3. Просмотр покадровой изображений непосредственно для оценки сроков и механизма формирования эпителиальной клетки колонии, частота апоптоза, и постепенно морфологических изменений.
4. Преобразование Volocity генерируется. TIFF стеков. JPG файлы с помощью MetaMorph автоматизация микроскопии и анализа изображений программное обеспечение (Molecular Devices, ООО Саннивейл, Калифорния) и переименования цифровых файлов изображений (Переименовать 2.1.6, http://www.softpedia.com/get / System / File-менеджмент /-Rename.shtml ), чтобы включить совместимость с инструмент отслеживания программного обеспечения Тимм (в ТТТ,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "целевых =" _blank "> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. HTML).
5. Использование TTT, создавать ячейки судьба карты для определения времени между клеточных делений (ячейка жизни) и модели клеточного деления (симметричный по сравнению с асимметричной).
6. Анализ количественных данных из шагов 3 и 5 выше, чтобы определить, существуют ли статистически значимые различия между разными генетически модифицированных мышей моделей и / или дикого типа управления.

2. Генерация первичной молочной эпителиальных клеточных культур

1. Подготовить всю СМИ для изоляции одного эпителиальные клетки молочной железы после изменения инструкции завода-изготовителя (EpiCult-B Мышь среднего Kit, StemCell Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия). Комбинат 450 мл Epi-Культ-B среду, 50 мл Epi-Культ B распространения дополнения, 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 50 мкг / мл пенициллина / стрептомицина (PenStrер) и 10 нг / мл эпидермального фактора роста (EGF).
2. Подготовка Диссоциация СМИ путем объединения 1 часть 10x коллагеназы / гиалуронидазы смеси с 9 частями полной среде с 2,1.
3. Усыпить мышью и немедленно приступить к аутопсии. Место мыши на спине на платформе вскрытия пенополистирола и закрепите все четыре конечности так вентральной кожа становится упругой. Насыщение вентральной кожи и волос, в том числе вышележащих конечностей, с 70% этанола. Expose # 2/3 (грудной) и № 4/5 (паховые) молочных желез, сделав срединный разрез через кожу (не входят в брюшину), который продолжается в Y-разрез через кожу медиальной каждой передней конечности и перевернутый Y разрез через кожу медиальной каждой задней конечности.
4. Используя тупой диссекции, отделить кожу от underlyingperitoneum, потяните на себя обе стороны кожи, пока он не тугой, и закрепить ее на платформу пенополистирола вскрытия использованием штифтов. С внешней стороны, использовать тупой диссекции с разумным использованием Диссеие ножницы, чтобы изолировать нетронутыми паховой и / или грудные молочные железы от подлежащей соединительной ткани и мышц. Разместить не более двух молочных желез в 10 см стерильную чашку Петри и перейти к ткани капот культуры.
5. В тканях капот культуре, изучить железы для грудные лимфатические узлы, которые определены как небольших, хорошо ограниченные узелки с желтоватым цветом. Удалить лимфатические узлы от окружающих железы с использованием стерильных скальпеля и пинцета. Пропустить через мясорубку ткани молочных желез в ~ 1 мм ^{3 кубика} с помощью двух стерильных скальпелей, по одной в каждой руке.
6. Место фарш ткань молочной железы в 5 мл Диссоциация СМИ, перемешать, осторожно пипеткой вверх и вниз 2-3 раз, используя 10 мл пипетки, и инкубировать в течение ночи (до ~ 16 часов) при 37 ° C инкубаторе с 5% CO ₂ в 50 мл коническую трубку с распущенными крышкой.
7. На следующее утро, готовить холодные смеси сбалансированный солевой 1 часть Хэнкса решение (HBSS), содержащей 2% FBS и 4 частей буферного раствора хлористого аммония содействовать красной блдревесины лизиса клеток (HFAmCl), а также холодные HBSS с добавлением 2% FBS (HF). Предварительно теплой трипсина-EDTA (0,25%), 5 мг / мл диспазы в сбалансированном солевом растворе Хэнка изменения, 1 мг / мл ДНКазы I, и полная Media.
8. Удалить коническую трубку с центрифугой ткани молочной железы из инкубатора и аккуратно импульса вихря 2-3 сек в два раза. Центрифуги трубы при 450 х г в течение 5 мин (комнатной температуры или 4 ° C), и отбросить супернатант.
9. Ресуспендируют осадок как минимум в 10 мл HFAmCl и центрифуге при 450 х г в течение 5 мин (комнатной температуры или 4 ° C) и отбросить супернатант.
10. Добавьте 3 мл трипсина-EDTA в гранулах и смешать сначала с 5 мл пипетки, а затем с P1000 микропипетки до тягучий (1-3 мин). Добавить 10 мл HF, центрифуги при 450 х г в течение 5 мин (комнатной температуры или 4 ° C) и отбросить супернатант.
11. Добавить 2 мл 5 мг / мл диспазы и 200 мкл 1 мг / мл ДНКазы I в гранулах и смешать с P1000 микропипетки в течение 1 мин. Образцы должны быть ClOУды, но не тягучий. Если тягучий, добавить 100 мкл ДНКазы I и снова перемешать.
12. Добавить 10 мл холодной HF, процедить через сито 40 мкм клетки и центрифуги при 450 х г в течение 5 мин (комнатной температуры или 4 ° C) и отбросить супернатант.
13. Ресуспендируют конечный осадок в полной среде. Количественная оценка общего числа клеток (с использованием гемоцитометр или Coulter Counter). Два молочных желез дают примерно 1 х 10 ⁶ до 1 х 10 ⁷ клеток. Плита первичных эпителиальных клеток в плоскодонные 6-луночный планшет при плотности 1,5 х 10 ⁵ клеток на лунку.

3. Онлайн-клеточной изображений

1. Сразу после посева клеток, поместить 6-луночный планшет надежно на столике микроскопа в пределах 5% CO ₂ / насыщенный humidity/37 ° C температура инкубации камеры. Отрегулируйте конденсатора для Kohler освещение и центр фазе кольца. Для экспериментов, представленных здесь, перевернутые Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer вращающийся диск конфокальнойМикроскоп системы в широкопольных фазового контраста режиме с 10-кратным объективом был использован.
2. Открытое программное обеспечение захвата изображений, создавать и назвать библиотеку для покадровой изображения, и сохранить в папку с достаточным пространством для больших файлов. Эксперименты, представленные здесь использованы Volocity получения изображений программное обеспечение (версия 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA).
3. Разрешить пластины, чтобы уравновесить в микроскоп инкубаторе в течение как минимум 15 мин. Опустите линзы, чтобы избежать этапа линзы помех. Под «Сцена» заголовок, выберите пункт "Калибровка этап". Выкупить фокальной плоскости, множество Z = нуль при х, у, г вкладки и Марк точки изображения, выбрав пункт "Добавить точку" в рамках "Стадии" заголовок. Место точках в середине каждой лунки 6-луночный планшет для работы с изображениями, как фаза визуализации отличие может быть искажено рядом с периферии пластиковых колодцев. Организовать пунктов на площади в 4 х 4 поля (650 мкм х 700 мкм полей), каждая с небольшим перекрытием (около 5%). Сохранить выбранные точки в разделе "Stagе ».
4. В разделе "Этап", выберите "Сделать фокус карты" и следуйте инструкциям, чтобы установить фокус каждой точки. Установить сроки получения изображения, чтобы захватить 4 фотографии в час (каждые 15 мин). Это может быть скорректирована в зависимости от требований конкретного эксперимента. Сохранить фокус карту под "Stage".
5. Щелкните правой кнопкой мыши на правой стороне панели инструментов "Image Acquisition" и сохраните настройки изображения. Нажмите на кнопку записи, чтобы начать изображений. После 1 часа, проверить фокусировку изображения, чтобы увидеть, если любая корректировка не требуется.
6. Мониторинг и продолжают изображений живых в течение 5 дней, заканчиваясь, когда клетки становятся вырожденная.

4. Прямые Просмотр покадровой изображения для оценки времени и механизм формирования начальных Эпителиальные колонии клеток, апоптоз заболеваемости, и этапы морфологических изменений

1. Прямой просмотр покадровой изображения можно выполнять с помощью любого совместимого программного обеспечения просмотра видео (например, HTTP:/ / Www.real.com/ RealPlayer или других бесплатных или коммерчески доступного программного обеспечения). Изображения можно просматривать в формате. TIFF на этом шаге или после преобразования. JPG файлы (см. шаг 5).
2. Чтобы определить механизм формирования начальной колонии, начните с одного изображения стек, представляющих одну изображений сайта на тарелку. В начальных кадрах, клетки будут плавающими. Следите серийный изображения, чтобы определить, когда первый эпителиальных клеток прилипает к пластине. На данном этапе, эпителиальные клетки могут быть выявлены и дифференцированы от фибробластов их более кубических морфологии. Следуйте этим одним эпителиальных клеток через последовательные изображения и следить за его судьбой в течение последующих 24 часов. Запишите, если она становится окружении дополнительных эпителиальные клетки или претерпевает деление клеток или апоптоз. Если окруженный эпителиальных клеток, механизм образования колоний могут быть определены непосредственно при просмотре, если окружающие клетки получают из плавающих клеток, которые затем объединяют с начальной приверженцем клетки (ы) илиот деления начальной приверженцем клетки. Запишите число колоний формируется путем объединения ячейки по сравнению с делением клетки в течение первых 24 часов.
3. Для определения числа первоначально прикрепленных клеток, которые подвергаются апоптозу в течение определенного периода времени, выполните последовательные образы для появления классические черты апоптоза развивается в ячейке, которая была приверженцем ( http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html ), а число апоптоза клеток, выявленных в ходе всего срока изображений или в конкретные сроки записаны.
4. Со временем, эпителиальных клеток в культуре изменять их морфологии от начальной форму шестигранника на более удлиненный внешний вид в соответствии с EMT. Следите серийный изображения, чтобы определить день / час после посева, когда это произойдет.

5. Модификация файла изображения

1. Переименование изображений папок и файлов в соответствии с требованиями для отслеживания программного инструмента Timm в Используйте бесплатную программу, как переименование 2.1.6 ( http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml ) для переименования файлов в группах. Создайте папку, содержащую все папки и файлы эксперимента и введите имя папки (например,
2. Создайте папку для каждой точки / положение, в котором культура образа. Имя папки: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. Номер позиции должны иметь 3 цифры. Пример: 072511RN_p001. Поместите все файлы изображений, что отдельные позиции в папке.
3. Добавить момента времени (по 5 цифр) и номер канала (так как есть только один яркий канал поля, используйте "0") в конце каждого имени файла в следующем формате:
   EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg
4. Создайте файл журнала для каждой позиции по первой загрузке бесплатных программ TTTlogfileconverter от TTT сайта. Начало TTTlogfileconverter программы и выберите папку эксперимента. Входное изображение интервал (в секундах). Для снимка каждые 15 минут, введите 900 сек. Затем нажмите зеленую скрытые файлы журналов кнопку.

6. Генерация сотовых Карты судьбы отдельных клеток Использование TTT

1. Cмии папку под названием TTTexport и подпапку TTTfiles, где все ячейки данных отслеживания будут сохранены после ТТТ инструкции программного обеспечения
2. Начало TTT программу, выберите пользователя инициалы, и нажмите "Продолжить".
3. Нажмите кнопку «Установить NAS", выберите пользователя, созданного "TTTexport" папки и нажмите кнопку ОК. В браузере выберите эксперимент папку, выберите позицию папку, а затем нажмите кнопку "Загрузить позицию" кнопку.
4. Установить глазные фактор "10x". Загрузите количества изображений требуется (загрузка всех изображений рекомендуется в первый раз).
5. В ячейке окна редактора, выберите "Новая колония" в меню Файл. В фильме окне нажмите кнопку "Track ячейки" или F2, чтобы начать отслеживать клетки.
6. Определить ячейки в MОви окна и использование мыши, чтобы поместить курсор на ячейку. Круг с номером ячейки должны появиться после F2 была нажата. Используйте клавишу "0" на цифровой клавиатуре на клавиатуре, чтобы отслеживать размещение ячейки и перехода к следующему изображению. Переместив курсор следить за размещение каждой ячейки через каждый кадр. Чтобы удалить дорожку и вернуться к предыдущему изображению нажмите кнопку "Del" на цифровой клавиатуре. Чтобы двигаться вперед кадры без отслеживания ячейки нажмите кнопку "3" и двигаться в обратном направлении без отслеживания нажмите "1" на цифровой клавиатуре.
7. Чтобы отметить деление клеток нажмите кнопку "Отдел" кнопку в окне фильма. Чтобы отметить гибель клеток нажмите кнопку "Сотовый смерти" кнопку в окне фильма. После того, как разделение произошло, дочерние клетки могут быть отслежены в том же карту судьбу клетки щелкнув правой кнопкой мыши на окружности символ назначенный дочерняя клетка в окне редактора ячеек, чтобы начать режим слежения автоматически.
8. Нажмите клавишу F10, чтобы сохранить дерево. Каждое дерево будет сохранить в назначенный выходной разаER (TTTExport). Чтобы начать новую карту судьбу клетки, выбрать пункт "Новая колония" в разделе "Файл", затем "Open" меню в окне редактора Cell.
9. Сведите данные ячейки жизни после сбора из "Cell данных" на вкладке в окне редактора Cell.

7. Статистический анализ

1. Используйте либо Стьюдента-тест (при сравнении двух генотипов) или ANOVA (если сравнение> двух генотипов), чтобы определить, есть ли различия в параметрические данные, такие как номера начальной колонии клетки, клетки жизни или часов до появления EMT между различными генотипами являются статистически значительна. Апоптоза частоты можно сравнить, как / общее количество покрытием клеток с использованием Стьюдента испытания или ANOVA или Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса, когда, полученных в виде процента от прилипших клеток.
2. Выполните власти испытания с использованием данных анализа первых экспериментов, чтобы определить, сколько экспериментальной повторяет необходимости выполняется и карты судьбы клеток, полученные от каждого из одинаковых для адекватной сТАТИСТИЧЕСКИЕ энергии с использованием доступных бесплатных (например, http://statpages.org/ ). В экспериментах, представленных здесь, культуры клеток, полученные из трех мышей в генотипе было достаточно, чтобы определить, были ли статистически значимые различия в клеточной формирование колоний и клеточной жизни, когда определенные генетические изменения были сделаны.

Representative Results

Эпителиальные клетки фибробластов и можно отличить по морфологии клеток. Эпителиальные клетки имеют форму шестигранника (рис. 1А-B) и формы клеточных колоний (рис. 1А). Фибробласты, типа стромальных клеток, имеют удлиненную морфологию (рис. 1С).

Клетки округлые и плавает в начале изображения (рис. 2A-D). После прикрепления к пластине они стали плоскими и продемонстрировал кубический тип внешности (рис. 2E, H). К 4 дней культуры большинства эпителиальных клеток, вытянутых в EMT морфологию (рис. 2I-L). Это изменение произошло с той же хронологии во всех генотипов изучены. Некоторые цифровые изображения были размытыми, потому что Kohler освещения и выравнивания фазы кольцо не был установлен правильно (рис. 2D, H, L).

Плавающие элементы, разработанные в определенные отдельные эпителиальные клетки колоныES на 24 часа после посева (рис. 3а, б). Серийный анализ изображений показал, что эти колонии были порождены агрегации клеток, а не деление клеток. В то время как нарушение BRCA1 само по себе не изменяют количества колоний образуется, добавление TP53 гаплонедостаточность значительно сократить число колоний формируется и добавление ERα чрезмерной экспрессии значительно увеличилось число колоний образуется (рис. 3).

Очень важно следить за цифровые изображения, полученные и фокусировки карты часто в течение первых 24 часов как клетки прикрепляются к пластине, затем как минимум два раза в день, чтобы обеспечить клетки остаются в центре внимания и культуры не загрязнены. Точность анализа будет подорвано, если отображаемого клетки не в фокусе (рис. 4).

В эксперименте представитель представленные здесь, критическим вопросом было определить, если изменения в уровне экспрессиис генов, известных воздействовать на риск развития рака молочной (BRCA1, TP53, и эстроген рецептор 1 (ESR1) ¹⁾ изменено количество часов между клеточных делений (ячейка жизни) или повлияла на модели разделения (симметричный по сравнению с асимметричными) в незлокачественные первичные эпителиальные клетки молочной железы. Чтобы достичь этого, отдельные ячейки судьба картах (деревья) были получены с использованием ТТТ. Примеры представителя судьбы клеток карты для каждого из четырех генотипов испытания показаны (рис. 5A-D). Четыре генотипа клетки испытания были дикого типа (без генетических манипуляций) (рис. 5А), потеря полнометражный BRCA1 (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre)} (рис. 5Б), потеря полнометражный BRCA1 в комбинации с TP53 гаплонедостаточность (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -)} (рис. 5С), и потери полнометражный BRCA1 в сочетании с TP53 haploinsufficiпрозрачности и усиления ESR1 (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER)} (рис. 5D). Генерация карт ячейки судьба была остановлена, когда клетки стали вырожденная (~ 3-4 поколений), так как однозначного отслеживания отдельных клеток стало невозможным после этого. Поколение 0 (время до первого деления клеток) не были включены в анализ клеточной жизни, потому что продолжительность поколения 0 был длиннее и более изменчивы, чем последующие поколения. Поколения 1, 2, 3 и 4 были сгруппированы вместе для окончательного анализа, потому что не было никаких существенных различий в средних жизни клетки или стандартная ошибка среднего (SEM) между этими поколениями. Сравнение средних жизни клетки между разными генотипами (Рис. 5E) показали, что потеря полнометражный BRCA1 сократили количество часов между деление клеток с 21,3 ± 1,6 ч (дикого типа) до 16,5 ± 1,0 ч (BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre).} Нетtably, хотя потеря одного аллеля гена ТР53 в дополнение к потере полнометражный BRCA1 связан со значительным увеличением молочных развития1 раком, значит ячейка жизнь не изменилась (16,3 ± 1,2 ч) по сравнению с мышей, лишенных гена BRCA1 только. Интересно получить из ESR1 в BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} мышей клетки восстановили жизни длительностью почти до дикого типа (19,3 ± 2,1 ч), хотя эти мыши имеют высокая заболеваемость раком молочной развития всех моделей изучены here.1 Эти данные свидетельствуют о том, что потеря полнометражный BRCA1 не было неизменно связано с укороченным ячейки жизни, вместо этого был изменен более чем на выраженным ERα. Возможный следующий шаг экспериментов с использованием этой технологии могут быть доза-реакция эксперименты с использованием различных эстрогенов, другие факторы роста, или кандидат терапии для оценки их воздействия на клетку жизни в различных генетических backgrounds. В отличие от влияния на продолжительность жизни клетки, ни один из генетических изменений здесь учился изменены моделей клеточного деления.

Рисунок 1. Внешний вид эпителиальные клетки колонии (A), эпителиальные клетки (B) и фибробластов (C) с покадровой обработки изображений. Эпителиальные клетки появляются более кубических в то время как фибробласты появляются более вытянутым. Размер баров = 50 мкм.

Рисунок 2. Представитель последовательной покадровой изображения время от 0, 2 и 4 дня демонстрируют изменения в клеточной морфологии с течением времени и различия во внешнем виде и без Коляэ освещения. момент времени 0 покрытием клетки плавают (наконечники стрел н.э.), на два дня в культуре они являются приверженцем и могут проявлять кубический тип морфологии (толстые стрелки E, H) и четыре дня в культуре они удлиненные и демонстрации EMT-как морфология (тонкая IL стрелки). Kohler освещение присутствует в панели переменного тока, EG, и IK. Панели D, H и L иллюстрирует изображение без подсветки Колер. Показаны изображения из одной точки изображения с течением времени. Размер полоски = 200 мкм. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 3. Количество эпителиальных клеточных колоний на 1 день варьировалась от генотипа. (A) Округлые плавающие клетки в начале покадровой обработки изображений. (B) Два представителя эпителиальных клеточных колоний (стрелки). (C) Количество эпителиял клеточных колоний / кадр формируется на 24 часов изменялась генотипа. Бар графики иллюстрируют среднее и стандартная ошибка среднего. * Р <0,05, ANOVA. Размер полоски = 200 мкм. Клеток, выделенных из молочных желез без ощутимой опухоли от 10 - до 12-месячного BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (п = 4), BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre / р53 + / -} (п = 3), BRCA1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (п = 3), а дикого типа (п = 3) мышей были обследованы для исследований. Пять независимых экспериментов изображения состоят из различных комбинаций дикого типа и генетически модифицированных мышей были выполнены. Медиа содержащейся фенола красного цвета. Нет эстроген был добавлен. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 4. Вне фокуса изображения не могут быть точнымиют проанализированы. Прежде изображений пластины, пластины должны сидеть в визуализации инкубатора в течение 15 мин, чтобы уравновесить. В первый день формирования изображений, в центре внимания должны быть проверены и скорректированы каждые несколько часов. После этого должны быть проверены два раза в день, но в целом остается более стабильным. Стрелка указывает вне фокуса эпителиальные клетки колонии.

На рис. 5 клеток судьба карты, полученные от одноклеточных отслеживания использования ТТТ (A) дикого типа, (B) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre,} (C) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -,} и (D) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} мышей. Клетки, которые не могут быть отслежены в связи с потерей из кадра или в сливной слой клеток, обозначены знаком вопроса. Когда не вопросительный знакуказано, отслеживание намеренно закончилась из-за слияния клеток и невозможности однозначно следуют одноклеточных судьба. (E) Среднее ячейки жизни варьировалась от генотипа. Бар графики иллюстрируют среднее и стандартная ошибка среднего жизни клетки (время между клеточного деления) на протяжении многих поколений 1-4 для каждого генотипа. Среднее жизни клетки были значительно короче в молочной эпителиальных клеток, полученных из BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} и BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -} по сравнению с мышами дикого типа. * Р <0,05, ANOVA. Клеток, выделенных из молочных желез без ощутимой опухоли от 10 - до 12-месячного BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (п = 4), BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre / р53 + / -} (п = 3), BRCA1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (п = 3), а дикого типа (п = 3) мышей были обследованы для исследований. Пять независимых экспериментов изображения состоят из различных комбинаций дикого типа и генетически Энгинeered мышей были выполнены. Медиа содержащейся фенола красного цвета. Нет эстроген был добавлен. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Discussion

Критические шаги

Важно, чтобы молочные железы собирают из мышей того же возраста, для контроля за возрастной изменчивости молочной эпителиальных поведение клетки. При посеве клеток, такое же количество клеток должны быть покрыты в каждую лунку для каждого эксперимента. Клетки должны быть относительно редкими, когда посеве культур, так что не стал сливной слишком быстро, что позволяет следовать нескольким отдельным клеткам через последовательные образы. Важно, чтобы пластина быть доведены в инкубаторе до визуализации, потому что в центре внимания будет меняться после выхода пластинки находится в равновесии. После визуализации начался, в центре внимания должны быть проверены часто и корректируются по мере необходимости, особенно в течение первых 24 часов. Важно, чтобы температура в инкубаторе регулируемых и подогретого. Число людей, входил и выходил из комнаты должны быть ограничены как можно больше. Мы рекомендуем практикующие все аспекты Settinг до эксперимента заранее, чтобы обеспечить воспроизводимость и контроль качества. Как и во всех экспериментах культуры клеток, бесплодие является важным вопросом и стандартные стерильные практики культуры клеток должны быть использованы в любое время.

Сохранение и манипулирования большими файлами изображений требуется значительное количество памяти. Общий сетевой диск или портативных жестких дисков может быть использован. После преобразования файлов важно, чтобы убедиться, что изображение последовательно правильность имени и помещены в соответствующие папки. Частые сохраняет цифровые данные должны быть выполнены в течение всего процесса.

Недостатки

Этот метод использует 2-D культуры система, которая не позволяет анализ поведенческих различий, которые могут проявиться в 3-D системе культуры. Продолжительность жизни клетки могут быть воспроизводимо измерять после первого наблюдаемого клеточного деления, как число часов к первому делению клеток после инициализациириала покрытия клеток является переменной.

Возможные изменения

В зависимости от требований эксперимента, замедленную съемку можно вести более или менее часто. Например, если переходные клеточные структуры должны быть определены количественно, 5 сек интервал может быть более подходящим. Другие процедуры для получения первичных молочных эпителиальных клеточных культур могут быть использованы. Любое изображение оборудование может быть использовано для создания покадровой обработки изображений, пока она в состоянии удовлетворить требования эксперимента. Альтернативные системы для одноклеточных слежения могут быть использованы. Для процедуру, описанную здесь, стандартные пластиковые плоским дном 6-луночный планшет был адекватным. Пластиковая посуда может быть использована для всех большим рабочим расстоянием воздуха линз, таких как 4x, 10x, 20x и. Это важно выбрать регионов недалеко от центра пластиковой посуды при выполнении визуализации фазового контраста с пластиковыми изогнута по краям в большинстве блюд и искажает свет.Покровные стекла толщиной дном скважины будут необходимы для нормального рабочего расстояния погружения линз (нефть, вода, глицерин и др.), которые, как правило, на более высоком увеличении.

Поиск и устранение неисправностей

Когда клетки покрытием, средств массовой информации должна быть достаточной для поддержания роста клеток в течение 5 дней, чтобы уменьшить необходимость в манипулировании пластины на сцене, однако, в случае необходимости, средства массовой информации могут быть добавлены. Рекомендуется, чтобы испарение быть сведено к минимуму. Испарение должно осуществляться путем размещения 3:57 блюда стерильной деионизированной воды внутри инкубатора и заправки их в случае необходимости. Это можно заполнить неиспользованные лунки 6-луночный планшет с стерильной деионизированной воды.

Если изображение не загружается в программу ТТТ, в первую очередь проверьте и убедитесь, что файлы и папки расположены и назван правильно. Далее, убедитесь, что файл журнала в нужной папке (см. п. 5.5).

FutuПриложение повторно или направление после овладения техникой

Те же самые общие процедура может быть использована для анализа поведения других типов клеток, включая первичные человеческие эпителиальные клетки молочной железы, а также клетки рака молочной железы. Например, генотипические конкретного поведения и / или ответ на кандидата лечения могут быть проанализированы. Кроме того, изображения флуоресценции клеток, активированных (FAC) отсортировано клеточных популяций могут быть выполнены или флуоресцентные метки добавлены для наблюдения за конкретными типами клеток.

Значение этого метода по отношению к существующим методам

Добавление покадровой визуализации и анализа поведения клеток с течением времени к традиционной культуре клеток и методы маркировки предоставляет количественные данные из одной клетки в течение долгого времени, а не только всю динамику населения. Эта техника позволяет одиночных клеток, которые должны соблюдаться постоянно, в отличие от традиционных методов, которые позволяют наблюдать только в дискретные моменты времени. Moreover, традиционные методы требуют клетки, чтобы его беспокоили, взяв их в и из инкубатора, чтобы рассмотреть их под микроскопом, в то время как подход, описанный здесь, позволяет клеткам, которые должны соблюдаться без перевода. Наконец, покадровой визуализации обеспечивает прочный запись клеток под наблюдение, которое может быть возвращено для дальнейшего анализа. Использование TTT для отслеживания отдельных поведение клеток позволяет однозначно анализа нескольких параметров и не требует использования флуоресцентной метки для локализации специфических клеток под наблюдением. Техника показывает различия в поведении молочной эпителиальных клеток, которые трудно измерить в статических срезов тканей молочной железы. Измерения сотовых жизни количественно количество часов между митотических событий. Это измерение содержит конкретные данные о фактическом количестве часов между клеточных делений с указанием продолжительности клеточного цикла в час. Исследователь может использовать эти данные, чтобы определить, какспецифических генетических модификаций или культура условиях воздействия клеточного цикла длины.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiCult-B Basal Medium Mouse	StemCell Technologies	05610
EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse	StemCell Technologies	05612
recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF)	StemCell Technologies	02633
Collagenase/Hyaluronidase	StemCell Technologies	07912
Disposable Scapels	Feather	2975#10
Hanks' Balanced Salt Solution	StemCell Technologies	37150
Ammonium Chloride	StemCell Technologies	07800
Tryspin-EDTA	StemCell Technologies	07901
Dispase	StemCell Technologies	07913
DNase I	StemCell Technologies	07900
40 μm cell strainer	StemCell Technologies	27305
FBS	StemCell Technologies	06100
PenStrep	Gibco	15140