فحص متشابك الحويصلة عن طريق إعادة تدوير الأصباغ FM خلال مستدعى، العفوي، والأنشطة متشابك مصغرة
Summary
وصفنا استخدام الأصباغ styryl FM لإعادة تدوير الصورة حويصلة متشابك في النهايات العصبية الوظيفية. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها ليس فقط إلى أثار، ولكن أيضا عفوية والأنشطة متشابك مصغرة. بروتوكول يوسع متنوعة من الأحداث متشابك التي يمكن تقييمها على نحو فعال.
Abstract
حويصلات متشابك في النهايات العصبية الوظيفية الخضوع إيماس الإلتقام و. هذا التدوير حويصلة متشابك يمكن تحليلها على نحو فعال باستخدام الأصباغ styryl FM، والتي تكشف عن دوران الغشاء. وقد صممت بروتوكولات التقليدية لاستخدام الأصباغ FM لتحليل الخلايا العصبية التالية حفز (أثار) النشاط متشابك. في الآونة الأخيرة، أصبحت البروتوكولات المتوفرة لتحليل إشارات FM التي تصاحب أنشطة متشابك أضعف، مثل الأحداث متشابك عفوية أو مصغرة. تحليل هذه التغييرات الصغيرة في إشارات FM يتطلب أن نظام التصوير حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن تغيرات صغيرة في كثافة، ولكن يتم منعها أن التغييرات مصطنعة من السعة الكبيرة. نحن هنا وصف البروتوكول الذي يمكن تطبيقه على أثار، عفوية، والأنشطة متشابك مصغرة، واستخدام الخلايا العصبية الحصين مثقف كمثال على ذلك. يشتمل هذا البروتوكول أيضا وسيلة لتقييم معدل photobleaching من الأصباغ وزير الخارجية، وهذا هو كبيرمصدر القطع الأثرية عند التصوير تغييرات طفيفة في كثافة.
Introduction
وظيفة الحويصلات متشابك هو من العوامل الهامة للانتقال متشابك. هذه الحويصلات الإفراج عن الناقلات العصبية عندما تندمج مع الغشاء البلازمي قبل المشبكي (إيماس)، وتصبح جاهزة للدورة أخرى للإفراج عنهم بعد أن جددت من غشاء البلازما (الإلتقام) وإعادة تحميل مع الناقل العصبي. البحث في ديناميات والآليات الكامنة وراء إعادة تدوير حويصلة متشابك تم تسريعها من خلال إدخال الأصباغ styryl FM 1. ويمكن لهذه الجزيئات متقابلة الزمر، التي موجبة الشحنة مجموعات الرأس ماء وذيول مسعور (الأصباغ متعددة في الشكل 1A، stereoview من FM1-43 في الشكل 1B)، أدخل عكسية وخروج الأغشية الدهنية دون تتخلل لهم. مجموعات من الأصباغ FM بسمات مماثلة التي تؤثر على مجموعة من الضوء الذي تنبعث. على سبيل المثال، FM2-10، FM1-43، وFM1-84 لها رابطة ثنائية واحدة بين اثنين من المركبات الحلقية وشوالانبعاثات الأخضر ث. الفرق بينهما هو طول الذيل مسعور، والذي يحدد للا مائية، وبالتالي معدل الخروج من غشاء (departitioning). في حالات FM5-95-64 وFM4، ربط ثلاثة سندات ضعف المركبات الحلقية، وأنها تظهر الانبعاثات الحمراء. هذه الأصباغ تختلف فيما يتعلق أجزائها ماء. في جميع الأصباغ وزير الخارجية، ويزيد من كثافة مضان عندما يتم إدراجها في الأغشية البيولوجية، ويرجع ذلك إلى زيادة في العائد الكمي في البيئة المتعلقة مسعور على البيئة المائية. وبالتالي فإن التغيرات في كثافة FM تمثل التغييرات في دوران الغشاء. ألوان مختلفة (أطياف الانبعاث) وhydrophobicities جعل FM الأصباغ أداة بحث تنوعا في إعادة تدوير حويصلة متشابك.
استنادا إلى هذه الميزات، وتستخدم الأصباغ FM معظمها وفقا للمخطط التالي عند تحليل إعادة تدوير حويصلة متشابك (الشكل 2). الخلايا العصبيةواستحم ق في حل خارج الخلية التي تحتوي على صبغة FM، مما مكنها من أن تؤخذ يصل الى الحويصلات متشابك (مركبة فضاء) لأنها تشكل عبر الإلتقام (تلطيخ). ثم يتم غسل الصبغة من خلال تطبيق حل خالية من الصبغة خارج الخلية، وهذا يكشف عن المحطات العصبية الوظيفية، أي فقط تلك التي تمر بنشاط الإلتقام سوف تحتوي على مجموعة من الحويصلات متشابك التي يتم تحميلها مع الصبغة (الشكل 2 القاع). إيماس اللاحقة يؤدي إلى فقدان الصبغة وزير الخارجية إلى الفضاء خارج الخلية وفقدان ما يصاحب ذلك من مضان (destaining؛ بسبب كل من departitioning إلى البيئة المائية ونشرها بعيدا عن موقع إيماس). وبالتالي فإن التغيرات في كثافة مضان FM هي مؤشرات حويصلة متشابك إكسو والإلتقام.
وقد استخدمت الأصباغ وزير الخارجية إلى وصمة عار ويزيل اللون الحويصلات متشابك في مختلف الكائنات الحية والاستعدادات 2،3. وتشمل الأمثلة رجل أعمال الثديياتالثقافات اونال 4-9، شرائح الدماغ في الثدييات 10،11، 12،13 التقاطعات العصبية والعضلية، الخلايا العصبية بين القطبين الشبكية 14،15، وخلايا الشعر من القوقعة 16.
عادة في مثل هذه التجارب، يتم تشغيل كل من تلطيخ وdestaining على نطاق واسع من خلال تحفيز الخلايا العصبية (النشاط أثار). في الآونة الأخيرة، ومع ذلك، كما تم تحليلها إعادة تدوير حويصلة متشابك ردا على التحفيز ضعيفة، وكذلك إعادة التدوير في حالة عدم وجود حافز خارجي (النشاط متشابك عفوية ومصغرة) 9،17-19. يتم تعريف الأنشطة متشابك عفوية ومصغرة عن تلك التي تحدث في حالة عدم وجود مؤثرات الخارجية، مع السابق تنطوي على اطلاق عفوية من إمكانات العمل (الشكل 3). وترتبط هذه الأنشطة متشابك ضعيفة مع تغييرات صغيرة في إشارات FM من تلك التي نجمت عن التحفيز واسعة النطاق. يتطلب القياس أن التغييرات في fluoresc FMكثافة سينعقد تعكس بدقة متشابك إيماس حويصلة أو الإلتقام ولكن التغييرات لم مصطنعة في شدة. أحد الأسباب من القطع الأثرية هو وجود تلطيخ غير محددة من غشاء البلازما بواسطة الأصباغ FM. سوف تبييض التدريجي لهذا العنصر يؤدي إلى تغيير تدريجي في كثافة مضان قياس، والتي سيتم خطأ وأرجع إلى الأنشطة متشابك. ويمكن تخفيض هذا العامل بالطرق المناسبة (انظر البروتوكول). السبب الأبرز من القطع الأثرية هو photobleaching من صبغة FM الاحتفاظ داخل الحويصلات متشابك. يجب أن تكون التغييرات ذات الصلة في photobleaching من شدة FM صغيرة بالمقارنة مع البيولوجية (متشابك) التغييرات التي يتم قياسها. التطور الأخير من الكاميرات الحساسة، على سبيل المثال، بضرب الإلكترون إلى جانب المسؤول عن الجهاز (EMCCD) الكاميرا، ويجعل من الممكن للحد من photobleaching من خلال تقصير فترة التعرض وإضعاف شدة الضوء تستخدم لإثارة fluorophore. سبب آخر لهذا الأثر هو ط الانجرافن مستوى تركيز المجهر الخفيفة. الانجراف التركيز أثناء جلسة التصوير يمكن أن يكون سبب التأثيرات الميكانيكية أو الحرارية، وسوف يؤدي خطأ إلى تغير في كثافة مضان قياسها.
نحن هنا تصف البروتوكولات والمعدات التي تجعل من الممكن استخدام الأصباغ FM لتحليل إعادة تدوير حويصلة متشابك حتى في سياق التحفيز ضعيفة أو معدومة، على وجه الخصوص، النشاط متشابك مصغرة. وتبين لنا أمثلة من تلطيخ وdestaining من الحويصلات متشابك خلال الأحداث منبهات المسموعة وعفوية، وذلك باستخدام الخلايا العصبية مثقف القوارض الحصين، والتصوير المرحلة destaining. علينا أن نبرهن أيضا كيفية تقييم درجة FM صبغ photobleaching من، في غياب أي خسارة FM صبغ بسبب أنشطة متشابك.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفناها بروتوكولات لتلطيخ وdestaining الحويصلات متشابك استجابة للأثار، والنشاط متشابك عفوية ومصغرة، وللتصوير خلال المرحلة destaining. بالإضافة إلى البروتوكولات القائمة، أدرجنا بروتوكول جديد لمراقبة destaining FM على أساس النشاط متشابك مصغرة. باستخدام هذه البروتوكولات، حددنا سا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين أشكر أعضاء المختبر Harata لإجراء مناقشات مفيدة في جميع أنحاء تنفيذ هذا العمل. وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من جمعية القلب الأمريكية، ومؤسسة البحوث الطبية خلل التوتر، وإدوارد مالينكرودت، ومؤسسة الابن، المؤسسة الوطنية للعلوم، ومؤسسة وايت هول لNCH
Materials
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Isolated stimulator | Digitimer | DS3 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | This is used for assessing the cell morphology at low magnification. |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TiE | This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift. |
| Objective lens | Nikon | Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm). | |
| Filter cube | Nikon | 77032509 | 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43 |
| Filter cube | Nikon | 77032809 | 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64. |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon EM+ DU-860 | This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence. |
| Liquid recirculating chiller | Solid State Cooling Systems | Oasis 160 | This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise. |
| LED | CoolLED-Custom Interconnect | 490 nm | This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation. |
| Image acquisition software | Andor Technology | Solis | |
| Imaging chamber | Warner Instruments | RC-21BRFS | |
| Fast perfusion system | Warner Instruments | SF-77B | |
| CNQX | Tocris Bioscience | 1045 | |
| D,L-AP5 | Tocris Bioscience | 0106 | |
| Tetrodotoxin | Tocris Bioscience | 1069 | Caution: toxic reagent. Handle with care. |
| FM1-43 | Invitrogen | T35356 | |
| Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) | Invitrogen | F35355 | |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | |
| Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) | Invitrogen | F34653 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Hanks’ balanced salt | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 51200-038 | This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging. |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Caution: toxic reagent. Handle with care. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1, 2916-2921 (2006).
- Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. . Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. , 77-83 (2012).
- Newton, J., Murthy, V. Measuring exocytosis in neurons using FM labeling. J. Vis. Exp. , (2006).
- Evans, G. J., Cousin, M. A. Simultaneous monitoring of three key neuronal functions in primary neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 160, 197-205 (2007).
- Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. 2, (2008).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. J. Neurosci. Methods. 185, 76-81 (2009).
- Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM dyes. J. Vis. Exp. , (2011).
- Welzel, O., Tischbirek, C. H., Kornhuber, J., Groemer, T. W. Pool-independent labelling of synaptic vesicle exocytosis with single vesicle resolution in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 205, 258-264 (2012).
- Winterer, J., Stanton, P. K., Muller, W. Direct monitoring of vesicular release and uptake in brain slices by multiphoton excitation of the styryl FM 1-43. Biotechniques. 40, 343-351 (2006).
- Kay, A. R. Imaging FM dyes in brain slices. Cold Spring Harb. Protoc. , (2007).
- Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol. Biol. 440, 349-369 (2008).
- Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol. Biol. 689, 137-148 (2011).
- Guatimosim, C., von Gersdorff, H. Optical monitoring of synaptic vesicle trafficking in ribbon synapses. Neurochem. Int. 41, 307-312 (2002).
- Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J. Vis. Exp. , 1305 (2009).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
- Sara, Y., Virmani, T., Deak, F., Liu, X. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
- Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nat. Neurosci. 13, 1454-1456 (2010).
- Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
- Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
- Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 12893-12900 (1999).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Nosyreva, E., Kavalali, E. T. Activity-dependent augmentation of spontaneous neurotransmission during endoplasmic reticulum stress. J. Neurosci. 30, 7358-7368 (2010).
- Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14, 983-989 (1995).
- Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5567-5571 (1996).
- Harata, N., et al. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends Neurosci. 24, 637-643 (2001).
- Klingauf, J., Kavalali, E. T., Tsien, R. W. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses. Nature. 394, 581-585 (1998).
- Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J. Cell Biol. 168, 929-939 (2005).
- Kay, A. R., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
- Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. An ultrastructural readout of fluorescence recovery after photobleaching using correlative light and electron. 1, 988-994 (2006).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Benz, A. M., Mennerick, S. Presynaptically silent synapses studied with light microscopy. J. Vis. Exp. , (2010).
- Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of synaptic activity in hippocampal slices with FM1-43 enabled by fluorescence quenching. Neuron. 24, 803-808 (1999).
- Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
- Piedras-Renteria, E. S., et al. Presynaptic homeostasis at CNS nerve terminals compensates for lack of a key Ca2+ entry pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3609-3614 (2004).
- Rosenmund, C., Stevens, C. F. Definition of the readily releasable pool of vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 16, 1197-1207 (1996).
- Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Piedras-Renteria, E. S., Tsien, R. W. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 28, 221-231 (2000).
- Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS ONE. 8, (2012).
- Harata, N., Katayama, J., Takeshita, Y., Murai, Y., Akaike, N. Two components of metabotropic glutamate responses in acutely dissociated CA3 pyramidal neurons of the rat. Brain Res. 711, 223-233 (1996).
- Kira, T., Harata, N., Sakata, T., Akaike, N. Kinetics of sevoflurane action on GABA- and glycine-induced currents in acutely dissociated rat hippocampal neurons. Neuroscience. 85, 383-394 (1998).
- Harata, N., Katayama, J., Akaike, N. Excitatory amino acid responses in relay neurons of the rat lateral geniculate nucleus. Neuroscience. 89, 109-125 (1999).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, e2146 (2008).
- Neves, G., Lagnado, L. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells. J. Physiol. 515, 181-202 (1999).
- Mazzone, S. B., et al. Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. J. Physiol. 575, 23-35 (2006).
- Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J. Neurosci. 21, 7013-7025 (2001).
- Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21960-21965 (2009).
- Crumling, M. A., et al. P2X antagonists inhibit styryl dye entry into hair cells. Neuroscience. 161, 1144-1153 (2009).
- Zhu, Y., Stevens, C. F. Probing synaptic vesicle fusion by altering mechanical properties of the neuronal surface membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 18018-18022 (2008).
- Thiagarajan, T. C., Lindskog, M., Tsien, R. W. Adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Neuron. 47, 725-737 (2005).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Li, H., et al. Concurrent imaging of synaptic vesicle recycling and calcium dynamics. Front. Mol. Neurosci. 4, 34 (2011).
- Raingo, J., et al. VAMP4 directs synaptic vesicles to a pool that selectively maintains asynchronous neurotransmission. Nat. Neurosci. 15, 738-745 (2012).
- Martens, H., et al. Unique luminal localization of VGAT-C terminus allows for selective labeling of active cortical GABAergic synapses. J. Neurosci. 28, 13125-13131 (2008).
- Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nat. Neurosci. 13, 1451-1453 (2010).
- Hua, Y., et al. A readily retrievable pool of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 14, 833-839 (2011).
- Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same vesicle. 10, 145-147 (2007).
- Moulder, K. L., et al. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
- Crawford, D. C., Jiang, X., Taylor, A., Moulder, K. L., Mennerick, S. Differential requirement for protein synthesis in presynaptic unmuting and muting in hippocampal glutamate terminals. PLoS ONE. 7, (2012).
- Henkel, A. W., Lubke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1918-1923 (1996).
- Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM 1- 43 photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 12748-12753 (2001).
- Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes. J. Vis. Exp. , (2010).
- Schikorski, T. Monitoring rapid endocytosis in the electron microscope via photoconversion of vesicles fluorescently labeled with FM1-43. Methods Mol. Biol. 657, 329-346 (2010).
- Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. FM dye photoconversion for visualizing synaptic vesicles by electron microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 84-86 (2012).
- Schote, U., Seelig, J. Interaction of the neuronal marker dye FM1-43 with lipid membranes. Thermodynamics and lipid ordering. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 135-146 (1998).
- Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J. Neurochem. 97, 1546-1570 (2006).
